CN114457177A - 一种副猪嗜血杆菌巢式pcr扩增引物组合、试剂盒及应用 - Google Patents

一种副猪嗜血杆菌巢式pcr扩增引物组合、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合、试剂盒及应用，涉及分子生物学技术领域。其包括第一引物对和第二引物对，第一引物对具有如SEQ ID NO.1‑2所示的序列，第二引物对具有如SEQ ID NO.3‑4所示的序列。本发明提供的巢式PCR扩增引物组合可以用于副猪嗜血杆菌的快速检测，具有较好的检测灵敏度和准确度，经验证，本发明提供的扩增引物组合具有较高的扩增灵敏度，比普通PCR扩增的灵敏度高100倍，且该扩增引物的特异性强，重复性好，可以应用于猪场日常检测，为副猪嗜血杆菌的临床诊断提供技术支持。

Description

一种副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合、试剂盒及应用。
背景技术
副猪嗜血杆菌病(Haemophilus parasuis，HPS)又称为多发性浆膜炎、关节炎，致病原为副猪嗜血杆菌，主要危害断奶仔猪和保育猪，是造成养猪场保育猪、仔猪发病率、死亡率增加的主要细菌性疾病，每年所造成的经济损失不可估量。副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道定殖的一种菌群，通常情况下猪群抵抗力较强时副猪嗜血杆菌不会产生致病性，一旦受到多种应激因素影响，猪群抵抗力下降或免疫器功能下降时，该菌就会趁机大量繁殖并产生毒素，使猪出现严重的临床症状。
临床上结合患猪胸膜肺炎、腹膜炎、心包炎、心脏表面有大量的绒毛，可作出初步的诊断。而要确诊还需要借助实验室检测方法。目前主要的检测方法是将病料充分粉碎后，进行涂片染色镜检；或者将采集到的病料进行分离培养，将分离得到的病菌转移到血液琼脂平板上，然后再挑取金黄色葡萄球菌进行垂直划线接种，培养36h后出现典型的卫星现象，即判断病料感染副猪嗜血杆菌。
然而，上述镜检和接种培养方法都存在方法上的繁琐问题，而且容易误诊，所以目前很多对副猪嗜血杆菌的诊断选用分子生物学方法。主要有普通PCR和荧光PCR，而普通PCR由于灵敏度有限因而在临床样本的检测应用中的价值也有限，荧光定量PCR由于易污染、实验成本和对实验场所要求较高等原因不易在基层推广。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合、试剂盒及应用以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合，其包括第一引物对和第二引物对，第一引物对具有如SEQ ID NO.1-2所示的序列，第二引物对具有如SEQ ID NO.3-4所示的序列。
巢式PCR是使用两对PCR引物进行扩增的方法，第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似；而第二对引物即为巢式引物，其结合在第一次PCR产物的内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增片段，该扩增方法可提高普通PCR检测的灵敏度和准确性。
发明人利用NCBI网站下载HPS的16S rRNA基因序列(登录号：FJ667982)，利用Primer 5.0引物设计软件设计出了针对HPS的引物对，经过筛选获得了可以用于巢式PCR扩增的引物组合。其中，第一引物对用于第一次PCR扩增，第二引物对用于巢式PCR扩增。
经验证，本发明提供的扩增引物组合具有较高的扩增灵敏度，比普通PCR扩增的灵敏度高100倍，且该扩增引物的特异性强，重复性好，可以应用于猪场日常检测监测工作，为副猪嗜血杆菌的临床诊断提供技术支持。本发明提供的扩增引物组合具有实验成本低、实验场所要求低的优势。开发巢式PCR扩增引物组合具有良好的检测应用价值。
SEQ ID NO.1：AATTCCACG TGTAGCGGTGA，扩增位置48；
SEQ ID NO.2：GTGGTAAACGCCCCCTTTCA，扩增位置501，第一引物对的扩增片段长度为454bp。
SEQ ID NO.3：AGTGGGATTAGGTAGTTGGT，扩增位置184；
SEQ ID NO.4：CTTCCTCATCACCGAAAGAA，扩增位置400，第二引物对的扩增片段长度为217bp。
上述引物组合物的形态包括不限于冻干粉剂、溶液、悬浮液或乳浊液。
本发明还提供了一种试剂盒，其包括上述副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒还包括PCR反应预混液。
PCR反应预混液含PCR扩增的DNA Taq酶、dNTPs、Mg离子、缓冲液，在一种可选的实施方式中，上述PCR反应预混液选自市售的PCR Mix。
在一种可选的实施方式中，上述试剂盒还包括水，用于溶解和/或稀释引物组合或待测样本。
本发明还提供了一种副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合在制备试剂盒中的应用。上述试剂盒为针对猪细菌性传染病的检测试剂盒。
本发明还提供了一种副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合在制备检测测试样品中副猪嗜血杆菌的试剂盒中的应用。
在一种可选的实施方式中，上述应用针对的对象是死亡的猪或环境样本。
检测对象包括不限于取自死猪的血清、血浆、血液样本、猪舍环境样本。
上述的试剂盒用于：将副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合与待测对象的基因组DNA混合；
通过PCR扩增反应实现副猪嗜血杆菌的检测。
上述PCR扩增反应包括：先以第一引物对对检测对象的基因组DNA进行普通PCR扩增获得扩增产物，然后以扩增产物为模板，用第二引物对进行巢式PCR扩增。
在本发明应用较佳的实施方式中，普通PCR扩增的反应程序为95℃1-5min；95℃30-45s，54.5-57.5℃，35s，70-72℃30s，共30-40个循环；70-72℃1-10min。
在上述PCR扩增反应条件下，可以较好地实现待测样本中DNA的扩增，扩增产物进行电泳条带较为明亮。
在本发明应用较佳的实施方式中，普通PCR扩增的反应程序为95℃1-5min；95℃30-45s，56.5℃，35s，70-72℃30s，共30-40个循环；70-72℃1-10min。
经过筛选，发明人发现，当退火温度为56.5℃时，获得的扩增产物进行电泳条带最为明亮。
在本发明应用较佳的实施方式中，巢式PCR扩增的反应程序为95℃1-5min；95℃30-45s，55.5-58.5℃，35s，70-72℃30s，共30-40个循环；70-72℃1-10min。
在上述退火温度条件下，巢式PCR产物进行电泳后条带较为明亮，便于检测人员直观的获得检测结果。
在本发明应用较佳的实施方式中，巢式PCR扩增的反应程序为95℃1-5min；95℃30-45s，57.5℃，35s，70-72℃30s，共30-40个循环；70-72℃1-10min。
经过筛选，发明人发现，当退火温度为57.5℃时，获得的巢式PCR扩增产物进行电泳条带最为明亮。
在本发明应用较佳的实施方式中，检测方法还包括对巢式PCR扩增后的产物进行电泳和/或测序从而获得检测结果。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的巢式PCR扩增引物组合可以用于副猪嗜血杆菌的快速检测，具有较好的检测灵敏度和准确度，经验证，本发明提供的扩增引物组合具有较高的扩增灵敏度，比普通PCR扩增的灵敏度高100倍，且该扩增引物的特异性强，重复性好，可以应用于猪场日常检测监测工作，为副猪嗜血杆菌的临床诊断提供技术支持。开发巢式PCR扩增引物组合具有良好的检测应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为副猪嗜血杆菌普通PCR扩增图片；
图2为副猪嗜血杆菌的对照引物巢式PCR扩增图片；
图3为副猪嗜血杆菌的实验组引物巢式PCR扩增图片；
图4为副猪嗜血杆菌普通PCR灵敏度验证实验的扩增图片；
图5为副猪嗜血杆菌巢式PCR灵敏度验证实验的扩增图片；
图6为副猪嗜血杆菌巢式PCR特异性实验的扩增图片；
图7为副猪嗜血杆菌巢式PCR重复性验证扩增图片。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种副猪嗜血杆菌的扩增引物组合，其包括第一引物对和第二引物对。第一引物对的引物名称分别为P1:HPS-F和P2:HPS-R，序列参照表1所示。
第二引物对的引物名称分别为P5:HPS-F和P6:HPS-R，序列参照表1所示。
利用NCBI网站下载HPS的16S rRNA基因序列(登录号：FJ667982)，利用Primer 5.0引物设计软件设计出了针对HPS的引物对，P5、P6是在P1、P2扩增片段内设计的引物，然后通过筛选用于巢式PCR扩增，引物序列及扩增目的片段的大小见表1。引物序列由上海生工合成。
表1副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物序列
Figure BDA0003572313060000061
对比例1
利用NCBI网站下载HPS的16S rRNA基因序列(登录号：FJ667982)，利用Primer 5.0引物设计软件设计出了针对HPS的引物对，P3、P4是在P1、P2扩增片段内设计的引物，然后通过筛选用于巢式PCR扩增，引物序列及扩增目的片段的大小见表1。引物序列由上海生工合成。
实验例1
本实验例探究最佳的普通PCR扩增条件。具体采用实施例1提供的扩增引物组合进行普通PCR扩增。
(1)菌种复苏
选用LB培养基，加入50mL/L犊牛血清和40mg/kg的NAD，然后用灭菌棉签接种实验室保留的副猪嗜血杆菌并做好标记，置于37℃培养箱中培养24h后放4℃冰箱保存备用。
(2)普通PCR扩增
根据天根DP302细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书步骤，提取的副猪嗜血杆菌基因组放于4℃备用。利用表1的P1和P2引物进行普通PCR扩增，扩增反应体系为：2×HiFiTaq高保真预混PCR反应12.5μL，P1和P2引物游引物(25pmol/L)各1.0μL，DNA模板为2ul，最后用ddH2O补至25μL。PCR反应程序：95℃5min；95℃45s，退火温度(设置多个实验组，分别为53.5℃、54.5、55.5℃、56.5℃、57.5℃、58.5℃)，35s，72℃30s，共35个循环；72℃10min。PCR结束后，取5μL PCR扩增产物于2％琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
扩增结果见图1(M：Marker；1：阴性对照；2-7：53.5℃、54.5、55.5℃、56.5℃、57.5℃、58.5℃扩增结果)，结果显示，阴性对照均无条带扩增出，而退火温度为54.5、55.5℃、56.5℃、57.5℃、58.5℃时，都能扩增出目的片段454bp，尤其以56.5℃的扩增泳道条带最亮。实验结果说明该引物能用于普通PCR扩增，以56.5℃的退火温度扩增最佳。
实验例2
本实验例探究最佳的巢式PCR扩增条件和巢式PCR扩增引物对。具体采用实施例1提供的第二引物对和对比例提供的巢式引物分别进行巢式PCR扩增。
选取实验例1中普通PCR扩增的产物作为第二次扩增的模板，分别选用P3、P4引物对和P5、P6引物对进行第二次扩增筛选(巢式PCR)。扩增反应体系为：2×HiFiTaq高保真预混PCR反应12.5μL，P3、P4引物对和P5、P6引物对上、下游引物(25pmol/L)各1.0μL，以首次普通PCR步骤扩增的产物为模板4ul，最后用ddH2O补至25μL。PCR反应程序：95℃5min；95℃45s，退火温度(分别为54.5、55.5℃、56.5℃、57.5℃、58.5℃)，35s，72℃30s，共35个循环；72℃10min。PCR结束后，取5uL PCR扩增产物于2％琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，扩增结果见图2、图3。
从图2可以看出(M：Marker；1：阴性对照；2-6：P3、P4引物对退火温度为54.5、55.5℃、56.5℃、57.5℃、58.5℃扩增结果)，阴性对照无条带扩增，引物对P3、P4扩增的产物没有清晰的目的片段，说明引物对P3、P4的扩增产物无目的片段扩增，说明该引物对不适用于副猪嗜血杆菌巢式PCR的扩增。
图3所示(M：Marker；1：阴性对照；2-6：P5、P6引物对退火温度为54.5、55.5℃、56.5℃、57.5℃、58.5℃扩增结果)，引物对P5、P6的扩增产物有目的片段扩增出，217bp，说明引物对P5、P6适用于副猪嗜血杆菌巢式PCR的扩增，且最适宜的扩增温度为57.5℃。
实验例3
本实验例探究巢式PCR扩增的灵敏度。具体采用实施例1提供的扩增引物组合进行巢式PCR。
利用紫外分光光度计对普通PCR提取的副猪嗜血杆菌基因组的浓度进行测定，浓度为328ng/uL；灭菌蒸馏水分别作10倍递减稀释至10-8，以此作为模板，按实验例1和实验例2中最适宜的扩增温度进行扩增，检测其敏感性。
普通PCR扩增的结果见图4(M：Marker；1：阴性对照；2-9普通PCR法扩增DNA模板稀释度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的扩增结果)，DNA稀释到10-4倍能见到清晰的条带，即检测下限为32.8pg/uL。
而巢式PCR扩增的结果见图5(M：Marker；1：阴性对照；2-9：巢式PCR法扩增DNA模板稀释度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的扩增结果)，当DNA稀释到10-6倍能见到清晰的条带，即检测下限为0.328pg/uL；敏感度比普通PCR方法提高了100倍。
实验例4
本实验例探究巢式PCR扩增引物组合的特异性。具体采用实施例1提供的扩增引物组合进行巢式PCR。
分别取实验室自留的葡萄球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、链球菌，利用天根DP302细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取，提取好的DNA模板利用实验例1和2建立好的巢式PCR方法进行扩增，扩增结果见图6(M：Marker；1：阴性对照；2-7：巢式PCR法扩增副猪嗜血杆菌、葡萄球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、链球菌的扩增结果)。
结果显示，除了副猪嗜血杆菌能扩增出目的片段，葡萄球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、链球菌的电泳泳道均无条带扩增出。表明本发明提供的引物组合特异性良好。
实验例5
本实验例探究巢式PCR扩增引物组合的重复性。具体采用实施例1提供的扩增引物组合进行巢式PCR。
利用建立好的巢式PCR，对实验室保存的5份副猪嗜血杆菌阳性的样品进行扩增，扩增结果5份阳性样品检测结果均为阳性(见图7)。
图7(M：Marker；1：阴性对照；2-6：5份副猪嗜血杆菌阳性样品的扩增结果)结果说明，本发明提供的方法具有良好的稳定性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 贵州傲农七环畜牧养殖有限公司
漳浦县赵木兰养殖有限公司
南宁傲农育种技术有限公司
福建傲农生物科技集团股份有限公司
<120> 一种副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合、试剂盒及应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<213> 人工序列
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aattccacgt gtagcggtga 20
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<400> 3
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cttcctcatc accgaaagaa 20

Claims (10)

1.一种副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合，其特征在于，其包括第一引物对和第二引物对，所述第一引物对具有如SEQ ID NO.1-2所示的序列，所述第二引物对具有如SEQ IDNO.3-4所示的序列。
2.一种试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应预混液。
4.一种如权利要求1所述的副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合在制备试剂盒中的应用。
5.一种如权利要求1所述的副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合在制备检测测试样品中副猪嗜血杆菌的试剂盒中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂盒用于：将权利要求1所述的副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合与待测对象的基因组DNA混合；
通过PCR扩增反应实现副猪嗜血杆菌的检测。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增反应包括：
先以第一引物对对检测对象的基因组DNA进行普通PCR扩增获得扩增产物，然后以所述扩增产物为模板，用第二引物对进行巢式PCR扩增。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述普通PCR扩增的反应程序为95℃1-5min；95℃30-45s，54.5-57.5℃，35s，70-72℃30s，共30-40个循环；70-72℃1-10min；
优选地，所述普通PCR扩增的反应程序为95℃1-5min；95℃30-45s，56.5℃，35s，70-72℃30s，共30-40个循环；70-72℃1-10min。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述巢式PCR扩增的反应程序为95℃1-5min；95℃30-45s，55.5-58.5℃，35s，70-72℃30s，共30-40个循环；70-72℃1-10min；
优选地，所述巢式PCR扩增的反应程序为95℃1-5min；95℃30-45s，57.5℃，35s，70-72℃30s，共30-40个循环；70-72℃1-10min。
10.根据权利要求5-9任一项所述的应用，其特征在于，所述应用还包括对巢式PCR扩增后的产物进行电泳和/或测序。
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