CN113493493A - 多肽及其应用和用于检测胞内劳森氏菌抗体的试剂盒 - Google Patents
多肽及其应用和用于检测胞内劳森氏菌抗体的试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113493493A CN113493493A CN202110692965.1A CN202110692965A CN113493493A CN 113493493 A CN113493493 A CN 113493493A CN 202110692965 A CN202110692965 A CN 202110692965A CN 113493493 A CN113493493 A CN 113493493A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- ala
- thr
- serum
- gly
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 87
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 87
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 87
- 241001148567 Lawsonia intracellularis Species 0.000 title claims abstract description 60
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 6
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 78
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 48
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 44
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 37
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 30
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 16
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 claims description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 11
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 10
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 claims description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 10
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 23
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 23
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 15
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 14
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 7
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 7
- JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N Ala-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)N JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 6
- LJFNNUBZSZCZFN-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Cys Chemical compound N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O LJFNNUBZSZCZFN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 6
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- UWQJHXKARZWDIJ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Cys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O UWQJHXKARZWDIJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 5
- OBVSBEYOMDWLRJ-BFHQHQDPSA-N Ala-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N OBVSBEYOMDWLRJ-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- VNBNZUAPOYGRDB-ZDLURKLDSA-N Gly-Cys-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)CN)O VNBNZUAPOYGRDB-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 5
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 5
- IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N Thr-Ala-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 5
- UQCNIMDPYICBTR-KYNKHSRBSA-N Thr-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O UQCNIMDPYICBTR-KYNKHSRBSA-N 0.000 description 5
- COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N Thr-Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N 0.000 description 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- UQJUGHFKNKGHFQ-VZFHVOOUSA-N Ala-Cys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O UQJUGHFKNKGHFQ-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 4
- KUFVXLQLDHJVOG-SHGPDSBTSA-N Ala-Thr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N)O KUFVXLQLDHJVOG-SHGPDSBTSA-N 0.000 description 4
- TVYMKYUSZSVOAG-ZLUOBGJFSA-N Cys-Ala-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O TVYMKYUSZSVOAG-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 4
- HYKFOHGZGLOCAY-ZLUOBGJFSA-N Cys-Cys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HYKFOHGZGLOCAY-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 4
- NRVQLLDIJJEIIZ-VZFHVOOUSA-N Cys-Thr-Ala Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O NRVQLLDIJJEIIZ-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 4
- PYTZFYUXZZHOAD-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN PYTZFYUXZZHOAD-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- XPNSAQMEAVSQRD-FBCQKBJTSA-N Thr-Gly-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XPNSAQMEAVSQRD-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 4
- TZQWJCGVCIJDMU-HEIBUPTGSA-N Thr-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O TZQWJCGVCIJDMU-HEIBUPTGSA-N 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 208000009326 ileitis Diseases 0.000 description 4
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 4
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 4
- DECCMEWNXSNSDO-ZLUOBGJFSA-N Ala-Cys-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DECCMEWNXSNSDO-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N Ala-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 3
- ALNKNYKSZPSLBD-ZDLURKLDSA-N Cys-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O ALNKNYKSZPSLBD-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UZJDBCHMIQXLOQ-HEIBUPTGSA-N Thr-Cys-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N)O UZJDBCHMIQXLOQ-HEIBUPTGSA-N 0.000 description 3
- SLUWOCTZVGMURC-BFHQHQDPSA-N Thr-Gly-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SLUWOCTZVGMURC-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 3
- KBBRNEDOYWMIJP-KYNKHSRBSA-N Thr-Gly-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N)O KBBRNEDOYWMIJP-KYNKHSRBSA-N 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 3
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZVFVBBGVOILKPO-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZVFVBBGVOILKPO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- OXOQBEVULIBOSH-ZDLURKLDSA-N Cys-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OXOQBEVULIBOSH-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 2
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- GVVKYKCOFMMTKZ-WHFBIAKZSA-N Gly-Cys-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)CN GVVKYKCOFMMTKZ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ZKJZBRHRWKLVSJ-ZDLURKLDSA-N Gly-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)CN)O ZKJZBRHRWKLVSJ-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 2
- 241001135549 Porcine epidemic diarrhea virus Species 0.000 description 2
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- YRNBANYVJJBGDI-VZFHVOOUSA-N Thr-Ala-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O YRNBANYVJJBGDI-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- YLTKNGYYPIWKHZ-ACZMJKKPSA-N Ala-Ala-Glu Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O YLTKNGYYPIWKHZ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N Ala-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- WXERCAHAIKMTKX-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WXERCAHAIKMTKX-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- MKZCBYZBCINNJN-DLOVCJGASA-N Ala-Asp-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MKZCBYZBCINNJN-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- RCQRKPUXJAGEEC-ZLUOBGJFSA-N Ala-Cys-Cys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O RCQRKPUXJAGEEC-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- KRHRBKYBJXMYBB-WHFBIAKZSA-N Ala-Cys-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O KRHRBKYBJXMYBB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- AWAXZRDKUHOPBO-GUBZILKMSA-N Ala-Gln-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O AWAXZRDKUHOPBO-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- VWEWCZSUWOEEFM-WDSKDSINSA-N Ala-Gly-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O VWEWCZSUWOEEFM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- QUIGLPSHIFPEOV-CIUDSAMLSA-N Ala-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O QUIGLPSHIFPEOV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- SDZRIBWEVVRDQI-CIUDSAMLSA-N Ala-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O SDZRIBWEVVRDQI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- AWNAEZICPNGAJK-FXQIFTODSA-N Ala-Met-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O AWNAEZICPNGAJK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- RTZCUEHYUQZIDE-WHFBIAKZSA-N Ala-Ser-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O RTZCUEHYUQZIDE-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- OEVCHROQUIVQFZ-YTLHQDLWSA-N Ala-Thr-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OEVCHROQUIVQFZ-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 1
- QKHWNPQNOHEFST-VZFHVOOUSA-N Ala-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N)O QKHWNPQNOHEFST-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- PHQXWZGXKAFWAZ-ZLIFDBKOSA-N Ala-Trp-Lys Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 PHQXWZGXKAFWAZ-ZLIFDBKOSA-N 0.000 description 1
- VWVPYNGMOCSSGK-GUBZILKMSA-N Arg-Arg-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O VWVPYNGMOCSSGK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- MTANSHNQTWPZKP-KKUMJFAQSA-N Arg-Gln-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O MTANSHNQTWPZKP-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- DQTIWTULBGLJBL-DCAQKATOSA-N Asn-Arg-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N DQTIWTULBGLJBL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- FAEFJTCTNZTPHX-ACZMJKKPSA-N Asn-Gln-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FAEFJTCTNZTPHX-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- OLGCWMNDJTWQAG-GUBZILKMSA-N Asn-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O OLGCWMNDJTWQAG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- GYWQGGUCMDCUJE-DLOVCJGASA-N Asp-Phe-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GYWQGGUCMDCUJE-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000252983 Caecum Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- AEJSNWMRPXAKCW-WHFBIAKZSA-N Cys-Ala-Gly Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O AEJSNWMRPXAKCW-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- YFXFOZPXVFPBDH-VZFHVOOUSA-N Cys-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CS)C(O)=O YFXFOZPXVFPBDH-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- CVLIHKBUPSFRQP-WHFBIAKZSA-N Cys-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CVLIHKBUPSFRQP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- DZLQXIFVQFTFJY-BYPYZUCNSA-N Cys-Gly-Gly Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O DZLQXIFVQFTFJY-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FTTZLFIEUQHLHH-BWBBJGPYSA-N Cys-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O FTTZLFIEUQHLHH-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- NAPULYCVEVVFRB-HEIBUPTGSA-N Cys-Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](N)CS NAPULYCVEVVFRB-HEIBUPTGSA-N 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LZRMPXRYLLTAJX-GUBZILKMSA-N Gln-Arg-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O LZRMPXRYLLTAJX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- JKGHMESJHRTHIC-SIUGBPQLSA-N Gln-Ile-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N JKGHMESJHRTHIC-SIUGBPQLSA-N 0.000 description 1
- VAZZOGXDUQSVQF-NUMRIWBASA-N Glu-Asn-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O VAZZOGXDUQSVQF-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- HJIFPJUEOGZWRI-GUBZILKMSA-N Glu-Asp-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N HJIFPJUEOGZWRI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- OXEMJGCAJFFREE-FXQIFTODSA-N Glu-Gln-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OXEMJGCAJFFREE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- SWRVAQHFBRZVNX-GUBZILKMSA-N Glu-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SWRVAQHFBRZVNX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- UJMNFCAHLYKWOZ-DCAQKATOSA-N Glu-Lys-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O UJMNFCAHLYKWOZ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- QSDKBRMVXSWAQE-BFHQHQDPSA-N Gly-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN QSDKBRMVXSWAQE-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- CCQOOWAONKGYKQ-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)CN CCQOOWAONKGYKQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- LLZXNUUIBOALNY-QWRGUYRKSA-N Gly-Leu-Lys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN LLZXNUUIBOALNY-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- JQFILXICXLDTRR-FBCQKBJTSA-N Gly-Thr-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCC(O)=O JQFILXICXLDTRR-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 1
- WUEIUSDAECDLQO-NAKRPEOUSA-N Ile-Ala-Met Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N WUEIUSDAECDLQO-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- AZEYWPUCOYXFOE-CYDGBPFRSA-N Ile-Arg-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N AZEYWPUCOYXFOE-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- QADCTXFNLZBZAB-GHCJXIJMSA-N Ile-Asn-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N QADCTXFNLZBZAB-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- HUORUFRRJHELPD-MNXVOIDGSA-N Ile-Leu-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N HUORUFRRJHELPD-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- CQQGCWPXDHTTNF-GUBZILKMSA-N Leu-Ala-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O CQQGCWPXDHTTNF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- KTFHTMHHKXUYPW-ZPFDUUQYSA-N Leu-Asp-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O KTFHTMHHKXUYPW-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- VQPPIMUZCZCOIL-GUBZILKMSA-N Leu-Gln-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VQPPIMUZCZCOIL-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- CIVKXGPFXDIQBV-WDCWCFNPSA-N Leu-Gln-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CIVKXGPFXDIQBV-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- ISHNZELVUVPCHY-ZETCQYMHSA-N Lys-Gly-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O ISHNZELVUVPCHY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- ONPDTSFZAIWMDI-AVGNSLFASA-N Lys-Leu-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O ONPDTSFZAIWMDI-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- WBSCNDJQPKSPII-KKUMJFAQSA-N Lys-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O WBSCNDJQPKSPII-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- HKXSZKJMDBHOTG-CIUDSAMLSA-N Lys-Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN HKXSZKJMDBHOTG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WQDKIVRHTQYJSN-DCAQKATOSA-N Lys-Ser-Arg Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N WQDKIVRHTQYJSN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- FZDOBWIKRQORAC-ULQDDVLXSA-N Met-Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N FZDOBWIKRQORAC-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AUEJLPRZGVVDNU-UHFFFAOYSA-N N-L-tyrosyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 AUEJLPRZGVVDNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- KYYMILWEGJYPQZ-IHRRRGAJSA-N Phe-Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 KYYMILWEGJYPQZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- KDYPMIZMXDECSU-JYJNAYRXSA-N Phe-Leu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 KDYPMIZMXDECSU-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- PTLOFJZJADCNCD-DCAQKATOSA-N Pro-Glu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 PTLOFJZJADCNCD-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- XYHMFGGWNOFUOU-QXEWZRGKSA-N Pro-Ile-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 XYHMFGGWNOFUOU-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- FMDHKPRACUXATF-ACZMJKKPSA-N Ser-Gln-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FMDHKPRACUXATF-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- SMIDBHKWSYUBRZ-ACZMJKKPSA-N Ser-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SMIDBHKWSYUBRZ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- DSGYZICNAMEJOC-AVGNSLFASA-N Ser-Glu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O DSGYZICNAMEJOC-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- XUDRHBPSPAPDJP-SRVKXCTJSA-N Ser-Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CO XUDRHBPSPAPDJP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- TYVAWPFQYFPSBR-BFHQHQDPSA-N Thr-Ala-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O TYVAWPFQYFPSBR-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- QWMPARMKIDVBLV-VZFHVOOUSA-N Thr-Cys-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O QWMPARMKIDVBLV-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- DGOJNGCGEYOBKN-BWBBJGPYSA-N Thr-Cys-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O DGOJNGCGEYOBKN-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- RKDFEMGVMMYYNG-WDCWCFNPSA-N Thr-Gln-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RKDFEMGVMMYYNG-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- WYKJENSCCRJLRC-ZDLURKLDSA-N Thr-Gly-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O WYKJENSCCRJLRC-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- XOWKUMFHEZLKLT-CIQUZCHMSA-N Thr-Ile-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XOWKUMFHEZLKLT-CIQUZCHMSA-N 0.000 description 1
- SCSVNSNWUTYSFO-WDCWCFNPSA-N Thr-Lys-Glu Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SCSVNSNWUTYSFO-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- NDZYTIMDOZMECO-SHGPDSBTSA-N Thr-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NDZYTIMDOZMECO-SHGPDSBTSA-N 0.000 description 1
- NZGOVKLVQNOEKP-YDHLFZDLSA-N Val-Phe-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N NZGOVKLVQNOEKP-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010086434 alanyl-seryl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 229940078916 carbamide peroxide Drugs 0.000 description 1
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000021050 feed intake Nutrition 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 108010025153 lysyl-alanyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010056582 methionylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 108010048397 seryl-lysyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 108010031491 threonyl-lysyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000010023 transfer printing Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108010035534 tyrosyl-leucyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N urea hydrogen peroxide Chemical compound OO.NC(N)=O AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供一种多肽及其应用和用于检测胞内劳森氏菌抗体的试剂盒。所述多肽具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或与SEQ ID No.3所示氨基酸序列具有85％以上同源性的氨基酸序列。所述多肽优选是利用原核细胞外源表达并纯化得到的重组多肽。根据本发明的所述多肽的应用，将所述多肽用于制备检测胞内劳森氏菌抗体的制剂或制品。本发明的多肽制备方法简单、免疫反应性良好，基于该多肽制备的检测胞内劳森氏菌抗体的试剂盒，具有操作简单、使用方便、敏感性高、特异性强、准确性高、重复性好等优点。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及多肽及其应用以及用于检测胞内劳森氏菌抗体的试剂盒。
背景技术
胞内劳森氏菌(Lawsonia Intracellularis，LI)寄生于肠道细胞内，可引起猪增生性肠炎(Porcine proliferative enteropathy，PPE)，该病以回肠、盲肠及结肠前端未成熟的肠细胞瘤样增生为特征；临床常呈现急性型、亚临床型和慢性型；其中慢性型最为常见；该病潜伏期长，感染率高，死亡率低，全球呈散发性流行。
1931年首次报道该病，随后欧洲、美洲、澳洲、亚洲等主要生猪生产国都相继出现该病的相关报道。根据我国目前的有关调查研究显示，我国各地区猪增生性肠炎的感染呈上升趋势，大多猪只临床表现并不明显，采食量及粪便均正常，但猪只生长缓慢，严重影响料肉比，增加饲养成本，给养猪业造成了严重损失。
目前，LI抗体的检测方法处于发展阶段，操作复杂、耗时长、灵敏度较低、特异性较低、准确性较低，尚无国产商品化检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的一方面在于提供一种多肽，所述多肽具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或与SEQ ID No.3所示氨基酸序列具有85％以上同源性的氨基酸序列。
优选地，所述多肽是由具有SEQ ID No.2所示DNA序列或者与SEQ ID No.2所示DNA序列具有78.8％以上同源性的DNA序列的基因所编码的。
优选地，所述多肽是利用体外表达系统外源表达并纯化得到的重组多肽。
优选地，所述多肽是利用原核细胞外源表达并纯化得到的重组多肽。
本发明另一方面还提供所述多肽的应用，将所述多肽用于制备检测胞内劳森氏菌抗体的制剂或制品。
根据本发明所述的多肽的应用，优选将所述多肽用于制备检测胞内劳森氏菌抗体的试剂盒和/或胶体金检测试纸条。
本发明还提供一种用于检测胞内劳森氏菌抗体的ELISA试剂盒，其包括ELISA反应板，所述ELISA反应板的各反应孔内预包被有本发明所提供的多肽。
优选地，所述ELISA试剂盒还包括阴性对照血清、阳性对照血清、酶标二抗、洗涤液、样品稀释液、显色液和终止液。
优选地，所述ELISA反应板是用浓度为20ng/mL以上的所述多肽溶液预包被后的反应板。
本发明所提供的用于检测胞内劳森氏菌抗体的多肽具有免疫反应性良好的特点，检测胞内劳森氏菌时，检测敏感性高、特异性强、准确性高。
本发明的另一目的是提供所述多肽的制备方法，采用该方法能够大量可溶性表达该多肽，免疫反应性良好，制备方法简单。
本发明的再一目的是提供检测胞内劳森氏菌抗体的试剂盒，操作简单、耗时短、敏感性高、特异性强、准确性高、重复性好。
本发明的目的采用如下技术方案实现。
本发明提供一种用于检测胞内劳森氏菌抗体的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明所提供的多肽免疫反应性好，用于检测胞内劳森氏菌尤其是检测胞内劳森氏菌抗体时，具有特异性、敏感性、准确性高等优点。发明人采用pET-32a载体，将诱导条件调整至37℃，使得目标蛋白部分呈可溶形式表达，从而易于纯化，适于大规模生产制备。本发明检测胞内劳森氏菌抗体的试剂盒，操作简单、耗时短、敏感性高、特异性强、重复性好。由于本发明试剂盒采用重组多肽作为包被抗原，其易于表达纯化，浓度易于控制，有利于该试剂盒成本控制并进行大量生产。
附图说明
图1是pET-32a-LI1022重组质粒酶切后的琼脂糖凝胶电泳结果图，其中泳道1是未酶切的PET-32a-LI1022重组质粒，泳道2是酶切后的PET-32a-LI1022重组质粒。
图2是通过SDS-PAGE电泳对多肽的诱导表达及可溶性表达情况进行检测的结果图，其中泳道1是未诱导的PET-32a-LI1022/BL21菌液，泳道2是在37℃条件下诱导培养4h后的pET-32a-LI1022/BL21全菌，泳道3是在37℃条件下诱导培养4h的pET-32a-LI1022/BL21裂解液上清，泳道4是在37℃条件下诱导培养4h的pET-32a-LI1022/BL21裂解液沉淀。
图3是纯化后的多肽的SDS-PAGE电泳结果图，其中泳道M是蛋白分子量标准，泳道1是在37℃条件下诱导培养4h的PET-32a-LI1022/BL21菌液超声破碎后处理样品，泳道2是纯化过程中的洗柱流出物，泳道3～6分别是250mM咪唑洗脱纯化后的多肽。
图4是通过Western Blot对纯化后的多肽进行鉴定的结果图，其中泳道M是蛋白质分子量标准，泳道1是纯化后的多肽。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步描述本发明的技术方案，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应当理解，实施例仅是示例性的，不对本发明的范围构成限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
在下文的描述中，所涉及的方法如无特别说明，则均为本领域的常规方法。所涉及的原料如无特别说明，则均是能从公开商业途径获得的原料。
本发明提供一种用于检测胞内劳森氏菌的多肽，该多肽具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或者与SEQ ID No.1所示氨基酸序列具有85％同源性的氨基酸序列。
本发明的多肽优选是由具有SEQ ID No.2所示DNA序列或者与SEQ ID No.2所示DNA序列具有78.8％以上同源性的基因所编码的。
本发明的多肽优选是利用体外表达系统外源表达并纯化得到的重组多肽，尤其优选是利用原核细胞表达系统外源表达并纯化得到的重组多肽。
基于上述多肽，本发明还提供用于检测胞内劳森氏菌抗体的试剂、试剂盒或装置，包括但不限于ELISA试剂盒、胶体金检测试纸条等。
在本发明中，所述试剂盒还包括洗涤液、样品稀释液、酶标二抗、底物显色液、终止液、LI阳性血清和LI阴性血清。
在本发明中，样品稀释液是含有1-2％脱脂乳粉水溶液，终止液是浓度为2M的H2SO4溶液，洗涤液是含有0.05％吐温-20的0.01M、pH7.4磷酸盐缓冲液。
实施例1：制备多肽
以具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列的多肽为例，描述本发明的多肽的制备方法。
1、获取多肽编码基因
本研究采用PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法，在SEQ ID No.3所示核酸序列基础上除去信号肽结构对应的DNA序列并对稀有密码子进行优化后，在序列前后端分别加入BamH I和HindIII酶切位点，得到具有SEQ ID No.2所示DNA序列的多肽编码基因。
将上述扩增得到的多肽编码基因与pMD19-T载体连接，4℃下连接反应过夜。将连接产物转化Trans5α感受态细胞，并涂布至氨苄青霉素抗性的LB平板，37℃培养过夜。从培养过夜的LB平板上挑取单克隆菌落，接种于氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中并振荡培养8h，然后从培养物中提取质粒，酶切鉴定。将酶切鉴定为阳性的单菌进行测序。将测序验证为具有正确的多肽编码基因序列的重组质粒命名为pMD19-T-LI1022质粒。
2、外源表达多肽
首先，利用PET-32a载体构建重组表达质粒PET-32a-LI1022。用BamH I酶和HindIII酶对上述获得的pMD19-T-LI1022质粒进行双酶切处理，获得多肽编码基因的DNA片段，同步地用BamH I酶和HindIII酶对PET-32a载体进行双酶切处理。将多肽编码基因的DNA片段与酶切处理后的PET-32a载体在连接酶作用下进行连接，构建重组表达质粒PET-32a-LI1022。通过酶切来筛选鉴定正确的重组表达质粒PET-32a-LI1022，结果如图1所示。
将酶切鉴定为正确的重组表达质粒PET-32a-LI1022转化BL21(DE3)感受态细胞，获得重组大肠杆菌PET-32a-LI1022(DE3)。将重组大肠杆菌PET-32a-LI1022(DE3)于LB培养基中在37℃下培养，待OD600值达到0.6时，加入终浓度为1μmol/L的IPTG，在37℃条件下进行诱导表达，诱导培养4h后取2mL菌液用于检测多肽的表达情况。
将上述收集到的菌液分成两份，每份1ml，在4℃、12000rpm下离心1min，收集菌体沉淀。将两份沉淀分别用100μL的PBS重悬，其中一份加入25μL SDS-PAGE上样缓冲液并于100℃水浴10min，其将作为全菌样品用于SDS-PAGE电泳分析。将另一份重悬的沉淀进行超声破碎，随后离心并分别收集上清液和包涵体沉淀，用100μL PBS缓冲液重悬包涵体，然后向上清液和重悬的包涵体中分别加入25μL SDS-PAGE上样缓冲液，用于进行SDS-PAGE电泳分析。图2示出了SDS-PAGE电泳的结果。
在图2所示的电泳结果中，泳道1是未在诱导条件下培养的重组大肠杆菌PET-32a-LI1022(DE3)全菌样品，泳道2是诱导条件下培养的重组大肠杆菌PET-32a-LI1022(DE3)全菌样品，泳道3是诱导条件下培养的重组大肠杆菌PET-32a-LI1022(DE3)超声破碎后的上清液，泳道4是诱导条件下培养的重组大肠杆菌PET-32a-LI1022(DE3)超声破碎后的包涵体样品。从图2的结果可看出，泳道2和泳道3中显示出非常明显的目的蛋白条带，尤其是泳道3中最为明显，目的蛋白条带的分子量约为32kD，与预测的增加组氨酸标签后的多肽的分子量大小一致，说明目的多肽以可溶性蛋白的形式在上述构建的重组大肠杆菌PET-32a-LI1022(BL21)中高效地表达。
3、纯化多肽
将3mL重组大肠杆菌PET-32a-LI1022(DE3)接种到300mL氨苄青霉素抗性的LB培养基中，在37℃条件下活化培养，当OD600＝0.6时，加入终浓度为1μmol/L的IPTG，在37℃条件下诱导6h，将诱导后的菌液在8000rpm下离心10min后收集菌体沉淀。
用PBS缓冲液重悬菌体沉淀，进行超声波破碎，随后离心取上清。采用Ni柱从上清液中纯化获得重组多肽。纯化后得到的多肽蛋白浓度为300μg/mL，共获得1.5mg纯化后的多肽。对纯化后的多肽进行SDS-PAGE检测，结果如图3所示，结果显示纯化后的多肽中几乎没有杂质条带，纯度约为100％。
进一步通过Western Blot对纯化后的多肽进行验证分析。
将纯化后的多肽进行SDS-PAGE电泳后，使用转印装置转印到硝酸纤维素滤膜(NC膜)上。转印结束后，取下膜后先用PBST洗涤4次，每次5min；将膜置于含有3～5％脱脂奶粉的封闭液中在37℃下封闭1h；按1:1000的比例用封闭液稀释带有His标签的单克隆抗体(购自武汉博士德生物工程有限公司)，将膜置于稀释后的一抗液在4℃下过夜；次日将膜取出后用PBST洗涤4次，每次5min；按1:5000的比例用含3～5％脱脂奶粉的封闭液稀释用作二抗的羊抗鼠IgG中(购自武汉博士德生物工程有限公司)，将膜置于二抗中在37℃反应1h；反应完毕后，把膜取出后置于干净的盒子中洗膜4次，每次5min；采用增强型ECL化学发光检测试剂盒(Vazyme公司)进行曝光、显色。结果如图4，在大约32kD大小的位置显示特异性条带，与目的多肽的分子量大小一致。
实施例2：制备检测胞内劳森氏菌抗体的试剂盒
本实施例以ELISA试剂盒为例描述实施例1制备的重组多肽在制备用于检测胞内劳森氏菌抗体的试剂或装置中的应用。
本实施例的ELISA试剂盒主要包括：洗涤液、样品稀释液、终止液、底物显色液、酶标二抗、LI阳性血清和LI阴性血清、酶标板。
洗涤液是吐温-20终浓度为0.05％(v/v)的磷酸盐缓冲液(0.01M，pH7.4)，配制方法如下：称取0.2g的KH2PO4、0.2g的KCl、2.9g的Na2HPO4·12H2O和8g的NaCl，溶于水并定容至1000mL，然后加入0.5mL的吐温-20，得到洗涤液。
样品稀释液：1～2％脱脂乳粉水溶液，配制方法：在1000ml洗涤液中添加10～20g的脱脂乳粉后获得。
终止液是2M硫酸溶液，配制方法如下：取11.1mL浓硫酸，用水稀释后定容至100mL。
底物显色液包括显色液A和B。显色液A的配制方法如下：200mg TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，购自BIOSHARP公司)，溶于100mL无水乙醇(或二甲基亚砜)，蒸馏水定容至1000mL，作为显色液A。显色液B的配制方法如下：将28.2g无水磷酸钠、21g柠檬酸溶解于400mL蒸馏水，再加入6.4mL的7.75％过氧化脲，加蒸馏水定容至1000mL，调pH至4.5～5.4，作为显色液B。在使用前，将显色液A与显色液B按照体积比为1:1进行混合，得到底物显色液。
酶标二抗采用HRP标记的羊抗猪IgG抗体，本实施例所用的酶标二抗购自BETHYL公司。
LI阳性血清是从免疫了猪回肠炎疫苗的猪采集得到的血清。
LI阴性血清是从无母源抗体、未免疫猪回肠炎疫苗的猪采集得到的血清。
ELISA反应板是用本发明的多肽预包被的ELISA反应板。下文以实施例1制备的多肽为例描述ELISA反应板的包被过程。
1、确定最佳的抗原包被浓度和血清稀释度
采用方阵滴定法确定最佳的抗原包被浓度和血清稀释度。
将纯化后的多肽(300μg/mL)作为抗原，用包被液(0.05M、pH 9.6的碳酸盐缓冲液)依次按1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800的比例稀释。
将以上按各稀释度稀释后的多肽按100μL/孔的量加入到ELISA板中，4℃包被过夜。弃去孔中液体，加洗涤液洗涤，每孔300μL，洗涤3次，每次5min，洗涤后甩去孔中液体。按200μL/孔的量用封闭液(洗涤液中添加终浓度为2％(w/v)的明胶)在37℃下封闭1h，弃去封闭液后按上述方法洗涤。
将LI阳性血清和LI阴性血清分别用样品稀释液依次按1:25、1:50、1:100、1:200的比例进行稀释，组成方阵，按100μL/孔的量加入到酶标板中，37℃条件下作用1h，弃液后按上述方法洗涤。然后，按100μL/孔的量加入用样品稀释液按1:10000的比例稀释后的HRP标记的羊抗猪lgG，37℃条件下作用1h，之后按上述方法洗涤；按100μL/孔的量加入底物显色液，室温避光显色15min，加入终止液(50μL/孔)终止反应。用酶标仪在450nm波长下读取OD值(OD450值)。
比较阳性血清和阴性血清的OD450值，选取阳性血清OD450值为1.0左右，阴性血清OD450值为0.2以下，且阳性血清与阴性血清OD450值之比(P/N)最大时的抗原包被浓度为最佳的抗原包被浓度，对应的阴阳性血清稀释度为最佳的血清稀释度。
表1所示的方阵滴定结果表明，当抗原以1:6400稀释(抗原浓度为46.9ng/mL)，血清以1:100稀释时，阳性血清OD450值在1.0以上，阴性血清OD450值在0.2以下，且P/N值较大。因此确定重组多肽的最佳包被浓度为46.9ng/mL，血清的最佳稀释度为1:100。
表1
2、包被条件的选择
按以上确定的抗原最佳包被浓度，分别比较下列不同包被条件下的检测效果：4℃包被12h、37℃包被1h后4℃包被12h、37℃包被2h。
将LI阳性血清、阴性血清按最佳血清稀释度稀释后加入到各反应孔中，其他步骤同上，读取检测后的OD450值并计算、比较P/N值，比较不同条件下包被的效果。
表2所示的结果显示最佳的包被条件为4℃下包被12h。
表2
3、封闭液的选择
按抗原最佳包被浓度和最佳包被条件进行包被，分别用5％脱脂乳溶液和2％明胶溶液作为封闭液，37℃封闭2h。
血清按照最佳稀释度进行稀释，其他步骤同上，用LI阳性血清、阴性血清进行ELISA检测，比较上述两种封闭液的封闭效果。
表3的结果显示，5％脱脂乳溶液更适宜作为封闭液。
表3
4、最佳封闭时间的确定
按照上述优化的条件包被后，分别在37℃条件下封闭1h、2h、3h，其他步骤同上，用LI阳性血清、阴性血清进行ELISA检测，比较不同封闭时间的封闭效果。
表4所示的结果显示，最终确定封闭时间为2h。
表4
基于以上确定的最佳抗原包被浓度和包被条件对ELISA反应板进行包被。
在ELISA反应板的各孔中加入100μL浓度为46.9ng/mL的多肽溶液，4℃下包被12h，然后弃去孔中的液体，每孔加入300μL洗涤液进行洗涤，重复洗涤3次，每次5min，洗涤后甩去孔中液体。用封闭液(洗涤液中添加终浓度为5％(w/v)的脱脂乳粉)按200μL/孔的量在37℃条件下封闭2h，弃去封闭液，按上述方法洗涤，最后将残留的洗涤液用吸水纸拍干，4℃保存，得到用于制备试剂盒的ELISA反应板。
实施例3：试剂盒的使用方法
1、确定最佳的抗原抗体反应时间
在相应的反应孔中加入100μL按照实施例2中所确定的最佳稀释度稀释后的LI阳性血清或阴性血清，37℃下分别孵育30、60、90min后弃去孔中的液体，按200μL/孔的量加入洗涤液，重复洗涤三次，每次3～5min，然后按100μL/孔的量加入按1:10000稀释的HRP标记的羊抗猪lgG，37℃孵育1h；弃去孔中液体，每孔加300μL洗涤液进行洗涤，重复洗涤3次，每次5min，洗涤后甩去孔中液体；按100μL/孔的量加入底物显色液，25℃避光显色15min，加入终止液(50μL/孔)终止反应。
用酶标仪在450nm波长下读取OD值。评价不同一抗反应时间的反应效果。根据表5所示的结果，最终确定抗原抗体的最佳反应时间为60min，此时阳性血清的OD450平均值在1.0以上，阴性血清的OD450平均值在0.2以下，且P/N值最大。
表5
2、确定最佳的二抗工作浓度
在相应的反应孔中以最佳稀释度分别加入100μL的LI阴性血清、阳性血清后，37℃孵育60min，弃液，洗涤，按100μL/孔的量加入按稀释度1:5000、1:10000、1:20000稀释的酶标二抗(HRP标记的羊抗猪lgG)，37℃孵育1h，弃去孔中液体，每孔加300μL洗涤液进行洗涤，重复洗涤3次，每次5min，洗涤后甩去孔中液体；按100μL/孔的量加入底物显色液，室温避光显色15min，加入终止液(50μL/孔)终止反应。
用酶标仪读取450nm波长下的吸光值。评价不同时间的反应效果。根据表6所示的结果，最终确定最佳的二抗工作浓度为1:10000，此时阳性血清的OD450平均值在1.0以上，阴性血清的OD450平均值在0.2以下，且P/N值最大。
表6
3、确定最佳的酶标二抗反应时间
按照上述确定的最佳血清稀释度向ELISA反应板的反应孔中加入血清并在最佳条件下反应，然后按照上述确定的最佳二抗工作浓度加入二抗后在37℃条件下分别反应15、30、45、60min。洗涤、显色和终止反应的操作同上。
用酶标仪读取450nm波长下的吸光值，对不同二抗反应时间条件下的OD450进行比较和评价。根据表7所示的结果，最终确定最佳的二抗反应时间为60min，此时阳性血清的OD450平均值在1.0以上，阴性血清的OD450平均值在0.2以下，且P/N值最大。
表7
4、确定最佳的显色时间
按照上述确定的最佳血清稀释度向ELISA反应板的反应孔中加入血清并在最佳条件下反应，接下来按照上述确定的最佳二抗工作浓度加入二抗后在37℃条件下反应60min，然后分别显色10、15、20min。洗涤和终止反应的操作同上。
用酶标仪读取450nm波长下的吸光值，对不同显色时间条件下的OD450进行比较和评价。结果如表8所示，最佳显色时间为15min，此时，阳性血清的OD450平均值在1.0以上，阴性血清的OD450平均值在0.2以下，且P/N值最大。
表8
5、确定试剂盒的ELISA操作程序
按上述各项优化的最佳条件，确定ELISA操作程序为：
取出4℃提前包被并封闭好的ELISA反应板条，用样品稀释液将待检血清以1:100进行稀释，每份待检血清、LI阴性血清、LI阳性血清各设置两个重复实验孔，每孔加入100μL血清，37℃反应1h；弃去孔中液体，每孔加300μL洗涤液进行洗涤，重复洗涤3次，每次5min，洗涤后甩去孔中液体；按100μL/孔的量加入1:10000稀释的HRP标记的羊抗猪lgG，37℃反应1h；弃去孔中液体，每孔加300μL洗涤液进行洗涤，重复洗涤3次，每次5min，洗涤后甩去孔中液体；每孔加入100μL底物显色液，25℃避光显色15min，按50μL/孔加入终止液终止反应。
用酶标仪在450nm波长读取吸光值，计算待检血清的S/P值，待检血清的S/P值＝(待检血清OD450值-阴性血清OD450值)/(阳性血清OD450值-阴性血清OD450值)。
6、阴阳性临界值的确定
根据上述优化条件，按照上述确定的ELISA操作程序对80份用猪回肠炎商品化试剂盒检测为阴性的血清样品进行检测，按照以下公式计算S/P值：
S/P值＝(待检血清OD450值-阴性血清OD450值)/(阳性血清OD450值-阴性血清OD450值)，
计算各血清S/P值的平均值
及标准方差SD，当待检血清的
时，判定待检血清中LI抗体为阴性；待检血清的
时，判定待检血清中LI抗体为阳性；
时，判定待检血清中LI抗体为疑似阳性。
经计算，上述80份样品血清的S/P值的平均数
S/P值的标准方差SD＝0.104。因此，
当待检血清S/P值<0.289时，判定待检血清中LI抗体为阴性；待检血清S/P值>0.426时，判定待检血清中LI抗体为阳性；0.322≤待检血清S/P值≤0.426时，判定待检血清中LI抗体为疑似阳性。
实施例4：试剂盒的特异性、敏感性、重复性和符合率
1、特异性实验
以已知为PRRSV(猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒)、PRV(猪伪狂犬病病毒)、FMDV(口蹄疫病毒)、PEDV(猪流行性腹泻病毒)阳性的猪血清以及LI阴性血清和LI阳性血清作为被检样品，用实施例2中的ELISA试剂盒和实施例3中确定的使用方法进行检测，每份血清设置3个重复。
测定各反应孔的OD450值并对LI抗体的阴阳性结果进行判定，用于评价该ELISA试剂盒和方法的特异性。
表9的结果显示，根据实施例3确定的判定标准，除了LI阳性血清，其他血清的OD450值均表现为阴性，表明本发明的ELISA试剂盒与其他常见病毒的阳性血清不发生交叉反应，具有优异的针对LI抗体的特异性。
表9
2.敏感性实验
将3份LI阳性血清分别按1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200比例稀释，采用实施例2中试剂盒及实施例3中使用方法，在酶标仪下测定各孔OD450吸光值，分析本发明试剂盒的敏感性。
根据表10结果表明，3份阳性血清稀释度为1:100、1:200、1:400时均为阳性，自1:800稀释后检测结果转为阴性，表明本次试验建立的ELISA方法敏感性较好。
表10
2、重复性实验
(1)批内重复实验
取利用同一批次的多肽作为抗原进行包被的ELISA试剂盒，在不同时间分别检测5份随机选择的LI抗体水平不同的血清，测定各反应孔的OD450值，计算各血清样品的S/P值，以及每份血清样品S/P值的平均值
标准差SD和变异系数CV，用于分析批内重复的效果。
结果如表11所示，结果显示在不同时间对5份血清进行检测的变异系数在2.8％～6.0％之间，表明同一批次的多肽包被的ELISA板在不同时间检测的重复性良好。
表11
(2)批间重复实验
使用不同批次的多肽作为抗原进行包被的ELISA试剂盒，对5份随机选择的LI抗体水平不同的血清同时进行检测。计算各份血清S/P值，以及每份血清S/P值的平均值
标准差SD和变异系数CV，用于分析批间重复的效果。
结果如表12所示，可见8份血清检测结果的变异系数在3.7％～9.4％之间，表明不同批次多肽作为抗原检测的重复性良好。
表12
3、符合率试验
用优化后的间接ELISA试剂盒与瑞士svanova猪回肠炎抗体检测试剂盒同时检测54份临床猪血清样品，比较不同试剂盒的检测结果。
检测结果如表13所示，本发明建立的LI抗体检测试剂盒检测阳性29份，阴性25份；商品化试剂盒检测阳性26份，阴性28份。两者共有阳性血清26份，阳性符合率100％；共有阴性血清25份，阴性符合率89.28％；总体符合率为94.44％。
表13
实施案例4：试剂盒临床应用
利用本发明建立的间接ELISA方法对江苏部分地区(连云港、徐州、宿迁、淮安、泰州)的319份临床血清样品进行检测，结果如表14显示，连云港阳性率为80.33％，徐州阳性率为89.06％，宿迁阳性率为85.48％，淮安阳性率为92.05％，泰州阳性率为90.91％，共检测319份血清，总阳性率为90.91％，抗体阳性率较高。
表14
申请人结合说明书附图对本发明的实施例做了详细的说明与描述，但是本领域技术人员应该理解，以上实施例仅为本发明的优选实施方案，详尽的说明只是为了帮助读者更好地理解本发明精神，而并非对本发明保护范围的限制，相反，任何基于本发明的发明精神所作的任何改进或修饰都应当落在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 多肽及其应用和用于检测胞内劳森氏菌抗体的试剂盒
<130> JAAS2021-3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ala Asp Phe Pro Ile Gly Val Phe Asn Ser Gln Ser Ile Ala Met Glu
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Lys Ala Ala Gln Lys Lys Leu Gln Ser Glu Phe Gly
20 25 30
Asn Glu Lys Thr Gln Leu Glu Lys Gln Ala Lys Asp Leu Gln Thr Lys
35 40 45
Ala Asp Asp Leu Gln Ala Lys Ser Ala Ala Met Ser Asn Gln Ala Arg
50 55 60
Glu Asp Lys Gln Arg Glu Phe Leu Glu Leu Arg Arg Asn Phe Glu Glu
65 70 75 80
Lys Ser Arg Asp Phe Ala Ile Arg Val Glu Gln Ala Glu Asn Thr Leu
85 90 95
Arg Gln Tyr Leu Ala Glu Gln Ile Tyr Leu Ala Ala Glu Thr Ile Ala
100 105 110
Lys Lys Lys Gly Leu Lys Leu Val Leu Asp Ser Ala Ser Gly Ser Val
115 120 125
Met Tyr Leu Glu Lys Asn Leu Asp Ile Thr Lys Glu Ile Leu Glu Ala
130 135 140
Ile Asn Ala Ala Trp Lys Lys Gly Gly Ser Lys Leu Pro Glu Met Ala
145 150 155 160
Asn Arg Lys Lys
<210> 2
<211> 507
<212> DNA
<213> 胞内劳森氏菌
<400> 2
ggatccgcag attttccgat tggtgttttt aatagtcaga gtattgcaat ggaaagtgaa 60
gcagcaaaag cagcacagaa aaagctgcag agcgaatttg gtaatgaaaa aacccagctg 120
gaaaaacagg caaaagatct gcagaccaaa gcagatgatc tgcaggcaaa aagcgcagca 180
atgagcaatc aggcacgtga agataaacag cgtgaatttc tggaactgcg tcgtaatttt 240
gaagaaaaaa gccgtgattt tgcaattcgt gttgaacagg cagaaaatac cctgcgtcag 300
tatctggcag aacagattta tctggcagca gaaaccattg caaaaaaaaa aggtctgaaa 360
ctggttctgg atagcgcaag cggtagcgtt atgtatctgg aaaaaaatct ggatattacc 420
aaagaaattc tggaagcaat taatgcagca tggaaaaaag gtggtagcaa actgccggaa 480
atggcaaatc gtaaaaaata aaagctt 507
<210> 3
<211> 561
<212> PRT
<213> 胞内劳森氏菌
<400> 3
Ala Thr Gly Ala Ala Ala Gly Thr Ala Ala Ala Ala Ala Cys Thr Cys
1 5 10 15
Thr Thr Thr Cys Cys Ala Thr Gly Gly Cys Thr Ala Thr Thr Thr Thr
20 25 30
Ala Gly Cys Thr Thr Gly Thr Thr Thr Ala Thr Thr Ala Gly Thr Ala
35 40 45
Gly Cys Thr Ala Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys Ala Thr Thr Thr Thr
50 55 60
Cys Gly Gly Cys Thr Gly Ala Cys Thr Thr Cys Cys Cys Thr Ala Thr
65 70 75 80
Thr Gly Gly Thr Gly Thr Cys Thr Thr Thr Ala Ala Thr Thr Cys Thr
85 90 95
Cys Ala Ala Thr Cys Cys Ala Thr Thr Gly Cys Cys Ala Thr Gly Gly
100 105 110
Ala Gly Ala Gly Thr Gly Ala Ala Gly Cys Ala Gly Cys Thr Ala Ala
115 120 125
Gly Gly Cys Cys Gly Cys Thr Cys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
130 135 140
Thr Thr Ala Cys Ala Ala Thr Cys Ala Gly Ala Ala Thr Thr Thr Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Cys Ala Cys Ala
165 170 175
Ala Cys Thr Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Cys Ala Ala Gly Cys Ala
180 185 190
Ala Ala Ala Gly Ala Thr Thr Thr Gly Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala
195 200 205
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Thr Thr Ala Cys Ala
210 215 220
Ala Gly Cys Thr Ala Ala Gly Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Thr
225 230 235 240
Ala Thr Gly Thr Cys Thr Ala Ala Cys Cys Ala Ala Gly Cys Ala Cys
245 250 255
Gly Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Ala Ala Ala Cys Ala Ala Ala Gly
260 265 270
Ala Gly Ala Ala Thr Thr Thr Cys Thr Thr Gly Ala Ala Cys Thr Thr
275 280 285
Cys Gly Thr Cys Gly Thr Ala Ala Thr Thr Thr Cys Gly Ala Ala Gly
290 295 300
Ala Ala Ala Ala Ala Thr Cys Thr Cys Gly Thr Gly Ala Cys Thr Thr
305 310 315 320
Thr Gly Cys Ala Ala Thr Ala Cys Gly Thr Gly Thr Cys Gly Ala Ala
325 330 335
Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Ala Ala Ala Ala Cys Ala Cys Ala Thr
340 345 350
Thr Ala Cys Gly Thr Cys Ala Ala Thr Ala Thr Cys Thr Ala Gly Cys
355 360 365
Thr Gly Ala Ala Cys Ala Ala Ala Thr Cys Thr Ala Thr Cys Thr Thr
370 375 380
Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala Ala Cys Thr Ala Thr Ala Gly
385 390 395 400
Cys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala Gly Gly Gly Thr Thr
405 410 415
Ala Ala Ala Ala Cys Thr Thr Gly Thr Thr Cys Thr Thr Gly Ala Thr
420 425 430
Ala Gly Thr Gly Cys Thr Ala Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Thr Gly
435 440 445
Thr Ala Ala Thr Gly Thr Ala Cys Cys Thr Thr Gly Ala Ala Ala Ala
450 455 460
Ala Ala Ala Thr Cys Thr Ala Gly Ala Thr Ala Thr Thr Ala Cys Ala
465 470 475 480
Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala Thr Thr Cys Thr Thr Gly Ala Ala Gly
485 490 495
Cys Cys Ala Thr Ala Ala Ala Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala Thr Gly
500 505 510
Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Thr
515 520 525
Ala Ala Ala Cys Thr Thr Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Thr Gly Gly
530 535 540
Cys Ala Ala Ala Cys Cys Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala
545 550 555 560
Ala
Claims (9)
1.一种多肽，其特征在于：所述多肽具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或者与SEQ IDNo.3所示氨基酸序列具有85％以上同源性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述多肽是由具有SEQ ID No.2所示DNA序列或者与SEQ ID No.2所示DNA序列具有78.8％以上同源性的DNA序列的基因所编码的。
3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述多肽是利用体外表达系统外源表达并纯化得到的重组多肽。
4.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述多肽是利用原核细胞外源表达并纯化得到的重组多肽。
5.权利要求1～4中任一项所述的多肽的应用，将所述多肽用于制备检测胞内劳森氏菌抗体的制剂或制品。
6.根据权利要求5所述的多肽的应用，其特征在于：将所述多肽用于制备检测胞内劳森氏菌抗体的试剂盒和/或胶体金检测试纸条。
7.一种用于检测胞内劳森氏菌抗体的ELISA试剂盒，其包括ELISA反应板，其特征在于：所述ELISA反应板的各反应孔内预包被有权利要求1～4中任一项所述的多肽。
8.根据权利要求7所述的用于检测胞内劳森氏菌抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述ELISA试剂盒还包括阴性对照血清、阳性对照血清、酶标二抗、洗涤液、样品稀释液、显色液和终止液。
9.根据权利要求7所述的用于检测胞内劳森氏菌抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述ELISA反应板是用浓度为20ng/mL以上的所述多肽溶液预包被后的反应板。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110692965.1A CN113493493B (zh) | 2021-06-22 | 2021-06-22 | 多肽及其应用和用于检测胞内劳森氏菌抗体的试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110692965.1A CN113493493B (zh) | 2021-06-22 | 2021-06-22 | 多肽及其应用和用于检测胞内劳森氏菌抗体的试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113493493A true CN113493493A (zh) | 2021-10-12 |
| CN113493493B CN113493493B (zh) | 2024-02-13 |
Family
ID=77997845
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110692965.1A Active CN113493493B (zh) | 2021-06-22 | 2021-06-22 | 多肽及其应用和用于检测胞内劳森氏菌抗体的试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113493493B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7052697B1 (en) * | 1999-05-13 | 2006-05-30 | Agriculture Victoria Services Pty Ltd | Lawsonia derived gene and related OmpH polypeptides, peptides and proteins and their uses |
| CN107576791A (zh) * | 2017-09-13 | 2018-01-12 | 河南农业大学 | 一种猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒 |
| CN112940089A (zh) * | 2021-01-27 | 2021-06-11 | 湖南康保特生物科技有限公司 | 胞内劳森菌flgE重组蛋白及胞内劳森菌抗体检测试剂盒 |
-
2021
- 2021-06-22 CN CN202110692965.1A patent/CN113493493B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7052697B1 (en) * | 1999-05-13 | 2006-05-30 | Agriculture Victoria Services Pty Ltd | Lawsonia derived gene and related OmpH polypeptides, peptides and proteins and their uses |
| CN107576791A (zh) * | 2017-09-13 | 2018-01-12 | 河南农业大学 | 一种猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒 |
| CN112940089A (zh) * | 2021-01-27 | 2021-06-11 | 湖南康保特生物科技有限公司 | 胞内劳森菌flgE重组蛋白及胞内劳森菌抗体检测试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 王丹丹等: "胞内劳森氏菌间接ELISA 抗体检测方法的建立及应用" * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113493493B (zh) | 2024-02-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111474345A (zh) | 一种SARS-CoV-2抗体检测方法 | |
| CN111505286A (zh) | 一种新型冠状病毒特异性抗体双抗原夹心elisa检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN113336845B (zh) | Prrsv核衣壳蛋白的猪源单个b细胞抗体及竞争elisa抗体检测试剂盒 | |
| CN110231481B (zh) | 一种水痘-带状疱疹病毒病毒滴度的快速检测方法 | |
| CN111381032A (zh) | 一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接elisa检测方法及其试剂盒 | |
| CN106518989B (zh) | 用于检测猪Delta冠状病毒抗体的多肽、制备方法及其应用 | |
| CN111551750B (zh) | 猪星状病毒间接elisa检测试剂盒 | |
| CN113265006A (zh) | 一种用于捕获prrsv核衣壳蛋白抗体的融合蛋白3an及其应用 | |
| CN114702578B (zh) | 新型冠状病毒Omicron突变株特异性抗体及其应用 | |
| CN110031621B (zh) | 一种hiv新发感染检测试剂盒和制备方法 | |
| CN114773483B (zh) | 非洲猪瘟病毒抗原重组串联表位蛋白及其构建方法、应用和抗体elisa试剂盒 | |
| CN110261615B (zh) | 囊型包虫病诊断试剂盒及其应用 | |
| CN113943354B (zh) | 一种重组猫疱疹病毒gB蛋白抗原及其在抗体诊断和疫苗制备中的应用 | |
| CN109748971B (zh) | 一种鸭坦布苏病毒的elisa抗体检测试剂盒及其应用 | |
| CN109655610B (zh) | 一种伪狂犬病病毒的间接elisa检测试剂盒 | |
| CN107219365A (zh) | 一种基于口蹄疫病毒3b表位蛋白的化学发光检测试剂盒 | |
| CN109283334B (zh) | 一种检测单纯疱疹病毒II型IgG抗体的重组抗原组合物及其试剂盒 | |
| CN113493493A (zh) | 多肽及其应用和用于检测胞内劳森氏菌抗体的试剂盒 | |
| CN114720691B (zh) | 一种检测生物标志物的试剂盒及其制备方法和应用 | |
| CN114539362B (zh) | 一种肉毒毒素特异性底物肽、检测试剂盒和检测方法 | |
| CN114966052B (zh) | 基于非洲猪瘟p30和p22两种蛋白的间接ELISA检测试剂盒 | |
| CN112345768B (zh) | 一种基于重组蛋白rsPgp3的家畜衣原体抗体的间接ELISA检测方法及试剂盒 | |
| CN110229218B (zh) | 检测塞内卡病毒抗体的试剂及其所用多肽 | |
| CN110196325B (zh) | 塞内卡病毒病诊断试剂盒及试纸 | |
| CN101509002B (zh) | 一种重组风疹病毒蛋白及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |