CN111879928A

CN111879928A - 一种猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN111879928A
Application number: CN202010684833.XA
Authority: CN
Inventors: 马晓霞; 马忠仁; 郭富城
Original assignee: Northwest Minzu University
Current assignee: Northwest Minzu University
Priority date: 2020-07-16
Filing date: 2020-07-16
Publication date: 2020-11-03
Anticipated expiration: 2040-07-16
Also published as: CN111879928B

Abstract

本发明实施例提供了一种猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒，包括SEQ ID No:1所示的多肽包被的ELISA检测板、血清稀释液、洗涤液、二抗、化学发光剂；采用所述试剂盒通过包被可溶性抗原多肽，直接检测猪血清中的猪流行性腹泻病毒N蛋白抗体，实现猪流行性腹泻病毒的快速准确检测。此外，采用本申请的试剂盒，以可溶性多肽包作为包被抗原，结合化学发光检测法，使采用所述试剂盒检测猪流行性腹泻病毒抗体具有更高的灵敏度和准确性。

Description

一种猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及ELISA检测技术领域，特别是涉及一种猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒及其应用。

背景技术

猪流行性腹泻病(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrheavirus，PEDV)引起的疾病，其症状与猪的传染性胃肠炎(TGE)相似，主要包括腹泻，呕吐，厌食，脱水，和仔猪体重减轻等。尽管各年龄段猪均可感染并出现不同程度的症状，但仔猪病情特别严重，其中死亡率高达100％。

目前猪流行性腹泻在实验室的检测方法主要有：酶联免疫吸附试验(enzymelinked immunosorbent assay ELISA)、环介导等温扩増技术(loop-mediated isothermalamplification LAMP)和聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction PCR)等，其中酶联免疫吸附技术相对成熟，准确性相对较高，并且反应时间短，其操作简单，仪器试剂成本较低。

目前已经商品化的ELISA检测试剂盒用于检测猪流行性腹泻病毒需要大概3小时，且ELISA检测的数据阴阳性跨度小，有很大一部分可疑区间，检测准确性不够高，因此，需要发展一种新的ELISA检测试剂盒。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒，以实现猪流行性腹泻病毒抗体的快速、准确检测。具体技术方案如下：

本申请第一方面提供了一种猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒，其包括SEQ IDNo:1所示的多肽包被的ELISA检测板、血清稀释液、洗涤液、二抗、化学发光剂；

其中，所述多肽为可溶性多肽；所述二抗为辣根过氧化物酶标记的抗猪IgG。

本申请第二方面提供了SEQ ID No:1所示的多肽在制备猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒中的应用，其中，所述多肽为可溶性多肽。

本发明提供的猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒，通过包被可溶性抗原多肽，直接检测猪血清中的猪流行性腹泻病毒N蛋白抗体，实现猪流行性腹泻病毒的快速准确检测。此外，采用本申请的试剂盒，以可溶性多肽包作为包被抗原，结合化学发光检测法，使采用所述试剂盒检测猪流行性腹泻病毒抗体具有更高的灵敏度和准确性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为pGEX-4T-1质粒载体的质粒图谱；

图2为重组质粒转化感受态大肠杆菌后，蛋白表达的SDS-PAGE结果；

图3为重组质粒转化感受态大肠杆菌后，蛋白表达的Western bloting结果；

图4A为猪血清样品的ROC曲线；

图4B为图4A的背景交互点图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

发明人在研究中发现，SEQ ID No:1所示的多肽中存在多个构象表位，能够与猪血清中的猪流行性腹泻病毒抗体发生特异性结合，并基于此，实现对猪流行性腹泻病毒抗体的检测。本申请的试剂盒中，所述多肽为可溶性多肽，与包涵体形式的多肽相比，其与抗体的结合效率更高，特异性更强，因此采用所述可溶性多肽的试剂盒，对猪流行性腹泻病毒抗体具有更高的特异性和灵敏度。进一步地，本申请的试剂盒中采用化学发光显色，灵敏度高、反应时间短、操作简单，其与本申请的间接法ELISA相结合，使检测具有更高地灵敏度和准确性。

所述可溶性多肽的氨基酸序列如下：

MASVSFQDRG RKRVPLSLYA PLRVTNDKPL SKVLANNAVP TNKGNKDQQIGYWNEQIRWRMRRGERIEQP SNWHFYYLGTGPHGDLRYRT RTEGVFWVAK EGAKTEPTNLGVRKASEKPIIPKFSQQLPS VVEIVEPNTP PASRANSRSR(SEQ ID No:1)

本申请对ELISA检测板的选择不做限定，只要能够实现本发明的目的即可，例如可以选自本领域常用的酶标板，或可拆卸酶标板。

本申请中SEQ ID No:1所示的多肽包被的ELISA检测板可采用常规的ELISA检测板的制备方法制备，本申请在此不做限定，在本申请的一些实施方式中，可通过以下方法制备：

(1)以含有1.0-4.0μg/ml所述多肽的碳酸盐缓冲溶液为包被液，2-8℃包被所述ELISA检测板1-12小时；

(2)PBST清洗3-5次；

(3)以40-60mg/100mL的脱脂奶粉PBST溶液为封闭液，35-38℃下封闭清洗后的ELISA检测板0.5-2小时；

(4)PBST清洗3-5次，干燥。

本申请中的碳酸盐缓冲溶液为本领域常用碳酸盐缓冲液(CBS)，其配方为本领域公知常识，本申请在此不做限定，示例性的，本申请的CBS可采用Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃2.93g，溶于蒸馏水中，定容至1L，pH 9.6，4℃保存。

本申请中所采用的洗涤液可以为ELISA检测中常用的洗涤液，本申请在此不做限定，示例性的，可以为PBST溶液，发明人在研究中发现，当采用含有体积分数为0.05-0.2％Tween-20的磷酸缓冲液(PBS)作为洗涤液时，检测结果具有更好的特异性，不限于任何理论，这可能是由于，当PBST中的Tween-20的体积分数为0.05-0.2％时，能够有效地去除非特异性吸附的蛋白质，从而使检测结果的准确性、特异性更高。

本申请中所采用的血清稀释液为本领域常用的血清稀释液，本申请在此不做限定，示例性地，可以采用40-60mg/mL的脱脂奶粉的PBST溶液，其中脱脂奶粉采用市售的脱脂奶粉即可。

以上所述PBS的配方为本领域常规配方，示例性地，本领域通常配备的5×PBS溶液配方如表1所示：

表1

使用时，以水稀释5倍使用。

本申请中所述的辣根过氧化物酶标记的抗猪IgG可以选自来自不同物种的抗猪IgG，例如兔抗猪IgG，鼠抗猪IgG等，只要能够实现本发明的目的即可，本申请在此不做限定。辣根过氧化物酶标记的抗猪IgG可通过商业途径获得。

本申请中所采用的化学发光剂为本领域常用的辣根过氧化物酶的发光底物，本领域技术人员可根据需要具体选择，本申请在此不做限定。在本申请的一些实施方式中，所述化学发光剂可选自鲁米诺或其衍生物、双(2,4,6-三氯苯基)草酸酯、光泽精或KMnO₄中的至少一种，这些发光底物均可可购自商业途径，其使用方法可根据产品说明书进行操作，本申请在此不做限定。

在本申请第一方面的一些实施方式中，还包括发光增强剂，所述发光增强剂选自对碘苯酚、对苯基苯酚、肉桂酸中的至少一种。发光增强剂为本领域常用试剂，其作用是增强辣根过氧化物酶催化化学发光剂发光的强度。发光增强剂可购自商业途径，其使用方法可依据商品使用说明书，本申请在此不做限定。

在本申请第一方面的一些实施方式中，所述多肽通过以下方法制备：

(1)以SEQ ID No:2所示的DNA片段为模板，以SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的DNA片段作为引物，进行PCR扩增，获得上下游分别引入BamHⅠ和Xho I酶切位点的DNA片段；

(2)将PCR扩增得到的DNA片段与pGEX-4T-1载体重组获得重组质粒；

(3)以所述重组质粒转化感受态大肠杆菌后，扩增培养，待OD600值达到0.6-0.8之间，加入终浓度为0.3-0.5mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷进行诱导表达，6-8小时后收集菌体；所述大肠杆菌选自BL21(DE3)、BL21(DE3)ply或Rosetta(DE3)；

(4)将收集的菌体进行超声破碎，10000-15000rpm离心5-15分钟，取上清液；

(5)对上清液中的蛋白进行纯化，获得所述多肽。

本申请中，所述的OD600值是指菌液在600nm波长处的吸光值。吸光值正比于菌液的浓度。

不限于任何理论，发明人在研究中发现，外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，目标蛋白可能会形成包涵体。包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性。本申请的发明人通过选择合适的载体，以特定的酶切位点将经过优化的目标基因连接入载体的特定位置，同时选择合适的宿主菌培养条件，获得了可溶性的目标肽段。

其中，优化的目标基因序列如下：

5’-GGC AGC ATG GCG AGC GTG AGC TTT CAG GAT CGT GGC CGT AAA CGT GTGCCG CTG AGC CTG TAT GCG CCG CTG CGC GTG ACC AAC GAT AAA CCG CTG AGC AAA GTGCTG GCG AAT AAT GCG GTG CCG ACC AAC AAA GGC AAC AAA GAT CAG CAG ATT GGC TATTGG AAC GAA CAG ATT CGC TGG CGC ATG CGC CGC GGC GAA CGC ATT GAA CAG CCG AGCAAC TGG CAT TTT TAT TAT CTG GGC ACC GGC CCG CAT GGC GAT CTG CGC TAT CGC ACCCGC ACC GAA GGC GTG TTT TGG GTG GCG-3’(SEQ ID No:2)。

所述优化的目标基因与所述多肽的天然编码序列相比，存在多个突变位点，发明人发现，以所述优化的目标基因表达，在本申请的表达体系中，能够获得可溶性目标多肽。

本申请的引物分别提供了BamHⅠ和Xho I酶切位点，其中上游引物为：5’-CCGGGATCCATGGCTTCTGTCAGCAAT-3’(SEQ ID No:3)，下游引物为：5’-CCGCTCGAGCCTGTTACGTGAGTGACT-3’(SEQ ID No:4)；以SEQ ID No:2所示的DNA片段为模板，以SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的DNA片段作为引物，进行PCR扩增，其中PCR条件可以为本领域常规的操作，本申请在此不做限定，PCR扩增过程需要的DNA聚合酶、dNTPs等试剂的选择及用量均为本领域常规选择本申请在此不做限定。

不限于任何理论，发明人在研究中还发现，不同的载体影响目标多肽的表达速度，本申请采用pGEX-4T-1质粒载体(质粒图谱如图1所示)，获得的重组质粒在大肠杆菌中的表达速度有利于可溶性多肽的产生。

本申请中，PCR扩增得到的DNA片段与pGEX-4T-1载体通过BamHⅠ和Xho I DNA内切酶进行双酶切、连接，获得重组质粒的方法为本领域常规操作，本申请在此不做限定。

本申请中所述的感受态大肠杆菌是外源蛋白表达常用的感受态大肠杆菌，本申请在此不做限定，在本申请的一些实施方式中，所述感受态大肠杆菌可以选自BL21(DE3)、BL21(DE3)ply或Rosetta(DE3)，发明人发现，采用BL21(DE3)、BL21(DE3)ply或Rosetta(DE3)，尤其是采用BL21(DE3)，更有利于本申请的可溶性多肽的表达。其中，所述感受态大肠杆菌可购自商业途径。

转化后大肠杆菌的扩增培养为本领域常用技术手段，本申请在此不做限定，示例性地，转化后的大肠杆菌先在固体LB培养基中培养获得单克隆，再在液体培养基中扩增培养，培养条件以及培养基为本领域常规操作，本申请在此不做限定。

本申请中，对收集的菌体进行超声破碎为本领域常规操作，示例性地，超声破碎条件可以为：功率250w，超声5s暂停10s，持续30min。超声后的样品于10000-15000rpm离心5-15分钟，取上清液。发明人在研究中发现，当采用所述超声破碎条件以及离心条件时，更容易获得本申请的可溶性多肽。需要说明的是，本申请的多肽为可溶性多肽，菌体破碎后多肽存在于上清液中，而包涵体形式存在的多肽在超声破碎后存在于沉淀中，因此，本申请在离心后取上清液进行蛋白纯化。

在本申请第一方面的一些实施方式中，步骤(4)中的纯化为镍柱亲和层析纯化。镍柱亲和层析纯化为本领域常规操作，本申请在此不做限定。

本申请所提供的试剂盒可以通过以下步骤检测猪流行性腹泻病毒抗体：

(1)将待测猪血清样品与所述血清稀释液以1：(50-800)体积比混合；

(2)将稀释后的血清样品分别加入所述ELISA检测板的不同检测孔中，35-38℃下，反应20-40分钟；

(3)移除各血清样品，以所述洗涤液清洗各检测孔3-5次；

(4)向各检测孔中加入二抗溶液，35-38℃，孵育5-15分钟；所述二抗溶液的浓度为1-2μg/ml；

(5)移除二抗溶液，以所述洗涤液清洗各检测孔3-5次；

(6)向各检测孔中加入化学发光剂，反应3-10分钟；

(7)检测各检测孔的发光值。

本申请中，二抗可购自商业途径，二抗可根据产品说明书进行稀释和使用。以sigma的辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG为例，使用时通常以PBST为溶剂，以体积比1：10000-1:80000稀释后，制备二抗的PBST溶液使用。

在本申请一些实施方式中，步骤(1)中，将待测猪血清样品与所述血清稀释液以1：(50-400)体积比混合。

在本申请一些实施方式中，当所述试剂盒中包括发光增强剂时，步骤(6)中，化学发光剂与所述发光增强剂预先以体积比1：(0.5-2)混合。

本申请中，各检测孔的发光值可以通过本领域的常规手段进行检测，本申请在此不做限定，例如可以采用PerkinElmer的化学发光仪。

实施例1 重组质粒制备

试剂耗材：模板DNA(浓度300ng/μl)、引物(浓度10μM)由上海生工公司合成；BamHⅠ、Xho I购自Takara；PCR酶购自Takara；dNTP Mix购自Takara；LA Taq酶购自Takara；DH5α购自北京全式金生物科技有限公司；琼脂凝胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；质粒提取试剂盒购自赛默飞。

LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，用NaOH调节pH至7.4；LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L。

(1)以SEQ ID No:2所示的DNA片段为模板，以SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的DNA片段作为引物，进行PCR扩增，扩增体系见表2：

表2

扩增条件：95℃5min；94℃30s；57℃30s；72℃90s；72℃10min；35个循环。

(2)将PCR产物与pGEX-4T-1载体分别用BamHI和XhoI在37℃下双酶切3小时，

双酶切体系如下：

PCR产物酶切体系

载体pGEX-4T-1酶切体系

酶切产物用琼脂凝胶回收试剂盒进行纯化，并测定浓度。

纯化后的酶切产物4℃连接过夜：

连接体系

(3)将连接完的产物全部加入到感受态大肠杆菌中(DH5α)，冰浴20min，然后42℃热激60s，再冰浴2min，然后加入500μL无抗LB培养基，于恒温摇床37℃培养40min，之后2000g离心1min，弃掉上层培养基留下100μL菌液，吸取菌液至含有100μg/ml氨苄青霉素的固体LB培养基平板上涂布均匀，于37℃恒温培养箱中，倒置培养12-16h。

(4)挑取培养基上的单个菌落，接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，在恒温摇床中37℃培养过夜，使用质粒提取试剂盒提取重组质粒。

实施例2 多肽制备

BL21(DE3)感受态细胞购自上海生工；IPTG购自北京索莱宝；Western blot一抗购自sigma，货号G1160；Western blot二抗购自sigma，货号A9044；镍柱购自碧云天生物技术公司，型号P2253；

(1)取实施例1制备的重组质粒10μL，与BL21(DE3)感受态细胞冰浴20min，然后42℃热激60s，再冰浴2min，然后加入500μL无抗LB培养基中，于恒温摇床37℃培养40min，之后2000g离心1min，弃掉上层培养基留下100μL菌液，均匀涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的固体LB培养基平板上，于37℃恒温培养箱中，倒置培养12-16h。

(2)挑取单克隆接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，在恒温摇床中37℃培养过夜，待OD600值达到0.6-0.8之间，加入终浓度为0.4mmol/L IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)进行诱导表达6小时。

(3)收集诱导表达后的菌体，超声破碎：功率250w，超声5s暂停10s，持续30min。超声后的样品于12000rpm离心10分钟，取上清；上清中的蛋白SDS-PAGE结果已经Westernblot鉴定结果分别如图2和图3所示，未经过重组的pGEX-4T-1质粒转化BL21(DE3)作为阴性对照，从图2中可以看出，转化重组质粒后的大肠杆菌表达大量的可溶性目标肽段(图2中标识2)，Western blot结果证明转化后的细菌中有可溶性目标蛋白的表达(图3中标识1)。

(4)上清液中的蛋白使用镍柱进行亲和层析纯化：

将步骤(3)中获得的上清液全部注入镍柱中，将柱子于4℃颠倒混匀半小时，以较缓慢的流速收集流出液；

用10倍柱体积的PBS(pH7.3)洗涤柱子，以除去杂蛋白；

加入10-15mL的洗脱缓冲液(0.05M Tris-HCL，0.01M GSH，pH8.0)，颠倒使之于介质混匀，置于冰中，自然沉降，以0.5mL/min的流速洗脱，收集洗脱液。

实施例3 ELISA检测板包被

(1)取实施例2中镍柱纯化获得的洗脱液，以CBS稀释至蛋白浓度为2.0μg/ml，作为包被液，以每孔100μL，37℃包被酶标板2小时；

(2)PBST清洗5次；

(3)以5％(即50mg/ml)的脱脂奶粉PBST溶液为封闭液，37℃下封闭1小时；

(4)PBST清洗5次，真空干燥。

实施例4 猪血清中猪流行性腹泻病毒抗体检测

二抗购自sigma；化学发光剂购自索莱宝生物，货号L8180；

(1)将待测猪血清样品与所述血清稀释液以1：100体积比混合；

(2)将稀释后的血清样品100μL，加入所述ELISA检测板的不同检测孔中，37℃下，反应30分钟；

(3)移除各血清样品，以所述洗涤液清洗各检测孔5次；

(4)将二抗以PBST稀释至1:20000；向各检测孔中加入二抗溶液，37℃，孵育10分钟；

(5)移除二抗溶液，以所述洗涤液清洗各检测孔5次；

(6)向各检测孔中加入化学发光剂100μL，反应3-10分钟；

(7)PerkinElmer的化学发光仪中检测各检测孔的发光值。

实施例5 临界值、诊断敏感性、诊断特异性的判定

(1)随机取猪血清样品200份，通过商品化试剂盒(IDVEG)检测，将检测结果为阳性的样品编为0号组，检测结果为阴性的样品编为1号组；

(2)以实施例4的检测方法再次检测所述200份猪血清样品，PerkinElmer化学发光仪中检测各样品的发光值，采用MedCalc-ROCcurve软件绘制ROC曲线，结果如图4A所示，图4B为图4A的背景交互点图(其中，横坐标中，0代表阳性血清，1代表阴性血清)。从图4B中可以看出，当样品的发光值为25434时，有最优的诊断结果，诊断的敏感性为95.2％，特异性为94.1％，因此本申请的方法以25434为临界值，发光值高于25434为阳性结果，低于25434为阴性结果。

实施例6 重复性鉴定

六个已知背景的血清样品通过实施例4的方法进行检测，其中，以同一批次的5个不同包被板分别同时检测所述六个样品，验证批内重复性；以5个不同批次的包被板，分别同时检测所述六个样品，验证批间重复性；六组样品发光值的平均值、标准差及变异系数结果如表3所示，可以看出，批内、批间变异系数均小于17％，该方法有较好的重复性。

表3

本发明的猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒，用以检测PEDV抗体，全程检测时间为1h左右，与现有的商品化的ELISA检测试剂盒(需要约3小时)相比，大大缩短了检测时间。通过实施例4的方法，对标准PEDV阳性血清(抗体效价1:1024)和标准PEDV阴性血清进行发光值检测，标准PEDV阳性血清与标准PEDV阴性血清发光值的比值P/N为100，而现有普通间接ELISA检测方法的P/N值一般在10左右，可见本申请的方法阴阳性值差距大，区分明显，进一步说明本申请的方法具有较高的灵敏度和准确性。该方法批间批内的变异系数均在20％以内，说明本方法还具有良好的重复性。同时该试剂盒所需要的样品量少操作方法简便快捷，其造价成本低廉，适合用于临床检测。

本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 西北民族大学

<120> 一种猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒及其应用

<130> PP205709

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 150

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Ser Val Ser Phe Gln Asp Arg Gly Arg Lys Arg Val Pro Leu

1 5 10 15

Ser Leu Tyr Ala Pro Leu Arg Val Thr Asn Asp Lys Pro Leu Ser Lys

20 25 30

Val Leu Ala Asn Asn Ala Val Pro Thr Asn Lys Gly Asn Lys Asp Gln

35 40 45

Gln Ile Gly Tyr Trp Asn Glu Gln Ile Arg Trp Arg Met Arg Arg Gly

50 55 60

Glu Arg Ile Glu Gln Pro Ser Asn Trp His Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr

65 70 75 80

Gly Pro His Gly Asp Leu Arg Tyr Arg Thr Arg Thr Glu Gly Val Phe

85 90 95

Trp Val Ala Lys Glu Gly Ala Lys Thr Glu Pro Thr Asn Leu Gly Val

100 105 110

Arg Lys Ala Ser Glu Lys Pro Ile Ile Pro Lys Phe Ser Gln Gln Leu

115 120 125

Pro Ser Val Val Glu Ile Val Glu Pro Asn Thr Pro Pro Ala Ser Arg

130 135 140

Ala Asn Ser Arg Ser Arg

145 150

<210> 2

<211> 303

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggcagcatgg cgagcgtgag ctttcaggat cgtggccgta aacgtgtgcc gctgagcctg 60

tatgcgccgc tgcgcgtgac caacgataaa ccgctgagca aagtgctggc gaataatgcg 120

gtgccgacca acaaaggcaa caaagatcag cagattggct attggaacga acagattcgc 180

tggcgcatgc gccgcggcga acgcattgaa cagccgagca actggcattt ttattatctg 240

ggcaccggcc cgcatggcga tctgcgctat cgcacccgca ccgaaggcgt gttttgggtg 300

gcg 303

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgggatcca tggcttctgt cagcaat 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgctcgagc ctgttacgtg agtgact 27

Claims

1.一种猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒，其包括SEQ ID No:1所示的多肽包被的ELISA检测板、血清稀释液、洗涤液、二抗、化学发光剂；

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述化学发光剂选自鲁米诺或其衍生物、双(2,4,6-三氯苯基)草酸酯、光泽精或KMnO₄中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，还包括发光增强剂，所述发光增强剂选自对碘苯酚、对苯基苯酚或肉桂酸中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述多肽通过以下方法制备：

(2)将PCR扩增得到的DNA片段与pGEX-4T-1载体重组获得重组质粒；

(3)以所述重组质粒转化感受态大肠杆菌后，扩增培养，待OD600值达到0.6-0.8之间，加入终浓度为0.3-0.5mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷进行诱导表达，6-8小时后收集菌体；

(5)对上清液中的蛋白进行纯化，获得所述多肽。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，所述感受态大肠杆菌选自BL21(DE3)、BL21(DE3)ply或Rosetta(DE3)。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，步骤(5)中的纯化为镍柱亲和层析纯化。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述多肽包被的ELISA检测板通过以下方法制备：

(1)以含有1.0-4.0μg/ml所述多肽的碳酸盐缓冲溶液为包被液，2-8℃包被所述ELISA检测板8-12小时；

(2)PBST清洗3-5次；

(3)以40-60mg/ml的脱脂奶粉PBST溶液为封闭液，35-38℃下封闭清洗后的ELISA检测板0.5-2小时；

(4)PBST清洗3-5次，干燥。

8.SEQ ID No:1所示的多肽在制备猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒中的应用，其中，所述多肽为可溶性多肽。