CN102453762A

CN102453762A - 检测猪增生性肠病病原菌胞内劳森菌的试剂盒和方法

Info

Publication number: CN102453762A
Application number: CN2010106176004A
Authority: CN
Inventors: 陈世界; 严玉宝; 余华; 田绿波; 胡娟; 杨苗; 郭杨
Original assignee: SICHUAN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PRC
Current assignee: SICHUAN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PRC
Priority date: 2010-12-31
Filing date: 2010-12-31
Publication date: 2012-05-16
Anticipated expiration: 2030-12-31
Also published as: CN102453762B

Abstract

本发明属于牲畜传染病病原检验检疫领域，具体涉及一种劳森胞内菌的检测试剂盒和检测方法。本发明为了解决上述技术问题所采用的技术方案是提供一种检测猪增生性肠病病原劳森胞内菌的试剂盒，包括从提取的样品DNA中扩增待测样品DNA片段的引物对。本发明经过充分的试验筛选和优化，独创引物探针、反应条件、阳性对照及最佳配合条件，从而建立了一种快速可靠荧光定量PCR检测猪增生性肠病的方法。实现了对DNA模板的定量，灵敏度高、特异性和可靠性更强、克服可能的假阳性、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，能在猪增生性肠病健康带毒感染、发病猪早期快速确诊和实时监测等方面发挥重要的作用。

Description

检测猪增生性肠病病原菌胞内劳森菌的试剂盒和方法

技术领域

本发明属于牲畜传染病病原检验检疫领域，具体涉及一种胞内劳森菌的检测试剂盒和检测方法

背景技术

猪增生性肠病(Porcine Proliferative Enteropathy，PPE)，又称猪增生性肠炎(PorcineProliferative Enteritis)、猪回肠炎(Porcine Ileitis)、猪增生性肠道病(Porcine BowlDisease)、猪肠腺瘤样病(Porcine Intestinal Adenomatosis)、猪增生性出血性肠炎(Porcine Proliferate Haemorrhage Enteritis，PHE)等^[1-4]，但目前普遍称之为猪增生性肠病。该病病原是一种专性胞内寄生细菌，称之为胞内劳森菌(Lawsona Intracellularis，LI)，也有学者称为胞内罗索尼菌^[6]，Gebhart等认为其属于解硫弧菌属(DeSulfovibrionaceae)^[4]。

胞内劳森菌主要寄生在病猪肠粘膜细胞内，多呈弯曲形、豆点形、s形或直的杆菌，能被LevaditiSilver或Warthin-Starry镀银染色法着色，用Modifled Ziehl-Neelsen染色法细菌被染成红色^[7-10]。在感染动物中，胞内劳森菌主要存在于肠细胞的原生质内，也可见于粪便中^[7，8]。该病是猪的一种接触性肠道传染病，是由于大量胞内劳森菌定居于未成熟的肠上皮细胞中，导致细胞大量增生^[11]。Guedes等研究显示，急性感染母猪血清抗体可持续12周，亚临床感染育肥猪血清抗体可持续2～3周^[13]。1931年美国首次报道该病，至今已呈全球性流行^[4，12]。世界许多国家和地区，如澳大利亚、墨西哥、加拿大、意大利、丹麦、比利时、巴西、阿根廷、韩国、我国台湾省等均有发病报道^[1，4-6]。虽然猪增生性肠病死亡率不高，但因严重影响病猪生长，延长上市时间，是一种具有重要经济意义的世界性疾病。我国也已证明有该病存在^[5]。

由于该细菌在培养基培养未获成功，也不适应鸡胚生长_[5]，细胞培养分离鉴定繁琐耗时。相继建立的IFA、IPMA、PCR和荧光杂交组化试验等^[14-19]诊断方法均存在一些弊端，特异性和灵敏度等均不能满足检测的需要，费时易污染。如：IFA与IPMA特异性相似，这二种方法不易区别细菌抗原类型，多适用于确定病性。PCR虽特异性高，但敏感性差异很大，PCR不能检出隐性感染猪或病原携带猪粪便中的细菌，存在假阳性较多等特点，且PCR用于大规模检测时，后续的电泳很麻烦，不利于高通量快速检测。另外，因为本病在西方国家中广泛流行，在进口生猪及猪制品的检疫中需要提供有效的检测手段，避免引进该病或该病新的病原，维护国家利益。因而在目前在进出口检验检疫领域中需要有一种快速可靠的，高灵敏度，高特异性的检测胞内劳森菌的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种快速可靠检测胞内劳森菌的技术。本发明为了解决上述技术问题所技术方案是提供一种检测猪增生性肠病病原菌胞内劳森菌的试剂盒。该试剂盒是一种PCR试剂盒，包括从提取的样品DNA中PCR(聚合酶链式反应)扩增待测样品DNA片段的引物对：

上游引物(SEQ ID No.1)：5’GAGCACGATTACAAATTGCTTCA3’；

下游引物(SEQ ID No.2)：5’TGCTATCTCTGCTGCATGTAATGA3’。

进一步的，上述检测猪增生性肠病病原菌胞内劳森菌的试剂盒中还包括荧光定量PCR引物探针，该荧光定量PCR引物探针的核苷酸序列为：5’-TCCCTGCACCTCCTTGAATAC AATCCACA-3’(SEQ ID No.3)，并在其5’端用6-FAM(6-Carboxyfluorescein，5-羧基荧光素)标记，3’端用6-TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明，6-Carboxytetramethylrhodamine)标记。可以使用该试剂盒对待测对象的DNA样本进行荧光定量PCR检验，确定其是否含有胞内劳森菌。

其中，上述的检测猪增生性肠病病原菌胞内劳森菌的试剂盒中还均含有阳性标准品。该阳性标准品即为扩增待测样品DNA片段的引物对所能扩增出的胞内劳森菌DNA片段(SEQ IDNo.4)：

GAGCACGATTACAAATTGCTTCATTAGCATTCATATTTGTACTTGTCCCTGCACCTCCTTGAATACAATCCACAACAAATTGATCAAGGAGTTCTCCATTTATGATTTCATTACATGCAGCAGAGATAGCA。

本发明还提供了一种检测猪增生性肠病病原菌胞内劳森菌的方法。该方法包括以下步骤：

a、获取样品总DNA；

b、将已计算出拷贝数的含目的基因的质粒作为标准品进行梯度稀释，采用上、下游引物和荧光定量PCR引物探针在荧光定量PCR仪上进行荧光实时PCR扩增，有扩增曲线的最低稀释梯度的拷贝数为本方法为所能检出的最低模板拷贝数；并以模板拷贝数的对数为X轴，Ct值为Y轴作回归曲线，利用各梯度浓度下的Ct值做出相应的标准曲线：y＝ax+b，其中a为斜率，b为截距；x为Ct值，y为质粒模板的拷贝数；

c、使用上、下游引物、荧光定量PCR引物探针和样品总DNA在荧光定量PCR仪中进行荧光实时PCR扩增，检测是否有目标片段的对应Ct值并通过标准曲线和计算得到样品总DNA中的目标片段的拷贝数。

其中，上述方法中所述的上游引物的序列为：

5’GAGCACGATTACAAATTGCTTCA3’，

所述下游引物的序列为：

5’TGCTATCTCTGCTGCATGTAATGA3’。

其中，上述方法中所述的使用荧光定量PCR引物探针序列为：5’-TCCCTGCACCTCCTTGAATAC AATCCACA-3’，并在5’端用FAM标记，3’端用TAMRA标记。

样品总DNA中的目标片段的拷贝数计算公式即为：y＝ax+b，其中a为标准曲线斜率，b为标准曲线截距；x为测得的Ct值，y为质粒模板的拷贝数；其中a和b每次会根据每次检测的具体试验条件改变而有变动。一般来说标准曲线的相关系数R²应大于0.95，而且步骤b和步骤c反应条件和体系应一致。本发明方法可以在一般的市售荧光定量PCR仪上进行。

其中，上述方法中所述的步骤b和c的荧光实时PCR扩增反应的条件为50℃2min；95℃10min；95℃15s，60℃60s，40个循环。

其中，上述方法中所述的步骤b和c的荧光实时PCR扩增反应的反应体系为：2×TaqMan PCRMaster Mix 12.5ul，上下游引物各0.6μmol/L，荧光定量PCR引物探针0.4μmol/L，样品总DNA 1ul，补灭菌水至总体积25ul，采用ABI公司的7500荧光定量PCR仪进行。

本发明经过充分的试验筛选和优化，独创引物探针、反应条件和阳性对照的最佳配合条件，建立了荧光定量PCR检查猪增生性肠病的方法并提供了相应的试剂盒。实现了对DNA模板的定量，灵敏度高、特异性和可靠性更强，克服可能的假阳性，能实现快速检测、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，能在猪增生性肠病隐性感染、发病猪早期快速确诊和实时监测等方面发挥重要的作用。而基于一般PCR的检测方法因技术本身的缺陷，容易导致实验室污染，从而导致假阳性，灵敏度也远远低于本方法且PCR用于大规模检测时，后续的电泳很麻烦，不利于高通量快速检测。因而在检验检疫及兽医临床中需要有一种快速可靠的，高灵敏度，高特异性的检测方法。本方法最终满足这一现实要求，能够对临床样品进行快速确认。同时因为本病在西方国家中广泛流行，本研究提供的检测方法将为检验检疫机构在进口种猪检疫中提供有效的检测手段，避免引进该病或该病新的病原，维护国家利益。

附图说明

图1目标片段的PCR产物电泳结果。L：分子量对照；1、2：PPE DNA；3、4：无模板对照，NTC，no template control。

图2含目标片段的质粒标准品的动力学曲线，从左到右依次分别为梯度稀释的样品，浓度分别为4.2×10⁹～4.2×10⁰拷贝/ul；质粒标准品；NTC为无模板对照，纵坐标为信号增加值(Delta Rn)。

图3根据标准品的Ct值绘制的标准品曲线。R²＝0.998507，Intercept(截距)＝44.658695，slop(斜率)e＝-3.337，182，图中的横坐标log co为DNA拷贝数的对数(log DNAconcentration)；纵坐标为Ct值(cycle threshold，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)。

图4特异性扩增曲线，横坐标为循环数，纵坐标为信号值。

图5组内重复试验扩增曲线，横坐标为循环数，纵坐标为信号值。图中1：4.2×10⁹拷贝质粒；2：4.2×10⁵拷贝质粒；3：4.2×10²拷贝质粒。

图6临床样本的扩增曲线图，横坐标为循环数，纵坐标为信号值。从左至右的7条曲线代表样本1～7。

图7巢式PCR产物电泳结果；其中1～7泳道为临床样品的DNA。

图8临床样品重复性测定扩增曲线图，横坐标为循环数，纵坐标为信号值。1：临床样品1，2：临床样品2，NTC：无模板对照。

具体实施方式

以下结合附图通过具体实施方式对本发明进行具体说明。

主要仪器和试剂：

2×TaqMan PCR Master Mix(ABI公司)；动物组织及血液的DNA提取试剂盒(QIAGEN公司，千根公司)；7500荧光定量PCR仪(ABI，applied biosystems，美国应用生物系统公司)；水平电泳及凝胶成像分析系统(Bio-Rad公司，美国伯乐公司)；培养箱；低温冰箱；恒温循环水浴槽；高速冷冻离心机；常温离心机；常规PCR扩增仪(美国PE公司)；核酸蛋白分析仪等。

实施例一荧光定量PCR引物与探针的设计与合成

1、荧光定量PCR引物与探针的设计与合成

根据GenBank公布的猪增生性肠病基因序列，选择序列保守区用Primer Express3.0设计一对特异性引物及一条Taqman探针(Taqman-probe)。扩增的目的基因片段长131bp。并在其探针5’端用荧光报告基团6-FAM(6-Carboxyfluorescein，5-羧基荧光素)标记，3’端用荧光报告基团6-TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明，6-Carboxytetramethylrhodamine)标记，可以使用本领域常规的方法和设备进行标记。本实施例中引物和探针均由上海基康生物技术有限公司合成及标记(序列见表1)。

表1引物和TaqMan探针

2、荧光定量PCR引物合理性的验证：

用设计的荧光定量PCR引物进行普通PCR反应，电泳检测反应产物，对引物的可靠性进行验证。该反应体系为：F(10umol/L)1ul，R(10umol/L)1ul，dNTP Mixture(2.5mmol/Leach)2ul，MgCl₂(25mM)1.5ul，10×PCR Buffer 2.5ul，Taq DNA polymerase(5U/ul)0.625U，模板DNA 1ul，添加RNaseFree H₂O至总体积25ul；扩增程序为：95℃4min；然后94℃20s，58℃30s，70℃20s，共30cycles；最后70℃1min；将PCR产物于2％琼脂糖凝胶进行电泳。

荧光定量PCR引物合理性的验证结果：使用本发明的引物从猪劳森氏胞内菌的DNA中扩增出一条约130bp的特异性条带(图1)与预期大小一致。测序结果(如下所示)与猪劳森氏胞内菌(在NCBI上的登录号分别为：EU621798.1，AM180252.1，EU127293.1)相对应的基因序列同源性为99％以上。

扩增的目标序列(131bp)：

实施例二标准样品的制备和鉴定

使用本发明的引物从猪劳森氏胞内菌的DNA中扩增出一条约130bp的特异性条带，按胶回收试剂盒使用说明回收目的片断后克隆到pMD-T Simple载体，再转化DH5α大肠埃希菌，挑取在含氨苄青霉素的选择培养基上长出的白色菌落，37℃培养，抽提质粒，进行PCR快速鉴定，阳性重组质粒纯化后，送上海基康生物工程有限公司测序，序列正确的阳性质粒即为猪增生性肠病(PPE)阳性标准品。用核酸蛋白检测仪检测其在260nm处光密度值，然后根据阿伏伽德罗常数：6.02×10²³转换成拷贝数/μL，-20℃保存备用。

实施例三荧光定量PCR反应条件的优化

采用TaqMan PCR Master Mix(ABI)试剂推荐的25ul体系，以相同浓度阳性质粒为模板，选用不同浓度的引物和探针，采用矩阵法对引物和探针的最佳浓度进行优化，获得反应的最低Ct值和最高荧光强度增加值(ΔRn)，提高反应扩增效率与敏感度，并对循环参数进行优化。

优化后的荧光定量PCR的反应条件：用矩阵法筛选出最佳引物和探针终浓度分别是0.6μmol/L和0.4μmol/L，最佳退火延伸温度为60℃。综上最佳反应体系为：2×TaqMan PCRMaster Mix 12.5ul，上下游引物各0.6μmol/L，探针0.4μmol/L，模板1ul，补灭菌水至总体积25ul；最佳循环条件为：50℃2min(激活UNG酶)；95℃10min(灭活UNG酶，激活Taq聚合酶)；95℃15s，60℃60s，40个循环。

实施例四荧光定量PCR的灵敏度及标准曲线的生成

将已计算出拷贝数的含目的基因的质粒做10倍梯度稀释，稀释至用荧光定量PCR仪不能检出，以此计算出荧光定量PCR所能检出的最低模板拷贝数，并做出相应的标准曲线。

经测定OD₂₆₀nm和计算，提取质粒浓度大约是4.2×10¹⁰拷贝/ul。将标准品10倍梯度稀释，取1uL用优化好的Taqman-PCR反应条件进行荧光PCR扩增。如图2所示，从左向右模板依次为：4.2×10⁹拷贝/ul至4.2×10⁰拷贝/ul共10个梯度，4.2×10¹拷贝/ul仍有荧光曲线。表明在荧光定量PCR仪上所能检出的最低拷贝数为4.2×10¹拷贝/μL。10个倍次梯度稀释的标准品Ct值分别为：12.7l，15.69，19.18，22.82，26.10，28.40，32.68，36.24，39.22。以起始模板数的对数为X轴，Ct值为Y轴作回归曲线，建立相应的标准曲线(图3)；其中斜率：-3.337182，截距：44.658695，相关系数R²＝0.998507，方程为：y＝-3.337182x+44.658695。(y：循环阈值Ct值，x：质粒模板的拷贝数)。

实施例五荧光定量PCR的特异性检验和重复性检验

1、荧光定量PCR的特异性检验

用建立的Taqman-PCR方法分别对猪蓝耳病毒，猪口蹄疫病毒，猪瘟病毒，猪伪狂犬病毒，猪圆环病毒及PPE阳性组织病料的核酸进行检测，同时设立用灭菌水代替核酸的1个阴性对照(NTC)。当阴性对照为阴性时整个试验有效，可进一步判定结果。

荧光定量PCR对核酸的检测结果如图4，非靶模板及阴性对照均无扩增曲线，1个PPE阳性样品的DNA出现特异性的扩增曲线，表明本方法具有良好的检测特异性。

2、荧光定量PCR的重复性检验

2.1组内重复性

在同一时间，同一反应条件下将3个不同稀释度的质粒标准品各进行4次重复检测，比较用Taqman-PCR检测各浓度标准品的扩增结果，和同一浓度Ct值的变异情况，测定组内变异系数。检测结果见表2和图5。

表2组内重复试验结果

2.2组间重复性检验：

在不同的时间，同一反应条件下将3个不同稀释度的质粒标准品用荧光定量PCR，分6个不同时间检测，每次间隔7天，检测结果见表3。从表中可以得知，Taqman-PCR组内和组间的CV值均小于2％，说明该方法的重复性很好。

表3组间重复试验结果

实施例六使用本发明方法对组织样品进行实际检测：

1、荧光定量PCR检测组织样品：对送检的7份组织病料进行处理，提取病料的DNA(QIAGEN公司DNA提取试剂盒)，提取的DNA于-20℃保存备用。用本发明建立的Taqman-PCR方法检测。

2、用巢式PCR检测组织样品做对比：巢式PCR所用引物(见表4)(引物及方法参见Journalof Wildlife Diseases，39(2)，2003，pp.407-411)。其反应条件为：94℃，3min，预变性；94℃40s，55℃40s，72℃40s，共35个循环。比较这两种方法对组织病料的检测结果。

表4检测PPE的巢式PCR引物序列

3、组织样品的检测结果及比较：

将送检的7份经临床诊断为猪增生性肠病的猪的组织病料处理后提取DNA，分别用Taqman-PCR和巢式PCR检测。比较两者检测的结果，发现在7份组织病料中，Taqman-PCR检出7份病料均为阳性(图6)，其中3份病料的病原菌含量较高，对应的Ct值分别为：22.44，21.98，24.38，对应的病原菌含量分别为：2×10⁶拷贝/ul，2.73×10⁶拷贝/ul，547971.50拷贝/ul，这3份巢式PCR也检出(见图7)；另4份病料荧光定量PCR检出，但病料的病原菌含量较低，其对应的Ct值分别为：29.39，27.45，28.17，32.16，巢式PCR未能检出，这表明Taqman-PCR的敏感性明显高于巢式PCR。将这7个组织病料结合染色镜检，检测结果仍然为阳性。这也表明了该方法与染色镜检的结果高度相符。

4、组织样品的重复检测

在同一时间，同一反应条件下将不同浓度的2个PPE临床组织样品的DNA，进行重复检测。结果见表5和图8，重复试验的变异系数CV值小于5％，说明该方法的重复性很好。

表5组织样品的重复试验结果

5、进一步的准确率验证

后续研究中，又将用本发明方法检测经过临床典型症状诊断结合染色镜检诊断确认的20个PPE阳性猪回肠样品，10个可疑病猪回肠样品和10个健康猪回肠样品，阳性样品100％检出猪劳森氏胞内菌，可疑样品80％检出猪劳森氏胞内菌，健康猪样品未检测出。

猪增生性肠病是一种近年来在国内才有所报道的新的猪病，是一种在细胞内繁殖的细菌，用普通的细菌培养方法难以进行分离鉴定，目前也没有商品化的试剂可供选择。建立快速、特异、敏感的猪增生性肠病病原诊断方法，是临床诊断和防疫检疫的迫切要求。

本发明通过对公布的猪增生性肠病全基因组序列的分析，设计了一对引物和Taqman探针(荧光定量PCR引物探针)，特异性地检测样品中是否有猪增生性肠病(猪劳森氏胞内菌)的感染。扩增片段的测序结果与GenBank中猪增生性肠病相对应的基因片段序列的同源性为99％。

经实验验证本方法只能从含有猪增生性肠病的样本中检测出特异性扩增荧光信号，充分证明了其检测的高度特异性。用实时荧光定量PCR检测猪增生性肠病重组质粒标准品，在标准品DNA为4.2×10⁹to 4.2×10¹拷贝/ul时线性关系良好，最小可检出4.2×10¹拷贝，且从样本核酸提取到报告结果全程仅需3h。应用此方法对送检的组织病料检测，其结果与巢式PCR检测结果完全一致；而巢式PCR虽然能检测病原体，诊断PPE，但不能定量，且准确率不够高。本发明建立的荧光定量PCR检测方法灵敏度比巢式PCR高，且检测的特异性有探针和引物双重保证。因此具有比巢式PCR更高的特异性，优于现在已有的猪增生性肠病检测方法。

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Claims

1.检测猪增生性肠病病原菌胞内劳森菌的试剂盒，其特征在于：包括从提取的样品DNA中扩增待测样品DNA片段的引物对：

上游引物：5’GAGCACGATTACAAATTGCTTCA3’；

下游引物：5’TGCTATCTCTGCTGCATGTAATGA3’。

2.根据权利要求1所述的检测猪增生性肠病病原菌胞内劳森菌的试剂盒，其特征在于：还包括荧光定量PCR引物探针，该荧光定量PCR引物探针的核苷酸序列为：5’-TCCCTGCACCTCCTTGAATAC AATCCACA-3’，

3.根据权利要求2所述的检测猪增生性肠病病原菌胞内劳森菌的试剂盒，其特征在于：所述荧光定量PCR引物探针5’端用6-羧基荧光素标记，3’端用6-羧基四甲基罗丹明标记。

4.根据权利要求2所述的检测猪增生性肠病病原菌胞内劳森菌的试剂盒，其特征在于：还含有阳性标准品

5.检测猪增生性肠病病原菌胞内劳森菌的方法：其特征在于：该方法包括以下步骤：

a、获取样品总DNA；

c、使用上、下游引物、荧光定量PCR引物探针和样品总DNA在荧光定量PCR仪中进行荧光实时PCR扩增，检测是否有目标片段的对应Ct值并通过标准曲线和反应循环数计算得到样品总DNA中的目标片段的拷贝数；

所述上游引物的序列为：5’GAGCACGATTACAAATTGCTTCA3’，所述下游引物的序列为：5’TGCTATCTCTGCTGCATGTAATGA3’；

所述荧光定量PCR引物探针的序列为：5’-TCCCTGCACCTCCTTGAATAC AATCCACA-3’，并在其5’端用6-羧基荧光素标记，3’端用6-羧基四甲基罗丹明标记。

6.根据权利要求5所述的检测猪增生性肠病病原菌胞内劳森菌的方法：其特征在于所述步骤b和c的荧光实时PCR扩增反应的条件为50℃2min；95℃10min；95℃15s，60℃60s，40个循环。

7.根据权利要求6所述的检测猪增生性肠病病原菌胞内劳森菌的方法：其特征在于所述步骤b和c的荧光实时PCR扩增反应的反应体系为：2×TaqMan PCR Master Mix 12.5ul，上下游引物各0.6μmol/L，荧光定量PCR引物探针0.4μmol/L，样品总DNA 1ul，补灭菌水至总体积25ul。