CN111381032A

CN111381032A - 一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接elisa检测方法及其试剂盒

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Publication number: CN111381032A
Application number: CN202010152062.XA
Authority: CN
Inventors: 王弘; 李莉萍; 杨金易; 肖治理; 苏晓娜; 李家冬
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-03-06
Filing date: 2020-03-06
Publication date: 2020-07-07

Abstract

本发明公开了一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法及其试剂盒。本发明将编码COE蛋白的基因克隆至真核表达载体pPIC9K中后，转化入毕赤酵母GS115感受态细胞进行诱导表达，成功表达得到了重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白。该COE蛋白的纯化生产工艺较原核表达包涵体抗原简便易行，且COE蛋白的表达量高、纯度高，更接近病毒蛋白天然结构；利用该COE蛋白作为包被抗原，成功构建了一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法及其试剂盒，该方法及其试剂盒的检测结果准确度高、特异性强、敏感性高、重复性好，且该试剂盒所需要的样品量少，操作简便快捷，成本低；因此，该方法及其试剂盒在检测猪流行性腹泻病毒抗体中具有广泛的应用前景。

Description

一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法及其试剂盒

技术领域

本发明属于动物疫病检测技术领域。更具体地，涉及一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法及其试剂盒。

背景技术

猪流行性腹泻病(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由冠状病毒猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种急性传染病，发病猪以呕吐、水样腹泻、脱水以及哺乳仔猪高致死率为主要特征。该病最初于20世纪70年代报道于英国和比利时(Oldham，1972)，随后包括中国、日本、韩国等在内的多个亚洲国家也先后报道本病的发生，频繁爆发，并导致严重的经济损失。

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是单链正股RNA病毒，在遗传分类上属于冠状病毒科、冠状病毒属。其基因组共编码4种主要结构蛋白，即核衣壳蛋白(N)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和纤突蛋白(S)；其中，位于病毒颗粒表面的S蛋白具有比其他任何PEDV蛋白更强的抗原性。S蛋白在介导病毒粒子进入细胞和诱导机体产生中和抗体的过程中起到关键作用，并且在感染病毒的猪中持续检测到的S 蛋白的抗体比N蛋白的抗体时间更长。因S蛋白富含许多抗原表位，是PEDV 感染免疫研究和疫苗设计的主要靶蛋白，该蛋白抗体水平及其变化动态是评价免疫效果和监测免疫状态的重要依据，同时也可以作为PEDV感染血清流行病学调查的重要指标。S蛋白由1383个氨基酸组成，与其他冠状病毒一样，它可分为两个功能区即S1区(1～789aa)和S2区(790～1383aa)；其中，位于S1区的COE 蛋白(499～638aa)被证实具有很好的免疫原性，是重要的中和表位，而基于 COE蛋白的研究多聚焦于疫苗开发。

现有技术中，关于PEDV抗体的血清学检测已被广泛应用，以评估猪场的 PEDV疫苗情况或染病猪的血清学诊断。与其他现有的血清学方法相比较，如荧光微球免疫测定(FMIA)、血清中和测试(SN)、间接免疫荧光测定(IFA) 和酶联免疫吸附实验(ELISA)是一种更加便捷、快速且经济的方法，使其适用于临床诊断。迄今为止，已经有两种类型的ELISA用于检测针对PEDV的抗体，包括间接ELISA和竞争性或封闭ELISA。基于完整病毒制品或重组病毒蛋白已经开发了间接ELISA；但是，由于全病毒培养费时，昂贵且不适合大规模生产；因此，使用异源表达系统获得重组PEDV蛋白成为研究趋势。

目前，基于PEDV的M蛋白、N蛋白、S蛋白和ORF3蛋白及PEDV全病毒的ELISA诊断试剂盒都已有报道；但是，蛋白抗原尤其是S蛋白抗原的制备主要基于原核表达系统进行表达纯化，其表达产物不能有效模拟病毒蛋白天然构象，相对费时费力，且表达量低、纯度和特异性较低。因此，开发一种简便快速、检测特异性强、敏感性高、准确度高、重复性好的PEDV抗体的检测方法以及能够商品化生产的试剂盒具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有PEDV抗体检测方法的缺陷和不足，提供一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法及其试剂盒。

本发明的目的是提供重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白在检测重组猪流行性腹泻病毒抗体和/或制备检测重组猪流行性腹泻病毒抗体的试剂盒中的应用。

本发明另一目的是提供一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法。

本发明又一目的是提供一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒。

本发明再一目的是提供所述方法或所述试剂盒在检测重组猪流行性腹泻病毒抗体中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明首先提供了重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白在检测重组猪流行性腹泻病毒抗体和/或制备检测重组猪流行性腹泻病毒抗体的试剂盒中的应用。

所述COE蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.No.1所示，编码所述COE蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ.ID.No.2所示。

优选地，所述COE蛋白的制备方法为：将编码所述COE蛋白的基因克隆至真核表达载体pPIC9K中，将获得的重组表达质粒pPIC9K-COE转化入毕赤酵母 GS115感受态细胞进行诱导表达，即得所述COE蛋白。

优选地，所述检测的方法为ELISA法。

更优选地，所述检测的方法为间接ELISA法。

本发明还提供了一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法，以重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白为包被抗原，利用ELISA法进行检测。

优选地，所述检测方法包括以下步骤：

S1.以重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白为包被抗原用包被液包被酶标板，并封闭微孔表面未吸附位点；

S2.将待测猪血清稀释后加入酶标板的孔中，同时设置空白对照孔、阴性对照孔和阳性对照孔，待测猪血清中的抗体与酶标板中的包被抗原进行反应，洗去反应后未结合的物质；

S3.加入酶标二抗反应，洗去反应后未结合的酶标二抗，然后加入底物显色液进行显色后，用终止液终止反应，根据测得的OD₄₅₀值计算阴阳性临界值；

S4.当阴阳性临界值≥0.12时，则待测猪血清为猪流行性腹泻病毒抗体阳性；当阴阳性临界值＜0.12，则待测猪血清为猪流行性腹泻病毒抗体阴性。

所述阴阳性临界值的计算公式为：

阴阳性临界值＝(待检样品的平均OD₄₅₀值-阴性对照平均OD₄₅₀值)/(阳性对照平均OD₄₅₀值-阴性对照平均OD₄₅₀值)。

优选地，步骤S1所述包被液为0.05M Tris。

优选地，步骤S1所述重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白包被的浓度为 1μg/mL。

优选地，步骤S1所述包被的条件为4℃包被11～13h。

更优选地，步骤S1所述包被抗原包被酶标板的条件为4℃包被12h。

优选地，步骤S2所述稀释的倍数为400倍。

优选地，步骤S2所述反应的条件为36～38℃反应40～50min。

更优选地，步骤S2所述反应的条件为37℃反应45min。

优选地，步骤S3所述酶标二抗反应条件为36～38℃反应25～35min。

更优选地，步骤S3所述酶标二抗反应条件为37℃反应30min。

优选地，步骤S1所述封闭的条件为36～38℃封闭60min。

更优选地，步骤S1所述封闭的条件为37℃封闭60min。

优选地，步骤S3所述酶标二抗稀释倍数为10000。

本发明还提供了一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒，包括由重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白包被的酶标板。

优选地，所述试剂盒还包括辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG抗体。

更优选地，所述试剂盒还包括阳性对照血清、阴性对照血清、血清样品稀释液、浓缩洗涤液、底物缓冲液、底物液和终止液。

具体优选地，所述试剂盒包括以下组分：

(1)酶标板：酶标板孔内包被有重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白，并封闭微孔表面未吸附位点；

(2)酶标记物：1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG抗体；

(3)阳性对照血清：PEDV高免血清，并以血清稀释液按1:400稀释；

(4)阴性对照血清：无菌且未注射任何疫苗的猪血清，并以血清稀释液按 1:400稀释；

(5)血清样品稀释液：PBS(0.01M，pH 7.4)；

(6)20X浓缩洗涤液：8g NaCl，3g Na₂HPO₄·12H₂O，0.6mLTween-20，加蒸馏水至50mL；

(7)底物缓冲液A：过氧化脲1g，10.3g柠檬酸，35.8g Na₂HPO₄·12H₂O，吐温-20 100μL，蒸馏水至1000mL，pH5；

(8)底物液B：四甲基联苯胺(TMB)700mg(40mL DMSO溶解)，10.3g 柠檬酸，蒸馏水至1000mL，pH2.4；

(9)终止液：2M浓硫酸。

另外，所述方法或所述试剂盒在检测重组猪流行性腹泻病毒抗体中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

本发明具有以下有益效果：

本发明将编码COE蛋白的基因克隆至真核表达载体pPIC9K中后，转化入毕赤酵母GS115感受态细胞进行诱导表达，成功表达得到了重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白(具有功能性的可溶性蛋白)；该COE蛋白的纯化生产工艺较原核表达包涵体抗原简便易行，且应用毕赤酵母GS115感受态细胞作为真核表达细胞，具有糖基化修饰功能，使得表达的COE蛋白的表达量高、纯度高，且更接近病毒蛋白天然结构；

本发明利用重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白作为包被抗原，成功构建了一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法及其试剂盒；该方法简便快速、检测PEDV抗体时和其它临床症状相似的病毒并无交叉现象，特异性强，敏感性高(高达1:6400)，批内变异系数为1.58％～5.92％，批间变异系数为 0.86％～9.01％，检测结果准确度高，重复性好；同时该试剂盒所需要的样品量少，操作简便快捷，造价成本低廉，能够大量商品化生产，适用于畜牧养殖业中猪流行性腹泻病的诊断及猪流行性腹泻病毒病原的检测，在养殖业的发展中具有重大意义；因此，该方法及其试剂盒在检测猪流行性腹泻病毒抗体中具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是SDS-PAGE与Western blotting鉴定重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白反应原性的结果图。

图2是阴阳性临界值的确定结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1表达载体pPIC9K-COE的构建及重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白诱导表达和鉴定

1、表达载体pPIC9K-COE的构建与重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白诱导表达

1)表达载体pPIC9K-COE的构建

将猪流行性腹泻病毒基因(Accession no.KP162057)通过限制性内切酶EcoR I和Not I酶切位点克隆至真核表达载体pPIC9K，以Sac I单酶切鉴定正确的重组表达质粒pPIC9K-COE进行线性化，回收酶切产物，电转入新鲜制备的毕赤酵母GS115感受态细胞中。

2)诱导表达

经PCR鉴定正确的转化子pPIC9K-COE-GS115平板划线于MD平板培养基， 28℃培养3天，挑取单菌落，接种于5mL YPD培养基中，30℃，250r/min震荡 24h。次日将过夜(11～13h)培养培养菌液按1％接种于100mL BMGY培养基中，30℃，250r/min培养24h。将菌液转移到50mL离心管，4000r/min离心5 min收集菌体，弃上清，把菌体转入1L BMMY培养基(含1％甲醇)中，28℃，250r/min培养，每隔24h补加1％甲醇，诱导培养4天，12000r/30min收集上清。

2、重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白纯化与鉴定

1)重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白纯化

使用压力泵将以上收集的上清在4℃环境内进行流穿，让目的蛋白结合在5 mLHis Trap FF crude柱子上，然后接上GE AKTA Pure蛋白质层析系统进行纯化。用Ni Abuffer和Ni B buffer进行线性组合洗脱15个柱体积，流速为1mL/min，直至A280吸收值达到水平，收集洗脱样品。

2)SDS-PAGE与Western blotting鉴定重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白反应原性

(1)实验方法

取10μL以上纯化洗脱收集到的样品与10μL 2x loadding buffer混合，沸水中煮10min后，取10μL进行SDS-PAGE与Western blotting验证，利用His单抗、PEDV阳性猪的血清多抗作为一抗分别做Western blotting，以鉴定重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白反应原性。

(2)实验结果

SDS-PAGE与Western blotting鉴定重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白反应原性的结果图如图1所示，可以看出，His单抗和PEDV阳性猪的血清多抗均能很好地识别重组表达的猪流行性腹泻病毒COE蛋白。

实施例2猪流行性腹泻病毒抗体的间接酶联免疫(ELISA)检测方法的建立

1、试剂与仪器

脱脂奶粉：美国BD公司公司产品；HRP标记山羊抗猪IgG抗体：美国SIGMA 公司产品；96孔酶标板：深圳市金灿华公司产品；隔水式电热恒温培养箱(上海跃进)、酶标仪(伯乐)等。

间接ELISA相关试剂的配制：

1)包被液：0.05M Tris；

2)血清稀释液及酶标抗体稀释液：PBS(0.01M，pH 7.4)；

3)洗涤液：8g NaCl，3g Na₂HPO₄·12H₂O，0.6mLTween-20，加蒸馏水至 1000mL；

4)封闭液：PBS+5％脱脂奶粉；

5)底物缓冲液A：过氧化脲1g，10.3g柠檬酸，35.8g Na2 HPO4·12H2O，吐温-20100μL，蒸馏水至1000mL，pH5；

6)底物液B：四甲基联苯胺(TMB)700mg(40mL DMSO溶解)，10.3g 柠檬酸，蒸馏水至1000mL，pH2.4；

7)终止液：2M H₂SO₄溶液。

重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.No.1所示。编码所述COE蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ.ID.No.2所示。

2、猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测条件的优化

1)抗原包被浓度与血清稀释比的优化

(1)实验方法

采用棋盘滴定法确定重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白的最佳工作浓度和待检血清的最佳稀释倍数。具体方法如下：

用包被液将重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白依次稀释到浓度为至4μg/mL、 2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125g/mL、0.0.625μg/mL和0.3125μg/mL，按100μL/孔包被酶标板，4℃包被过夜(11～13h)；弃去孔内液体，用洗涤液充分洗涤两次，300μL/孔，每次静置洗涤30～60s，加入封闭液，150μL/孔，37℃封闭2h；弃去孔内封闭液，倒置于37℃烘箱烘干30min；

用血清稀释液将PEDV标准阴性、标准阳性血清分别按1:100、1:200、1:400、 1:800、1:1600和1:3200的比例倍比稀释，每个血清稀释度对应8个抗原包被浓度，按100μL/孔加入酶标板，在37℃的条件下温育30分钟；弃去血清，用上述的洗涤操作方法洗涤4次；用酶标二抗稀释液稀释酶标二抗，加入稀释的酶标二抗，100μL/孔，在37℃的条件下温育30min；弃去酶标二抗，用上述操作方法洗涤，尽量弃去孔内液体，加入底物显色液100μL/孔，37℃避光显色10min，最后加入终止液终止反应；用酶标仪在450nm波长下测定OD值。

比较阳性与阴性血清的OD₄₅₀值，选择阳性血清OD₄₅₀值与阴性血清OD₄₅₀值的比值(P/N值)最大的抗原浓度和血清稀释度，作为最佳抗原包被浓度及最佳血清稀释倍数。

(2)实验结果

重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白抗原包被浓度与血清稀释比的优化结果如表1所示，可以看出，当抗原包被浓度为1μg/mL、血清稀释倍数为400倍时P/N值最大；说明最佳抗原包被浓度为1μg/mL，最佳血清稀释倍数为400倍。

表1重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白抗原包被浓度与血清稀释比的优化结果

2)抗原包被条件的优化

(1)实验方法

以最佳抗原包被浓度1μg/mL包被ELISA酶标板，分别在4℃反应过夜(11～ 13h)、37℃反应2h后4℃反应过夜(11～13h)、37℃反应2h和37℃反应过夜 (11～13h)进行包被。用以上最佳血清稀释倍数400倍的标准阴性血清、标准阳性血清进行ELISA检测，比较阳性与阴性血清的OD₄₅₀值，选择P/N值最大时的条件为抗原包被的最佳条件。

(2)实验结果

抗原包被条件的优化结果如表2所示，可以看出，抗原包被的最佳条件为4℃过夜(11～13h)。

表2抗原包被条件的优化结果

3)封闭液反应时间的优化

(1)实验方法

以最佳抗原包被浓度1μg/mL、最佳包被条件4℃包被ELISA酶标板，在其他条件固定的情况下，将封闭液分别在37℃封闭15min、30min、60min、90min、 120min和180min，用标准阴性、标准阳性血清进行ELISA检测，选择P/N值最大时的封闭条件为最佳封闭条件。

(2)实验结果

封闭液反应时间的优化结果如表3所示，可以看出，封闭液反应的最佳条件为：37℃封闭60min。

表3封闭液反应时间的优化结果

4)血清反应时间的优化

(1)实验方法

在上述步骤优化的情况下，用标准阴性、标准阳性血清进行ELISA检测，血清分别在37℃反应15min、30min、45min、60min，选择P/N值最大时的条件为最佳血清反应时间。

(2)实验结果

血清反应时间的优化结果如表4所示，可以看出，血清反应的最佳时间为 45min。

表4血清反应时间的优化结果

5)酶标二抗稀释倍数与反应时间的优化

(1)实验方法

A、酶标二抗稀释倍数的优化

在上述步骤优化的情况下，将酶标二抗按1:2500、1:5000、1:10000、1:20000、 1:50000的比例倍比稀释进行反应，选择P/N值最大时的条件为酶标二抗最佳稀释倍数。

B、酶标二抗反应时间的优化

在上述步骤优化的情况下，将酶标二抗分别在37℃反应15min、30min、 45min、60min，选择P/N值最大时的条件为最佳酶标二抗反应时间。

(2)实验结果

酶标二抗稀释倍数的优化结果如表5所示，可以看出，酶标二抗最佳稀释倍数为1:10000。

酶标二抗反应时间优化结果如表6所示，可以看出，酶标二抗最佳反应时间为30min。

表5酶标二抗稀释倍数的优化结果

表6酶标二抗反应时间优化结果

6)阴阳性临界值(S/P)的确定

(1)实验方法

阴阳性临界值的确定采用本实验建立的间接ELISA方法检测通过中和试验已明确的27份阴性血清和90份阳性血清，每份血清重复3孔，同时设阴性对照和阳性对照。

S/P＝(待检样品的平均OD₄₅₀值-阴性对照平均OD₄₅₀值)/(阳性对照平均OD₄₅₀值-阴性对照平均OD₄₅₀值)。

将临床血清的S/P值输入Medcalc软件中，通过ROC曲线统计分析方法确定阴阳性临界值。

(2)实验结果

阴阳性临界值的确定结果图如图2所示，可以看出，阴阳性临界值为0.12，此时敏感度为94.44％，特异度为92.59％；因此，当S/P值≥0.12，则为PEDV 抗体阳性；当S/P值＜0.12，则为PEDV抗体阴性。

实施例3猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒的配制和使用

1、试剂盒组分

本实施例基于以上实施例2中建立的猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA 检测方法，构建了猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒，该试剂盒包括以下组分：

(2)酶标记物：1:10000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗猪IgG 抗体；

(4)阴性对照血清：无菌且未注射任何疫苗的猪血清，并以血清稀释液按1:400稀释；

(5)血清样品稀释液：PBS(0.01M，pH 7.4)；

(7)底物缓冲液A过氧化脲1g，10.3g柠檬酸，35.8g Na2 HPO4·12H2O，吐温-20100μL，蒸馏水1000mL，pH5；

(8)底物液B：四甲基联苯胺(TMB)700mg(40mL DMSO溶解)，10.3g 柠檬酸，蒸馏水1000mL，pH2.4；

(9)终止液：2M浓硫酸。

2、试剂盒包装规格设计及产品成分表

对以上构建的猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒进行包装规格设计，利于实现该试剂盒的产业化和实际检测的方便应用。

猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒按照以下规格进行产品组装：产品规格：96孔/板，5板/盒，试剂盒的产品成分表如表7所示。

表7猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒的产品成分表

3、试剂盒的使用

以上构建的猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒的使用说明书包括以下步骤：

(1)取出试剂盒，在室温(25℃)下平衡30分钟备用；20X浓缩洗涤液按所需量稀释成1X洗涤液备用；在回温的同时准备待检样品，猪血清样品需要使用试剂盒提供的血清样品稀释液稀释400倍；

(2)取所需数量的酶标板条，每次实验设空白对照1孔，阳性/阴性对照血清各2孔，未用的板条尽快密封，2～8℃保存；

(3)空白对照孔加血清样品稀释液100μL；阴、阳性对照孔分别加入阴、阳性对照血清100μL；样品孔每孔加入稀释后的样品100μL；

(4)置37℃孵育45min(建议使用孵育箱)；

(5)扣去孔内液体，每孔加入300μL 1X洗涤液，静置30～60秒弃去，重复洗涤4次，拍干；

(6)每孔加酶标记物100μL(空白孔除外)，置37℃孵育30min(建议使用孵育箱)；

(7)洗涤，重复步骤(5)；

(8)每孔依次加底物缓冲液A、底物液B各50μL，混匀，37℃避光反应 10分钟；

(9)显色：取底物缓冲液A和底物液B等体积混匀，每孔加100μL，在暗处37℃显色10分钟；

(10)每孔加终止液50μL，混匀，在酶标仪上测定各孔在波长为450nm(须以空白对照孔调零)处的OD值。

(11)结果计算：计算各个样品的S/P值，S/P＝(待检样品平均OD₄₅₀值-阴性对照平均OD₄₅₀值)/(阳性对照平均OD₄₅₀值-阴性对照平均OD₄₅₀值)。

(12)结果判定：参考值：空白对照OD₄₅₀值应＜0.05，阴性对照孔的OD₄₅₀值应≤0.2，阳性对照孔OD₄₅₀值应≥1.0。根据样品S/P值对其进行阴阳性判定，所述阴阳性判定标准为：样品S/P值≥0.12，则为PEDV抗体阳性；样品S/P值＜0.12，则为PEDV抗体阴性。

实施例4猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法的性能测试

1、特异性检测实验

(1)实验方法

按以上实施例2中建立的猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法，在同一条件下分别对PRRSV、PRV、CSFV的标准阳性血清及猪阴性血清进行检测，同时设PEDV的阳性血清、阴性血清和空白对照。测定OD₄₅₀，计算S/P值进行结果判定。

(2)实验结果

猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法的特异性检测结果如表8所示，可以看出，只有PEDV的阳性血清呈现阳性(S/P值≥0.12)，和其它临床症状相似的病毒并无交叉现象；说明本发明建立的猪流行性腹泻病毒抗体的间接 ELISA检测方法具有很强的特异性。

表8猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法的特异性检测结果

注：“+”代表阳性；“－”代表阴性。

2、敏感性检测实验

(1)实验方法

选择保存的1份PEDV的强阳性血清(样品序号1)、1份PEDV的中等阳性血清(样品2)、2份PEDV的弱阳性血清(样品序号3、4)，一份PEDV的阴性血清(样品序号5)，分别进行倍比稀释(100～6400)，每份血清分别做3个重复检测，按按以上实施例2中建立的猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法进行检测，读取其OD₄₅₀值，计算平均值。

(2)实验结果

猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法的敏感性检测结果如表9所示，可以看出，PEDV的强阳性血清和PEDV的中等阳性血清经6400倍稀释后， PEDV的弱阳性血清经3200倍和1600倍稀释后，OD₄₅₀值均＞0.2，而PEDV的阴性血清经100～6400倍稀释后，OD₄₅₀值均＜0.2；说明本发明建立的猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法具有很高的敏感性，敏感性为1:6400。

表9猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法的敏感性检测结果

3、重复性实验

(1)实验方法

采用优化后的猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法进行批内、批间重复性实验。

批内重复性实验，即：同一时间纯化的重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白抗原包被酶标板，每份血清分别做3个重复检测；批间重复性试验，即：使用不同时间纯化的重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白抗原包被酶标板，每份血清分别做 3个重复检测。

批内和批间重复性试验均对8份已知背景的血清进行检测，根据公式：变异系数(CV％)＝[标准差(SD)/平均值(M)]×100％，计算变异系数，确定批内、批间重复性。

(2)实验结果

批内和批间重复性实验结果如表10所示，可以看出，批内变异系数为 1.58％～5.92％，批间变异系数为0.86％～9.01％，结果均小于10％；说明本发明建立的猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法具有很好的重复性。

表10批内和批间重复性实验结果

4、符合率检验

(1)实验方法

用以上实施例3构建的猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒对 92份临床血清进行检测，检测结果与用加拿大Biovet猪流行性腹泻病毒抗体的检测试剂盒的检测结果进行比较。

(2)实验结果

符合率检验结果如表11所示，可以看出，本发明构建的猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒与加拿大Biovet猪流行性腹泻病毒抗体的检测试剂盒的阳性符合率为98.63％，阴性符合率为89.47％，两者总符合率为96.74％。

表11符合率检验结果

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法及其试剂盒

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe Val Asn Ile Thr Val

1 5 10 15

Ser Ala Ala Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn Leu Ile Ala Ser Asp

20 25 30

Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val Asp Thr Arg Gln Phe

35 40 45

Thr Ile Thr Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser Tyr Gly Tyr Val Ser

50 55 60

Lys Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu Gln Ser Val Asn Asp

65 70 75 80

Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr Ser Leu Leu Ala Gly

85 90 95

Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu Phe Gly Ser Gly Val

100 105 110

Lys Phe Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys Gly Glu Leu Ile Thr

115 120 125

Gly Thr Pro Lys Pro Leu Gln Gly Val Thr Asp Val

130 135 140

<210> 2

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gttactttgc catcattcaa tgatcattct tttgttaata ttactgtctc tgcggctttt 60

ggtggtcata gtggtgccaa cctcattgca tctgacacta ctatcaatgg gtttagttct 120

ttctgtgttg acactagaca atttaccatt acactgtttt ataacgttac aaacagttat 180

ggttatgtgt ctaagtcaca ggatagtaat tgccctttca ccttgcaatc tgttaatgat 240

tacctgtctt ttagcaaatt ttgtgtttca accagccttt tggctggtgc ttgtaccata 300

gatctttttg gttaccctga gttcggtagt ggtgttaagt ttacgtccct ttattttcaa 360

ttcacaaagg gtgagttgat tactggcacg cctaaaccac ttcaaggtgt cacggacgtt 420

Claims

1.重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白在检测重组猪流行性腹泻病毒抗体和/或制备检测重组猪流行性腹泻病毒抗体的试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述COE蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.No.1所示，编码所述COE蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ.ID.No.2所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述COE蛋白的制备方法为：将编码所述COE蛋白的基因克隆至真核表达载体pPIC9K中，将获得的重组表达质粒pPIC9K-COE转化入毕赤酵母GS115感受态细胞进行诱导表达，即得所述COE蛋白。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测的方法为ELISA法。

5.一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，以重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白为包被抗原，利用ELISA法进行检测。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S1所述包被液为0.05M Tris，所述重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白包被的浓度为1μg/mL，包被的条件为4℃包被11～13h。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S2所述稀释的倍数为400倍，所述反应的条件为36～38℃反应40～50min；步骤S3所述酶标二抗反应条件为36～38℃反应25～35min。

9.一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括由重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白包被的酶标板。

10.权利要求5～8任一所述方法或权利要求9所述试剂盒在检测重组猪流行性腹泻病毒抗体中的应用。