CN108956988B - 一种羊口疮病毒抗体间接elisa检测试剂盒、检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明还公开了一种羊口疮病毒抗体间接ELISA检测试剂盒、检测方法及应用，该检测方法中涉及一种试剂盒，所述试剂盒以ORFV‑B2Ls表达蛋白为包被抗原。本发明表达并纯化了可性的B2L蛋白表达,使其具有良好的生物学活性；本发明可用于羊口疮病毒抗体的检测。

Description

一种羊口疮病毒抗体间接ELISA检测试剂盒、检测方法及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种羊口疮病毒抗体间接ELISA检测试剂盒、检测方法及应用。

背景技术

目前，国内外报到的羊口疮检测方法分为抗体和抗原检测。抗体检测如酶联免疫吸附试验、中和试验、琼脂扩散试验等。抗原检测方法有病毒分离、RT-PCR技术、免疫荧光技术和核酸杂交技术等。病毒分离、血清中和实验、等方法耗时时费力，RT-PCR，电镜观察等需要专业人员，不适宜在牧区使用。ELISA方法操作简便，耗时短，特异性和灵敏度较高，是目前比较理性检测方法。但是目前ELISA方法只适用于实验室检测，目前还没有供于临床检测的试剂盒，所以开发高效、敏感的ELISA试剂盒尤为重要。

B2L基因长1137bp，编码的蛋白大小为41.67Da，此蛋白是ORFV的主要囊膜蛋白。为重要的保护性抗原基因，利用基因重组羊传染性脓泡病毒病毒囊膜亚单位中的其它保护性抗原基因，为研制有效的基因工程苗提供了实验依据和理论基础。

针对于ORFV的检测目前我国还没有被批准的商业化检测试剂盒。现有技术中庞文静和张海瑞等人在都沉淀中表达并纯化了B2L蛋白，以B2L蛋白作为包被抗原建立ELISA方法，包涵体形式的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种羊口疮病毒抗体间接ELISA检测试剂盒、检测方法及应用。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种羊口疮病毒抗体间接ELISA检测试剂盒，所述试剂盒以ORFV-B2Ls表达蛋白为包被抗原。

可选地，所述ORFV-B2Ls表达蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

可选地，所述ORFV-B2Ls表达蛋白通过以下方法制备得到：选取B2L基因的第166-第351核苷酸的序列，运用密码子偏好性分析工具VisualGeneDeveloper软件进行基因序列优化，运用E.coli Codon Usage Analyzer 2.1在线软件分析B2Ls在大肠杆菌表达系统中的密码子适应指数，将优化好的B2L基因命名为B2Ls，将该序列合成并连接到原核表达载体pET-32a(+)，酶切位点分别为BamHI和HindⅢ，转化至宿主菌E.coli BL21(DE 3)中，于氨苄青霉素抗性的平板上选择单个疑似阳性菌落接种LB液体培养基，提取质粒经双酶切鉴定并测序正确的保菌；将重组菌接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，摇菌；离心收集菌体，破碎处理，收集上清，按GE Ni Sepharose 6Fast Flow说明书纯化上清蛋白，得到ORFV-B2Ls表达蛋白。

可选地，所述试剂盒中包被抗原的包被浓度为4ng/ml。

可选地，所述试剂盒包括封闭液，所述封闭液为5％脱脂奶乳。

可选地，所述试剂盒还包括酶标二抗，所述酶标二抗为HRP标记的二抗，酶标二抗的稀释度为1:4000。

本发明还公开了一种羊口疮病毒抗体间接ELISA检测方法，包括以下步骤：

(1)抗原包被：用包被液稀释权利要求1所述的ORFV-B2Ls表达蛋白至适当浓度，100μl每孔，室温包被2h；加PBST洗涤液洗涤3次，200μl每孔；

(2)封闭：每孔加入封闭液200μl，4℃过夜封闭，弃去液体，同上洗涤；

(3)加入一抗：将一抗使用PBST稀释，配制成抗体稀溶液作为待检血清稀释液，使用待检血清稀释液稀释样品，加入酶标板中，100μl每孔，室温孵育2h，弃去液体，同上洗涤；

(4)加HRP标记的二抗：将HRP标记的二抗稀释至1:4000，100μl每孔，室温孵育45min，弃去液体，同上洗涤；

(5)显色：每孔加100μl的TMB显色液，室温避光反应20min；

(6)终止反应：每孔加入50μl 2M H2SO4终止液。

(7)读数：于ELISA酶标仪读取OD₄₅₀nm吸光度数值。

本发明还公开了一种上述的试剂盒在检测羊口疮病毒抗体中的应用。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)截短表达了B2L蛋白，使其易于表达及纯化而不失其免疫原性。

2)根据原核表达系统密码子偏好性对截短B2L蛋白进行了密码子优化筛选，提高外源活性蛋白的表达。

3)表达并纯化了可溶性的B2L蛋白表达,使其具有良好的生物学活性。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明E.coli Codon Usage Analyzer 2.1分析密码子优化结果；

图2是本发明截短B2Ls蛋白的位置及生物信息学分析，(1)为截短片段在B2L蛋白全长中的位置，(2)为详细的B2Ls生物信息学分析；

图3是本发明B2Ls纯化结果；其中，M代表100KD预染Marker，1代表纯化后B2Ls洗脱液；

图4是本发明western bloting鉴定结果；其中，M代表100KD预染Marker，1代表阳性对照，2代表B2Ls目的条带。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

QuickCutTM HindⅢ、QuickCutTM BamHⅠ均购自宝生物(大连)工程有限公司；质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；镍柱购自北京全式金生物技术有限公司；原核表达载体PET-32a(+)购自美国Novagen公司；Binding Buffer和Elution Buffer均购自生工生物工程(上海)有限公司；蛋白Maker、蛋白预染Maker购自Thermo公司；PVDF膜购自Bio Rad；Ant-6X His antibody(一抗)购自上海生工；山羊抗兔抗体(二抗)、蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、BeyoECL Plus均购自碧云天；其他试剂均为标准化学分析纯试剂。DH5α、BL21(DE3)感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司。

实施例1 ORFV-B2Ls表达蛋白的原核表达、纯化及鉴定

(1)B2Ls基因生物信息学分析：利用DNAstar等软件及在线服务器对ORFV B2L基因进行分析，预测该基因编码蛋白的大小为15KD、无信号肽、抗原性好、亲水性高。

(2)密码子优化合成及重组载体的构建：根据生物信息学分析，截取抗原性、亲水性等较好的B2L基因片段(如图2所示)，故选取第166-第351核苷酸的序列。为了提高B2L蛋白在大肠杆菌中的表达水平，运用密码子偏好性分析工具VisualGeneDeveloper软件进行基因序列优化。运用E.coli Codon Usage Analyzer 2.1在线软件分析B2Ls在大肠杆菌表达系统中的密码子适应指数，如图1所示，结果显示密码子适应指数(CAI)为1(CAI数值为0-1，越接近1适应性越好)。将优化好的B2L基因命名为B2Ls，将该序列委托于吉林省库美生物有限公司合成并连接到原核表达载体pET-32a(+)，酶切位点分别为BamHI和HindⅢ，转化至宿主菌E.coli BL21(DE 3)中，于氨苄青霉素抗性的平板上选择单个疑似阳性菌落接种LB液体培养基，提取质粒经双酶切鉴定并测序正确的保菌。

(3)重组菌诱导表达及纯化：将步骤(2)中保存的重组菌接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，摇菌。离心收集菌体，破碎处理，收集上清，通过SDS-PAGE分析评估蛋白在不同条件下的表达水平，为选择最佳诱导条件提供参考。按GE Ni Sepharose 6Fast Flow说明书纯化上清蛋白，得到ORFV-B2Ls表达蛋白(如图3所示)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

(4)Western Blot鉴定：用BCA蛋白定量检测试剂盒测定步骤(3)中讲述的上清蛋白含量。将蛋白上清进行SDS-PAGE后，将蛋白转印到硝酸纤维素膜上，用5％脱脂乳常温封闭2h，以anti-his为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗，进行Western Blot分析，鉴定结果如图4所示。

实施例2 制备羊阳性血清用原核表达的ORFV-B2Ls蛋白上清免疫羔羊，制备羊的阳性血清。

实施例3 ORFV-B2Ls ELISA抗体检测方法的建立

以上述步骤(3)中提纯的ORFV-B2Ls表达蛋白为抗原，用步骤(4)制备的阴、阳性标准血清为抗体，通过方阵滴定实验确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度。以方阵滴定确定的抗原最佳浓度包被酶标板，进行该ELISA检测方法各最适反应条件的确定。

1、ORFV-B2Ls表达蛋白间接ELISA方法的优化

(1)最佳抗原包被浓度以及血清稀释度确定：BCA测定结果显示重组蛋白原始浓度为110ug/ml，用包被液稀释纯化的B2Ls蛋白至适当浓度，100μl每孔，室温包被2h；加PBST洗涤液洗涤3次，200μl每孔。通过棋盘法确定最佳抗原包被浓度和最佳的血清稀释度。结果表明(表1和表2)，当包被抗原浓度为4ng/mL，血清稀释度为1:8000，阳性血清的OD_450nm值可达1.428，而阴性血清的OD_450nm值为0.088，阳性和阴性血清的OD_450nm值比值最大(P/N＝16.22)。因此，4ng/mL为抗原最佳包被浓度，1:8000为最佳血清稀释度。

表1 最佳包被量确定

表2 最佳血清稀释度确定

(1)其中，蛋白最佳包被量为：4ng/ml；阴阳性血清稀释度为1:8000。

(2)最佳稀释液的确定：将抗原以最佳包被浓度4ng/mL，室温包被2h，分别以5％脱脂乳、5％BSA、10％PEG6000、1％明胶室温封闭2h，按照上述步骤进行间接ELISA。结果见表3确定该最佳封闭液为5％脱脂奶乳。

表3 最佳封闭液的确定

其中，最佳稀释液为5％脱脂奶乳。

2、羊口疮病毒抗体间接ELISA检测方法的建立：

(1)抗原包被：用包被液稀释纯化的B2Ls蛋白至4ng/mL，100μl每孔，室温包被2h；加PBST洗涤液洗涤3次，200μl每孔；

(2)封闭：每孔加入封闭液200μl，4℃过夜封闭，弃去液体，同上洗涤；

(3)加入一抗：将一抗使用PBST稀释，配制成适当稀释度的抗体稀溶液作为待检血清稀释液，使用待检血清稀释液稀释样品，加入酶标板中，100μl每孔，室温孵育2h，弃去液体，同上洗涤；

(4)加HRP标记的二抗：将HRP标记的二抗稀释至1:4000，100μl每孔，室温孵育45min，弃去液体，同上洗涤；

(5)显色：每孔加100μl的TMB显色液，室温避光反应20min；

(6)终止反应：每孔加入50μl 2M H₂SO4终止液。

(7)读数：于ELISA酶标仪读取OD₄₅₀nm吸光度数值。

实施例4羊口疮病毒抗体间接ELISA检测方法的评价

1、阴阳性临界值的确定

对40份ORFV阴性血清进行检测，获得结果(表4)最大值为0.078，最小值为0.053，用阴性对照平均吸光度(>20孔)的两倍作为阳性判定标准，阴性血清平均OD值为：0.068，可得其临界值为：0.136。

表4 临界值的确定

其中，血清稀释度为1:8000；所得阴阳性临界值OD为0.136。

2、敏感性试验

取一份ORFV阳性血清从1：8000开始进行倍比稀释，以能检测出阳性最大的稀释倍数作为灵敏度。分别设置1:8000、1：16000、1：20000、1：32000的稀释倍数。由表5可知，因1：32000倍稀释的阳性血清获得的OD值略小于临界值，所以最大1:20000倍稀释的阳性血清能被检出。

表5 敏感性试验

3、重复性实验

羊口疮病毒ELISA抗体检测试剂盒的重复性试验，选择8份血清，4份阳性血清，4份阴性血清，每份设3个重复来检测板内重复性，选择3个包被的酶标板对8份血清进行检测来确定板间重复性。批内重复性试验变异系数CV值在2.27％～6.4％。批间重复性试验变异系数CV值在2.37％～8.42％。批内和批间检测结果重复性良好，说明该试剂盒制造工艺和检验方法可靠，具有良好的可重复性，适合产业化和临床检测要求。(变异系数＝标准差/平均数×100％)详见表6、表7。

表6 检测批内变异系数结果

表7 检测批间变异系数结果

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 内蒙古农业大学

<120> 一种羊口疮病毒抗体间接ELISA检测试剂盒、检测方法及应用

<130> 2018

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 192

<212> DNA

<213> 羊口疮病毒(Orf virus)

<400> 1

atgaacctgt cttctaccaa agaaggtgtt gacgttaaag acaaactgtg caccctggct 60

aaagaaggtg ttgacgttac cctgctggtt gacgttcagt ctaaagacaa agacgctgac 120

gaactgcgtg aagctggtgt taactactac aaagttaaag tttctacccg tgaaggtgtt 180

ggtaacctgt aa 192

<210> 2

<211> 63

<212> PRT

<213> 羊口疮病毒(Orf virus)

<400> 2

Met Asn Leu Ser Ser Thr Lys Glu Gly Val Asp Val Lys Asp Lys Leu

1 5 10 15

Cys Thr Leu Ala Lys Glu Gly Val Asp Val Thr Leu Leu Val Asp Val

20 25 30

Gln Ser Lys Asp Lys Asp Ala Asp Glu Leu Arg Glu Ala Gly Val Asn

35 40 45

Tyr Tyr Lys Val Lys Val Ser Thr Arg Glu Gly Val Gly Asn Leu

50 55 60

Claims (5)

1.一种羊口疮病毒抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒以ORFV-B2Ls表达蛋白为包被抗原；

所述ORFV-B2Ls表达蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；

所述ORFV-B2Ls表达蛋白通过以下方法制备得到：选取B2L基因的第166-第351核苷酸的序列，运用密码子偏好性分析工具VisualGeneDeveloper软件进行基因序列优化，运用E.coli Codon Usage Analyzer 2.1在线软件分析B2Ls在大肠杆菌表达系统中的密码子适应指数，将优化好的B2L基因命名为B2Ls，将该序列合成并连接到原核表达载体pET-32a(+)，酶切位点分别为BamHI和HindⅢ，转化至宿主菌E.coli BL21（DE 3）中，于氨苄青霉素抗性的平板上选择单个疑似阳性菌落接种LB液体培养基，提取质粒经双酶切鉴定并测序正确的保菌；将重组菌接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，摇菌；离心收集菌体，破碎处理，收集上清，按GE Ni Sepharose 6 Fast Flow 说明书纯化上清蛋白，得到ORFV-B2Ls表达蛋白；

所述试剂盒中包被抗原的包被浓度为4ng/ml。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括封闭液，所述封闭液为5％脱脂奶乳。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶标二抗，所述酶标二抗为HRP标记的二抗，酶标二抗的稀释度为1:4000。

4.一种羊口疮病毒抗体间接ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）抗原包被：用包被液稀释权利要求1所述的ORFV-B2Ls表达蛋白至适当浓度，100μl每孔，室温包被2h；加PBST洗涤液洗涤３次，200μl每孔；

（2）封闭：每孔加入封闭液200μl，4℃过夜封闭，弃去液体，同上洗涤；

（3）加入一抗：将一抗使用PBST稀释，配制成抗体稀溶液作为待检血清稀释液，使用待检血清稀释液稀释样品，加入酶标板中，100μl每孔，室温孵育2h，弃去液体，同上洗涤；

（4）加HRP标记的二抗：将HRP标记的二抗稀释至1:4000，100μl每孔，室温孵育45min，弃去液体，同上洗涤；

（5）显色：每孔加100μl的TMB显色液，室温避光反应20min；

（6）终止反应：每孔加入50μl ２M H2SO4终止液；

（7）读数：于ELISA酶标仪读取OD₄₅₀nm吸光度数值。

5.权利要求1-3任一所述的试剂盒在检测羊口疮病毒抗体中的应用。

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