CN112940089A

CN112940089A - 胞内劳森菌flgE重组蛋白及胞内劳森菌抗体检测试剂盒

Info

Publication number: CN112940089A
Application number: CN202110135312.3A
Authority: CN
Inventors: 余兴龙; 廖荣莉; 郑金; 赵墩
Original assignee: Hunan Combetter Biotechnology Co ltd; Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Combetter Biotechnology Co ltd; Hunan Agricultural University
Priority date: 2021-01-27
Filing date: 2021-02-01
Publication date: 2021-06-11
Anticipated expiration: 2041-02-01
Also published as: CN112940089B

Abstract

一种胞内劳森菌flgE重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。利用该胞内劳森菌flgE重组蛋白制备的试剂盒，特异性高、灵敏度和重复性好，可用于检测胞内劳森菌抗体，于早期发现猪群的感染，检测速度快，能用于猪群LI感染状态的评估，便于指导该菌感染的保护防控。

Description

胞内劳森菌flgE重组蛋白及胞内劳森菌抗体检测试剂盒

技术领域

本发明属于兽医生物技术领域，涉及胞内劳森菌flgE重组蛋白，同时还涉及利用该flgE重组蛋白为抗原，建立检测胞内劳森菌抗体的间接ELISA(flgE-ELISA)方法的试剂盒，用于胞内劳森菌flgE蛋白抗体检测，以此判断猪群中胞内劳森菌的感染情况以及对该病的流行情况进行监测。

背景技术

猪增生性肠炎(Porcine proliferative enteropathy，PPE)是由胞内劳森菌(Lawsoniaintracellularis，LI)引起猪的肠上皮细胞增生并导致肠黏膜增厚为主要特征的传染性肠道疾病，该病是集约化养殖场常见疾病之一，对养猪业的危害除偶尔会引起中大猪的急性死亡外，更主要的危害是猪群体中广泛存在的LI慢性感染严重影响了饲料报酬率，给全球养殖业造成了重大的经济损失。自饲料生产企业停止生产含有促生长抗菌类药物的饲料后，根据临床观察发现由LI引起的腹泻明显增多，给养猪业带来了较大的经济损失。

目前国内对该病进行的实验室诊断多是通过PCR或者商品化试剂盒对粪便中的病原菌进行检测，但这些方法仅在检测处于排毒期的猪粪便时才呈阳性，其检测结果一般偏低。若要准确地反映猪群中LI的感染率，LI抗体的检测必不可少。ELISA可以在很短时间内处理大量样本，适合于对群体大规模的感染性调查。国内虽有多个研究表明基于LI重组外膜或表面蛋白建立的ELISA抗体检测方法具有较好的特异性和敏感性，但目前国内尚无成熟的商品化LI抗体检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提供一种胞内劳森菌flgE重组蛋白及胞内劳森菌抗体的检测试剂盒，以胞内劳森菌flgE重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA方法，可作为监测LI在猪群中的流行情况和评估感染的一种储备技术。

为达上述目的，本发明通过对LI全序列进行生物信息学分析，挑选LI所有的表面蛋白(共34个)进行克隆表达，根据各蛋白与LI阳性血清反应程度、LI阳性血清检出率及LI阴性血清本底低等初步试验，筛选得到一个较优蛋白flgE。胞内劳森菌flgE重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码胞内劳森菌flgE重组蛋白的基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

本发明的胞内劳森菌flgE重组蛋白的制备过程为：(1)构建包含有编码胞内劳森菌flgE重组蛋白的基因片段的重组表达质粒pET28a-flgE；(2)重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，诱导表达，纯化重组目的蛋白。

本发明还提供一种检测胞内劳森菌抗体的试剂盒及该试剂盒对临床血清的应用，所述试剂盒包括用上述胞内劳森菌flgE重组蛋白包被的EILSA板、稀释液、封闭液、洗涤液、酶标羊抗猪抗体、底物显色液及终止液。

本发明的有益效果：(1)本方法用重组的胞内劳森菌的优势抗原蛋白研究而成，可用于猪群LI感染状态的评估，便于指导该菌感染的保护防控；(2)该方法可用于感染康复猪群或隐性感染猪群的免疫保护水平评估(注：猪只感染LI康复后具有坚强的免疫保护力)；(3)本方法敏感性高，在猪只感染LI半个月即可检测到抗体，可用于早期发现猪群的感染，时间不晚于目前唯一得到公认的瑞典Savnova公司的抗体检测试剂盒；(4)用于评估猪群的感染，比从粪便中检测病原的优势明显；(5)本方法检测快速，3个小时即可获得检测结果，便于半个工作日(上午或下午)内的工作安排，可保证工作人员按时下班休息；(6)对阴性血清的检测假阳性低，本方法特异性高，特异性可高达92％。

附图说明

图1是本发明flgE重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达及蛋白纯化SDS-PAGE分析电泳图。

图中：M-蛋白质分子量标准，1-诱导菌裂解后上清，2-诱导菌裂解后沉淀，3-可溶性flgE蛋白纯化后样品。

具体实施方式

实施例1胞内劳森菌flgE重组蛋白的制备

根据GenBank中LI全基因序列(登录号：NC_008011.1和CP004029.1)中鞭毛钩基体复合蛋白flgE的基因序列，采用PrimerSelect设计引物，在上下游引物5'添加对应的酶切位点EcoRⅠ、SalⅠ及保护性碱基，上游引物fP：5'-CCGGAATTCATGAGTCTTACAGCAGGAATG-3'(EcoR Ⅰ)(SEQ ID NO.3)；下游引物rP：5'-ACGCGTCGACACGCTTCATATTTACAACTGT-3'(SalⅠ)(SEQ ID NO.4)。

按细菌DNA提取试剂盒说明书提取LI感染猪粪便中的DNA，以此为模板，采用

HS DNA Polymerase体系进行PCR扩增(PCR扩增体系为：

HSDNA Polymerase:1μL；dNTP:4μL；Buffer:10μL；dH₂0:29μL；模板：2μL；上、下游引物各2μL。PCR扩增条件为：预变性98℃2min；变性：98℃10s；退火：55℃15s；延伸：68℃4min；总延伸：68℃10min；循环数为35个循环)。扩增产物经琼脂糖电泳鉴定显示，扩增出长度为2070bp左右的特异性条带。

将PCR产物纯化后连接至pET-28a(+)载体(购自Novagen公司，产品编号：69015-3)中，连接产物转化至BL21(DE3)感受态细胞中构建重组表达质粒pET28a-flgE，次日挑取转化子利用pET-28a(+)载体上自带的T7通用引物进行PCR鉴定，将PCR鉴定为阳性的转化子接种于10mL LB中，37℃过夜培养，次日提取质粒送擎科生物公司进行测序，测序结果显示，目的基因序列与GenBank中登录的flgE基因序列(NC_008011.1)同源性为100％，说明重组表达质粒pET28a-flgE构建正确。

将经测序鉴定的阳性菌落接种于含有50μg/mL卡那霉素的200mL LB培养基中，37℃、180r/min培养至OD_600nm值约为0.6时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃诱导5h，6000r/min离心5min，收集菌体(按20倍浓缩)，超声波破碎菌体，离心后分别收集破碎后菌体上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳鉴定，该蛋白主要以可溶性形式表达，见图1。用Ni+亲和层析法(Novagen公司His-Bind Kit，产品编号：70239-3)纯化可溶性表达的flgE重组蛋白(见图1)。实施例2以胞内劳森菌flgE重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA方法1.间接ELISA方法(flgE-ELISA方法)的建立

①包被：用0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释实施例1中纯化的胞内劳森菌flgE重组蛋白包被ELISA板(进口96孔Costa ELISA板，购自华粤行仪器有限公司)，用方阵法确定最佳包被浓度，检测孔中flgE重组蛋白包被量为800ng/孔，对照孔包被硫氧还蛋白量为40ng/孔，4℃条件下包被24小时后甩干，采用PBST(含0.05％吐温-20，pH7.4)洗涤2遍；

②封闭：封闭采用PBST稀释5％脱脂奶粉，110μl/孔，37℃条件下封闭30min后甩干，用PBST洗涤3次；

③血清作用条件：血清稀释液为PBST稀释5％脱脂奶粉，添加5％的大肠杆菌裂解液，100μl/孔；血清做50倍稀释(2μl/孔)，37℃条件下孵育1h后甩干，用PBST洗涤4次；

④酶标羊抗猪抗体作用条件：酶标羊抗猪抗体(购自Sigma公司，产品目录号：A5670)用PBST做36000倍稀释后，100μl/孔，37℃条件下孵育1h后甩干，用PBST洗涤4次；

⑤底物显色：TMB(购自北京天根生化科技公司)50μl/孔，37℃条件下作用20min后加2M H₂SO₄终止反应；

⑥读数：采用分光光度计吸光度450nm下读取数据；

⑦结果判定条件：在该条件下重复检测OD值为0.75左右血清样品确定为参考阳性血清样品，OD值为0.1左右的血清样品为参考阴性血清样品；血清样品S/P值临界值为0.3，S/P≥0.3判定为阳性，S/P＜0.3判定为阴性。

2.特异性试验

利用上述建立的间接ELISA检测猪群中常见传染性疾病：猪瘟病毒(CSFV)标准阳性血清、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)标准阳性血清、伪狂犬病毒(PRV)标准阳性血清、口蹄疫病毒(FMDV)标准阳性血清、猪圆环病毒2型(PCV-2)标准阳性血清、猪肺炎支原体标准阳性血清和传染性胸膜肺炎标准阳性血清，结果均为阴性。表明本试剂盒所用诊断抗原与上述病原抗体之间无交叉反应，说明本发明以胞内劳森菌flgE重组蛋白为包被抗原建立的间接ELISA法具有良好的特异性。

3.符合性试验

用瑞典Savnova公司L.intracellularis/Ileitis-Ab(LI-Ab)检测试剂盒检测92份血清，检测结果显示53份为阳性，39份阴性，同时按本发明建立的flgE-ELISA方法检测这92份血清，结果显示51份为阳性，41份为阴性。两种方法均检测同为阳性的血清有49份血清，同为阴性的血清有37份。本发明flgE-ELISA法与瑞典Savnova公司L.intracellularis/Ileitis-Ab(LI-Ab)检测试剂盒比较一致性：检测阳性血清符合率为92.45％，检测阴性血清符合率为94.87％，总符合率为93.66％，见表1。

表1本发明方法与Savnova公司LI-Ab检测试剂盒对比结果

4.本发明的间接ELISA方法的灵敏度和重复性

随机挑取6份抗体水平较高的临床血清(检测OD_450nm值在2.0以上)，从1:50开始2倍比稀释至1:6 400倍，本发明的flgE-ELISA方法检测倍比稀释后的血清，每份血清3个重复，结果显示，有3份LI阳性血清1:1 600稀释后仍可判定为阳性，表明本发明建立的方法的灵敏度较高。

利用同一批次包被的抗原板检测8份血清，每份血清3个重复，结果显示，批内变异系数为1.54％～9.94％。利用3个不同批次包被的抗原板检测8份血清，批内变异系数为4.48％～9.65％，表明所建立的ELISA方法具有较好的重复性。

实施例3本发明的间接ELISA方法检测胞内劳森菌抗体

采用本发明的间接ELISA方法检测2个母猪场猪(A场和B场)不同胎次母猪血清，结果参见下表2，显示2个猪场中低胎次到高胎次母猪血清的抗体水平依次下降且抗体检测均为阳性(在饲养管理规范的猪场中，LI感染猪后可获得坚强的免疫保护)。

表2不同胎次母猪血清的抗体检测结果

②采用本发明的间接ELISA方法检测3个猪场(C场、D场和E场)不同阶段商品猪血清。C场的初产母猪和经产母猪分开饲养，血清来自于经产母猪所生猪群，D场和E场为传统开放式水泥地面饲养的商品猪养殖场。结合参见下表3，3个场的血清抗体检测结果显示，D和E 2场的10日龄仔猪抗体阳性率均很高，30日龄时3个猪场的仔猪抗体水平和抗体阳性率均最低，而C场和E场的仔猪在50日龄时抗体水平和抗体阳性率仍为最低。3个猪场的抗体水平均在50日龄或70日龄明显开始上升，到110日龄～140日龄时抗体阳性率均在90.0％以上或达100.0％。

表3 3个猪场不同日龄商品猪血清的抗体检测结果

注：“/”表示未采集到相应日龄的猪血清。

③采用本发明间接ELISA方法检测实验猪场单独饲养的30头初产母猪所生仔猪30～80日龄4次跟踪采血的血清，结合参见下表4，结果显示，所有仔猪30日龄时LI抗体均为阴性，45日龄、60日龄和80日龄仔猪的抗体水平和抗体阳性率依次上升，至80日龄时，抗体阳性率为100.0％。

表4 30份初产母猪所生仔猪跟踪血清的抗体检测结果

从以上采用本发明的间接ELISA方法检测3种不同类型猪场(A和B2个饲养规范的母猪场，C、D和E3个商品猪养殖场猪及1个实验猪场初产母猪所生跟踪仔猪)的血清结果来看，2个母猪场的母猪群体和3个商品猪场中日龄较大的肥猪群体中，血清抗体阳性率很高，在90％以上甚至100％。在饲养管理规范的猪场中，母猪血清抗体水平随胎次的增加而呈依次下降趋势，这是因为在饲养规范的猪场种，猪感染LI后，能抵抗LI的再次感染，即在没有抗原刺激下，抗体水平会随着时间的推移而不断下降。由于30头实验猪饲养在水泥地面，当粪便不能及时被清除时，会加大猪感染LI的风险，导致30头仔猪在80日龄时就全群感染了LI，进一步分析30头仔猪前后4次跟踪采血的检测结果发现，多数先转阳的猪只在80日龄时血清中的抗体水平较高，而晚转阳的猪只在80日龄时血清抗体水平一般较低，说明本发明间接ELISA方法可较准确地反映仔猪感染LI后的抗体上升规律。以上结果表明，本发明间接ELISA方法可以准确反映LI感染猪群真实的抗体水平和抗体阳性率。

序列表

<110> 湖南农业大学

<120> 胞内劳森菌flgE重组蛋白及胞内劳森菌抗体检测试剂盒

<130> 0001

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 741

<212> PRT

<213> 合成()

<400> 1

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg

20 25 30

Gly Ser Glu Phe Met Ser Leu Thr Ala Gly Met Trp Thr Gly Val Ser

35 40 45

Gly Leu Leu Ser His Gly Glu Lys Met Asn Val Ile Gly Asn Asn Ile

50 55 60

Ala Asn Val Asn Thr Val Gly Phe Lys Gly Gln Arg Met Asp Phe Ala

65 70 75 80

Asp Phe Ile Tyr Gln Asp Gly Phe Ser Thr Ala Gly Ile Thr Gln Ile

85 90 95

Gly Arg Gly Val Gly Ile Gly Ala Val Met Gly Asn Phe Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Phe Glu Thr Thr Thr Glu Ala Thr Asp Leu Ala Ile Gly Gly Arg

115 120 125

Gly Phe Phe Lys Val Lys Pro Gln Gly Ser Glu Thr Ser Tyr Tyr Thr

130 135 140

Arg Ala Gly Asn Phe Arg Phe Asn Asn Asp Gly Tyr Leu Val Asp Pro

145 150 155 160

His Gly Tyr Ala Leu Gln Gly Trp Lys Ile Asp Asn Thr Glu Gly Pro

165 170 175

Gln Arg Ile Ser Gly Gly Val Asn Pro Gly Thr Asn Thr Ser Gln Ile

180 185 190

Met Gly Thr Gly Glu Pro Thr Asp Ile Arg Leu Asp Thr Trp Thr Val

195 200 205

Ala Pro Leu Gln Thr Thr Asn Val Ser Phe Asn Val Asn Leu Ser Ser

210 215 220

Asp Lys Ser Gly Asp Lys Ser Gln Asn Val Asn Ser Pro Phe Thr Ser

225 230 235 240

Leu Phe Asn Ile Trp Asn Gly Lys Gln Pro Ser Glu Pro Asn Asn Pro

245 250 255

Pro Met Pro Glu Ser Ala Tyr Ser Tyr Gln Thr Ser Ile Lys Val Tyr

260 265 270

Asp Glu Ala Gly Gly Thr His Thr Leu Thr Val Tyr Phe Asp Gln Val

275 280 285

Ser Pro Lys Asp Tyr Lys Gly Gly Gly Ser Gly Glu Ser Val Trp Glu

290 295 300

Tyr Val Val Thr Met Asp Pro Ser Glu Asp Asn Arg Gln Val Ser Val

305 310 315 320

Gly Gly Asn Ile Val Asp Ile Lys Asp Thr Lys Ala Ala Gly Met Leu

325 330 335

Met Ser Gly Thr Leu Ser Phe Asp Ser Ser Gly Lys Leu Ala Asn Gln

340 345 350

Ser Ala Tyr Ser Leu Asn Gly Ser Arg Lys Pro Ala Val Asp Pro Ala

355 360 365

Thr Gly Ala Leu Ile Asn Gly Asn Gly Phe Thr Ile Asp Arg Asp Gly

370 375 380

Asn Ala Ile Pro Ile Leu Asn Ile Asp Asn Pro Ala Glu Asn Phe Tyr

385 390 395 400

Pro Ala Glu Val Ser Asn Asn Gly Phe Pro Met Ile Val Ala Asn Phe

405 410 415

Thr Gly Val Pro Gly Lys Asn Thr Ala Gly Ser Val Gly Asp Ala Thr

420 425 430

Thr Phe Phe Thr Glu Ile Asp Phe Gly Leu Lys Ala Thr Asp Leu Asp

435 440 445

Asn Thr Trp Lys Asn Ala Asn Glu Pro Leu Ser Ser Leu Ser Tyr Lys

450 455 460

Lys Thr His Asn Pro Met Asp Val Ala Gly Gly Trp Thr Val Gly Gly

465 470 475 480

Tyr Lys Thr Pro Ala Pro Ser Val Thr Glu Leu Gly Met Ala Gln Ile

485 490 495

Leu Glu Asn Pro Ala Gly Val Met Pro Gln Tyr Tyr Phe Gly Asn Pro

500 505 510

Asn Tyr Asp Asn Thr Val Pro Gln Ser Pro Pro Tyr Val Tyr Lys Asn

515 520 525

Glu Ala Ser Tyr Gln Ala Ala Tyr Lys Thr Ala Leu Thr Ala Ala Gly

530 535 540

Gly Thr Ala Ala Asp Ile Lys Lys Glu His Trp Pro His Asn Ala Ala

545 550 555 560

Ser Gly Ile Leu Glu Ala Asn Asp Pro Pro Asn Val Lys Asp Leu Ala

565 570 575

Asn Met Asn Gly Thr Pro Asn Arg Leu Ser Asn Ala Phe Thr Asn Tyr

580 585 590

Ala Gly Gly Ser Ser Thr Lys Ser Ala Ser Gln Asn Gly Tyr Gly Phe

595 600 605

Gly Asp Leu Met Asn Tyr Ser Val Asn Ala Glu Gly Val Leu Phe Gly

610 615 620

Val Tyr Ser Asn Gly Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gln Val Ala Leu Tyr

625 630 635 640

Asp Phe Asn Ser Lys Gln Gly Leu Arg Arg Glu Gly Gly Asn Leu Phe

645 650 655

Ser Gln Thr Arg Glu Ser Gly Asp Pro Ser Ser Gly Ala Ala Asn Thr

660 665 670

Ser Gly Phe Gly Ser Ile Asn Ala Asn Thr Leu Glu Gly Ser Asn Val

675 680 685

Asp Ile Ser Thr Glu Phe Val Ser Met Ile Ala Thr Gln Arg Gly Phe

690 695 700

Gln Ser Asn Ser Lys Ile Val Thr Thr Ile Asp Gln Met Leu Glu Thr

705 710 715 720

Val Val Asn Met Lys Arg Val Asp Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His

725 730 735

His His His His His

740

<210> 2

<211> 2070

<212> DNA

<213> 合成()

<400> 2

atgagtctta cagcaggaat gtggacaggt gtttcaggac ttttaagtca tggcgaaaag 60

atgaatgtta ttggtaataa catagctaac gtaaatacag taggctttaa aggccaacgt 120

atggatttcg cagactttat ttatcaagat ggctttagta ctgcagggat tacacaaatt 180

ggacgtggtg taggcattgg agctgtcatg gggaactttg gtcagggtag ttttgaaacc 240

acaactgaag caacagacct tgctattggt ggtcgtggat ttttcaaagt taaaccacaa 300

ggatcagaga cttcatatta tacccgtgca ggtaattttc gttttaataa tgatggatac 360

ttagttgatc ctcatggata tgctcttcag ggttggaaaa ttgataatac tgaagggcca 420

caacgtatct caggtggtgt taatccaggt acaaatactt cgcagattat gggtacaggt 480

gaaccaacag atatccgtct tgatacttgg acagttgcac ctttacagac aacaaatgta 540

agttttaacg taaacctttc ttctgataaa tctggagata aatctcaaaa cgttaatagt 600

ccatttacct cattatttaa tatatggaat ggtaaacaac caagtgaacc taacaatcca 660

cctatgcctg aaagtgcata tagttatcag acatctatta aggtatatga tgaagctggt 720

ggaacacata cattaacagt ctattttgac caagtttctc ctaaagacta caaaggtggt 780

ggaagtggag aaagtgtatg ggaatacgtt gttactatgg atccttctga agataatcgc 840

caagtttctg ttggtggtaa cattgtggac atcaaagata ctaaagctgc aggaatgtta 900

atgtcaggaa cattgagttt tgatagctca ggaaaacttg caaaccaaag tgcatattcg 960

ctgaatggtt cacgtaagcc tgcagttgat cctgcaaccg gagctcttat taatggtaat 1020

ggttttacta ttgatagaga tggaaatgca attcctattc ttaatataga taatccagct 1080

gaaaacttct atccagcaga agtttctaat aatggatttc ctatgattgt agctaatttt 1140

actggtgtcc caggtaaaaa tacagctgga tctgttggtg atgctaccac cttttttaca 1200

gaaattgact ttggtttaaa agctactgat cttgataata catggaagaa tgcaaatgaa 1260

cctctttctt ctttaagcta taaaaaaaca cataatccta tggatgtcgc aggtggttgg 1320

acagttggtg ggtataaaac tccagctcca tcagtaactg aacttggtat ggctcagata 1380

ttggaaaatc ctgctggggt aatgccacaa tattattttg gtaaccctaa ctatgataac 1440

acagttccac agagtccacc atatgtatat aaaaatgaag cttcttatca ggctgcatat 1500

aagactgcat taactgccgc aggtggtacc gcagctgaca ttaaaaagga acattggcct 1560

cataatgctg catcaggtat attagaagct aatgatccac caaatgttaa agacttagct 1620

aatatgaatg gaacaccaaa ccgcttatca aatgcgttta ctaactatgc aggtggtagc 1680

tctacaaaat ctgcaagtca aaatggttat ggttttggtg atttaatgaa ctatagtgta 1740

aatgctgagg gagtgttatt tggagtatat tcaaatggag tacaacttcc attatatcaa 1800

gtagctcttt atgattttaa ctctaaacag gggttacgtc gtgaaggtgg taacttattt 1860

agtcaaacaa gagaatcagg ggacccatct tcaggtgctg caaacacttc tgggtttggt 1920

tcaattaacg ctaatacttt agaaggatca aacgtagata tatctacaga gtttgtctca 1980

atgattgcaa cacaacgtgg attccagtca aatagtaaaa ttgtaactac tattgaccaa 2040

atgttagaga cagttgtaaa tatgaagcgt 2070

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 合成()

<400> 3

ccggaattca tgagtcttac agcaggaatg 30

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 合成()

<400> 4

acgcgtcgac acgcttcata tttacaactg t 31

Claims

1.一种胞内劳森菌flgE重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述胞内劳森菌flgE重组蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.权利要求1所述的胞内劳森菌flgE重组蛋白在制备检测胞内劳森菌抗体的试剂盒中的应用。

5.一种检测胞内劳森菌抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的胞内劳森菌flgE重组蛋白。

6.如权利要求5所述的检测胞内劳森菌抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用权利要求1所述的胞内劳森菌flgE重组蛋白包被的EILSA板。

7.如权利要求5所述的检测胞内劳森菌抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括稀释液、封闭液、洗涤液、酶标羊抗猪抗体、底物显色液及终止液。