CN113265005B

CN113265005B - 羊口疮病毒抗体捕捉剂及其试剂盒和检测方法与应用

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Publication number: CN113265005B
Application number: CN202110360839.6A
Authority: CN
Inventors: 鲜思美; 张友; 粟朝芝; 王徳凤; 包涛涛; 杨倩; 顾庆林; 梁倩
Original assignee: Guizhou University
Current assignee: Guizhou University
Priority date: 2021-04-02
Filing date: 2021-04-02
Publication date: 2022-09-30
Anticipated expiration: 2041-04-02
Also published as: CN113265005A

Abstract

本发明属于生物免疫学检测领域，具体涉及一种基于羊口疮病毒B2L、F1L截短融合蛋白的羊口疮病毒抗体捕捉剂及其试剂盒和检测方法与应用。编码所述羊口疮病毒抗体捕捉剂的核酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列，其0.25μg/mL浓度包被的固相载体的ELISA试剂盒检测羊口疮病毒的方法还包括：将待检测血清按照1:200倍数稀释作为一抗孵育1h，洗涤；然后加入稀释倍数1:8000±50的辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG作为二抗孵育1h，洗涤。该羊口疮病毒抗体捕捉剂及其试剂盒和检测方法对羊口疮病毒特异性强，检测灵敏度高。

Description

羊口疮病毒抗体捕捉剂及其试剂盒和检测方法与应用

技术领域

本发明属于生物免疫学检测领域，具体涉及一种基于羊口疮病毒B2L、F1L截短融合蛋白的羊口疮病毒抗体捕捉剂及其试剂盒和检测方法与应用。

背景技术

羊传染性脓疱皮炎，又名羊传染性口炎，俗称“羊口疮”，是由羊口疮病毒(orfvirus，OrfV)感染山羊或绵羊所引起的一种急性、嗜上皮性的人兽共患传染病，我国将其列为三类动物传染病。该病传染性强，发病率高，主要以接触性感染为主，感染羊只以口唇、鼻镜等皮肤部位出现红斑、脓疱、结痂等病变为特征，严重影响羊只采食，导致羊消瘦、免疫力低下，继发感染其他病原体，从而导致发病羊死亡率升高，严重阻碍了养羊业的发展。羊口疮在我国多地流行，主要分布于我国的东北、西南等养羊地区，如新疆、吉林、云南、贵州等地都有羊口疮的流行报道。随着养羊业的发展，规模化养羊加速了羊口疮的传播，同时对养羊业的经济发展影响愈发严重。

赵魁.羊传染性脓疱病毒重组DNA疫苗的构建与实验免疫研究[D].吉林大学,2010.成功构建了pCDNA3.1-ORFV 011(B2L)、pCDNA3.1-ORFV 059(F1L)和pCDNA3.1-ORFV011(B2L)-linker-ORFV(F1L)疫苗质粒；通过小鼠试验证明了pCDNA3.1-ORFV011(B2L)-linker-ORFV(F1L)疫苗质粒免疫效果优于pCDNA3.1-ORFV 011(B2L)、pCDNA3.1-ORFV 059(F1L)疫苗质粒。刘嫒.IL-2基因佐剂对羊口疮病毒核酸疫苗免疫效果的影响研究[D].贵州大学,2016成功构建真核表达质粒pVAX1-IL-2、pVAX1-F1L和pVAX1-B2L，李婷.羊口疮病毒B2L和F1L基因融合真核表达及诱导小鼠免疫原性研究[D].贵州大学,2019.成功构建真核表达质粒pVAX1-B2L-F1L，并通过免疫小鼠证明其具有良好的免疫原性。冯平,李云章,孙丰廷,等.羊口疮病毒榆林株B2L和F1L串联基因在昆虫杆状病毒系统的表达[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2018,46(06):1-8.等通过将B2L和F1L基因串联，并在昆虫杆状病毒表达系统成功获得了部分分泌型的B2L和F1L串联重组蛋白。陈晓.上海株OrfV双基因重组腺病毒的构建及免疫原性研究[D].锦州医科大学,2018.以腺病毒为载体，构建能串联表达F1L和B2L蛋白的重组腺病毒，并通过小鼠免疫试验进行免疫效果评价。

OrfV主要感染山羊和绵羊，以感染羔羊为主，但也有感染其他动物的报道，如犬、猫等，也可感染人，且感染宿主在不断扩大，是一种人兽共患传染病，威胁公共卫生安全。OrfV变异较强，因此，防控该病及其传染十分困难，在羊群中与羊相关的食源的羊口疮病毒检测是有必要的，通过抗体诊断或流行病学调查可以判断该地方的OrfV感染和流行现状，从而制定有效的防控措施。间接ELISA方法是检测OrfV抗体的重要手段，但由于目前商品化的试剂盒检测效果较差，易出现假阴性和假阳性，因此，建立一种检测OrfV抗体的间接ELISA方法非常有必要。

发明内容

有鉴于此，本发明在于提供一种羊口疮病毒抗体捕捉剂及包含其的羊口疮病毒ELISA检测试剂盒。该试剂盒检测灵敏度高，特异性强。

所述羊口疮病毒抗体捕捉剂与所述羊口疮病毒抗体特异性结合，编码所述羊口疮病毒抗体捕捉剂的核酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列。所述羊口疮病毒抗体捕捉剂的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.2所示的序列。

具体地，所述羊口疮病毒抗体捕捉剂为B2L、F1L的融合蛋白，是发明人从众多抗原中筛选并创造性的结合处出对羊口疮特异性强的融合蛋白。羊口疮病毒(OrfV)为有囊膜的线性双链DNA病毒，属于痘病毒科，副痘病毒属成员。B2L、F1L蛋白分别为OrfV的两个囊膜蛋白，具有较强的免疫原性，能够刺激动物机体产生强烈的体液免疫应答和细胞免疫应答，主要以细胞免疫应答为主，同时促进T、B淋巴细胞的增殖分化。B2L基因是OrfV的一个重要保护性抗原基因，是一种棕榈酰化(DHHC)蛋白，与痘病毒的磷脂酶蛋白(F13)属于同系物，具有较强的抗原性；F1L基因位于OrfV基因组中部，是一个重要的免疫原性基因，在病毒侵入宿主的过程中起重要作用，也能诱导宿主产生中和抗体。B2L、F1L基因分别位于羊口疮病毒第11、59个完整开放阅读框，高度保守，分别编码42kD、39kD蛋白，二者均能引起机体产生免疫应答，在羊口疮的诊断、新型疫苗的研制中具有十分重要的意义。

具体地，本发明将OrfV B2L、F1L基因截短进行融合并插入到PET-32a原核表达载体上，经IPTG诱导，成功表达出B2L-F1L融合蛋白，且以可溶性的形式存在于上清中。有研究表明蛋白中是否存在信号肽与蛋白的表达形式有关，蛋白的信号肽可以提高蛋白的可溶性表达，蛋白的活性主要取决于蛋白的合成、折叠和聚集的速率，如果蛋白的新生肽链的合成速率大于蛋白的折叠和聚集的速率，则表达出的蛋白就会以无活性的包涵体形式存在，反之则蛋白就会存在于上清中，这一研究结果与B2L-F1L融合蛋白的生物信息学分析结果基本一致。用Western-Blotting对B2L-F1L融合蛋白反应原性进行验证，结果表明该融合蛋白具有良好的反应原性。

在某些具体实施例中，所述羊口疮病毒抗体捕捉剂的制备方法包括：(1)分别截取B2L基因编码的第208位氨基酸至378位氨基酸，F1L基因编码的第2位氨基酸至182位氨基酸，并翻译成基因序列；(2)根据截取的B2L、F1L基因片段，分别设计一对引物，同时在B2L基因引物的下游5’端添加一段含10个疏水性的氨基酸多肽碱基Linker，在F1L基因引物的上游5’端添加与之完全反向互补的多肽碱基Linker；在B2L基因引物的上游5’端添加酶切位点HindШ，F1L基因引物的下游5’端添加酶切位点EcoR I；(3)分别以PMD18-T-B2L、PMD18-T-F1L克隆质粒为模板进行PCR扩增后，回收B2L、F1L目的基因，再以回收的目的基因为模板，以B2L-F和F1L-R为上下游引物进行SOE-PCR扩增后得到B2L-F1L融合基因；(4)将B2L-F1L融合基因和PET-32a原核表达载体，分别用HindⅢ、EcoRⅠ双酶切，用Solution I将B2L-F1L与PET-32a原核表达载体进行连接后培养后，提取PET-32a-B2L-F1L质粒；(5)将PET-32a-B2L-F1L质粒转化至宿主表达菌BL21(DE3)中，挑取单菌落进行扩大培养，利用IPTG诱导表达蛋白得B2L-F1L融合蛋白。优选地，经对B2L-F1L融合蛋白的诱导条件进行优化，该蛋白的最佳诱导温度为37℃，最佳IPTG终浓度为0.2mmol/L，最佳诱导时间为5h。

所述ELISA检测试剂盒包括上述的羊口疮病毒抗体捕捉剂包被的固相载体；所述羊口疮病毒抗体捕捉剂的浓度为0.25±0.05μg/mL。

优选地，所述固相载体为96孔酶标板。

进一步，所述羊口疮病毒ELISA检测试剂盒还包括待检测血清和酶标二抗；所述待检测血清稀释倍数为1:200±50；所述酶标二抗的稀释倍数为1:8000±50。

优选地，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG。

进一步，所述羊口疮病毒ELISA检测试剂盒还包括封闭液、稀释剂、洗涤剂、显色液、终止液。

优选地，所述封闭液为5±0.5％的脱脂奶粉，所述稀释剂为每1000mL的PBS溶液中加入500μL的TWeen-20，即PBST，所述洗涤剂同稀释剂一致，PBS的配制：称取Na2HPO42.9g，KH2PO40.3 g，NaCl 8g，加双蒸水定容至1000mL，用1mol/LNaOH调节至pH7.2；所述显色液为TMB显色液，所述终止液为酸性物质，包括硫酸。

进一步，所述羊口疮病毒ELISA检测试剂盒与酶标仪结合使用测算OD值，从而定量分析待检测血清。

具体地，本发明将前述的羊口疮病毒抗体捕捉剂(B2L-F1L融合蛋白)进行大量制备、纯化，作为包被抗原建立间接ELISA方法。据研究报告，影响建立ELISA方法结果的因素较多，主要与蛋白的包被浓度、包被抗原的纯度有关，若抗原的包被浓度过高，蛋白分子的结构之间发生频繁的相互作用易造成蛋白分子的多层化，洗涤时容易将蛋白洗脱掉，易使结果出现非特异性。若抗原的包被浓度过低，酶标板内的载体表面吸附的抗原量不足，使其会出现假阴性，因此，建立ELISA方法时，尽量确保包被抗原浓度的准确，包被抗原的纯度也易出现非特异和假阳性的出现。在本发明中，纯化的B2L-F1L融合蛋白的纯度较高，包被的蛋白浓度适中，因此对ELISA的检测结果影响较小，通过对阴阳性临界值的确定，没有出现假阳性和假阴性的现象；脱脂奶粉封闭时间的长短也会造成假阳性，当封闭的时间较短时，脱脂奶粉未完全封闭到酶标条载体表面，就会造成非特异性结果，出现假阳性，当封闭时间过长时，完全封闭到酶标条载体表面的脱脂奶粉发生变质，洗板时，就会将变质的蛋白洗脱掉，同样也会出现假阳性。

本发明目的在于还提供一种食源羊口疮病毒的检测方法，羊口疮病毒除了羊与羊之间会发生传染，还会不同动物之间发生传染，重要的是动物与人之间会传染。羊这种动物与人关系密切，不论是从羊毛做成衣服，还是作为肉源，还是作为羊奶等人品，都可以携带羊口疮病毒，威胁人类安全。本发明检测方法特可以通过血清样品特异性识别羊口疮病毒，且灵敏度高。

本发明选取OrfV的两个重要免疫原性基因作为研究对象，截取B2L、F1L两个基因的最佳有效抗原片段，采用重叠延伸PCR技术进行融合，通过IPTG诱导表达B2L-F1L融合蛋白，以纯化的B2L-F1L融合蛋白作为包被抗原，建立一种基于羊口疮病毒B2L、F1L重组蛋白的间接ELISA方法。本发明利用OrfV截短B2L、F1L基因进行融合，表达B2L-F1L融合蛋白作为包被抗原，通过优化反应条件，初步建立了基于OrfV的B2L、F1L蛋白的ELISA检测方法，证明了该方法具有较好的敏感性和特异性，可适用于临床血清样品OrfV抗体的检测，为羊口疮的血清学检测奠定了物质基础。

进一步，所述检测方法为间接ELISA方法，包括以下步骤：将前述的羊口疮病毒抗体捕捉剂包被于固相载体中，所述羊口疮病毒抗体捕捉剂的浓度为0.25±0.05μg/mL。

优选地，所述固相载体为96孔酶标板。

进一步，所述检测方法还包括：使用5±0.5％的脱脂奶粉封闭1±0.1h。

进一步，本发明检测标本可以是细胞裂解液、安排匀浆液、血清、血浆、细胞培育上清、尿液、唾液等其他液体生物样本。

进一步，本间接ELISA方法的检测方法优选为血清，将稀释1:200±50倍的待检测血清孵育，然后加入稀释倍数1:8000±50的酶标二抗孵育。

进一步，所述检测方法还包括：使用酶标仪读取OD₄₅₀nm值，若OD₄₅₀nm≥0.358，则所述待检测血清判定为含有羊口疮病毒；若OD_450nm≤0.295，则所述待检测血清判定为不含有羊口疮病毒；若0.295＜OD_450nm＜0.358，则所述待检测血清判定为可疑。

在某些具体实施例中，所述检测方法方法包括以下步骤：

(1)将0.25±0.05μg/mLB2L和F1L截短融合蛋白包被于酶标板中，4±0.5℃过夜，洗涤；

(2)用5±0.5％的脱脂奶粉封闭1±0.1h；

(3)将待检测血清按照1:200±50倍数稀释作为一抗孵育1±0.1h，洗涤；

(4)加入稀释倍数1:8000±50的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1±0.1h，洗涤；

(5)加入TMB显色液，避光显色15±0.5min后加入终止液；

(6)使用酶标仪读取OD₄₅₀nm值，若OD₄₅₀nm≥0.358，则所述待检测血清判定为含有羊口疮病毒；若OD_450nm≤0.295，则所述待检测血清判定为不含有羊口疮病毒；若0.295＜OD_450nm＜0.358，则所述待检测血清判定为可疑。

其中，所述稀释剂为每1000mL的PBS溶液中加入500μL的TWeen-20，即PBST，所述洗涤剂同稀释剂一致，PBS的配制：称取Na2HPO42.9 g，KH2PO40.3 g，NaCl 8g，加双蒸水定容至1000mL，用1mol/LNaOH调节至pH7.2。

进一步，所述辣根过氧化物酶标记的二抗为辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG。

本发明目的在于还提供一种组合物，所述组合物由B2L和F1L截短融合蛋白与羊口疮病毒抗体结合而成，其中，所述B2L和F1L截短融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，其浓度为0.25±0.05μg/mL。

本发明目的在于还提供一种B2L和F1L截短融合蛋白在制备羊口疮病毒ELISA检测试剂盒或羊口疮病毒ELISA检测试剂中的应用，所述B2L和F1L截短融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明中，对建立的ELISA方法的敏感性和特异性进行了验证，用建立的ELISA方法分别对羊口蹄疫(A型、O型)、口蹄疫3ABC重组蛋白、羊支原体、小反刍兽疫和布鲁氏杆菌的阳性血清进行了特异性分析，结果表明建立的ELISA方法特异性较好，没有出现交叉反应现象；对该ELISA方法的敏感性进行分析，该方法的敏感性可达到1:256，表明所建立的ELISA方法的敏感性较好。

本发明中，构建羊口疮病毒B2L-F1L融合基因，通过大肠杆菌表达B2L-F1L融合蛋白，并建立一种基于羊口疮病毒B2L、F1L蛋白的间接ELISA方法。采用DNAstar软件分析、截取B2L、F1L基因序列的主要抗原区域并设计两对引物，利用重叠延伸PCR技术将截取的B2L、F1L基因主要抗原区域进行融合，融合基因与原核表达载体PET-32a连接，构建重组质粒PET-32a-B2L-F1L，经PCR、双酶切和测序鉴定正确后，转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，通过IPTG诱导表达B2L-F1L融合蛋白，并对蛋白诱导表达条件进行优化，将获得的B2L-F1L融合蛋白经Ni柱纯化后，进行Western-Blot鉴定。以纯化的B2L-F1L重组蛋白为包被抗原，通过方正滴定法进行了间接ELISA方法反应条件优化，建立检测羊口疮病毒抗体的ELISA诊断方法。结果显示，成功构建了B2L-F1L融合基因，大小约为1080bp，与预期目的片段大小相符；通过IPTG诱导获得了大小约为39KD的B2L-F1L融合蛋白，且该融合蛋白的最佳诱导温度为37℃、最佳IPTG终浓度为0.2mmol/L，最佳诱导时间为5h；Western-Blot结果显示B2L-F1L融合蛋白与羊口疮病毒阳性血清能够发生特异性结合反应；对ELISA方法反应条件进行优化，确定融合蛋白的最佳包被浓度为0.25μg/mL，最佳一抗稀释浓度为1:200，封闭时间为1h，一抗及酶标二抗最佳孵育时间为1h，酶标二抗的最佳稀释倍数为1:8000，TMB最佳显色时间为15min，确定阴阳性临界值为0.358，敏感性可达到1:256，与羊口蹄疫(A型、O型)、口蹄疫3ABC重组蛋白、羊支原体、小反刍兽疫、布鲁氏杆菌阳性血清反应结果均呈阴性。

本发明中，涉及“浓度”“OD450nm”“时间”“阴阳性判断界限”的数值不包括由于实验误差、仪器误差导致的数值范围，即实验误差、仪器误差导致的数值范围也在本发明的技术方案之中。

本发明有益效果在于：

本发明提供的检测试剂盒及检测方法对羊口疮病毒特异性高，灵敏度可以高达256倍，重复性也极好，为羊口疮的快速诊断、免疫抗体监测提供了一种快速、简便的血清学诊断途径。

附图说明

图1为B2L基因序列分析。

图2为F1L基因序列分析。

图3为OrfV B2L和FIL截短基因PCR扩增结果。

图4为OrfV B2L-F1L融合基因PCR扩增结果。

图5为截短B2L-F1L融合基因序列及氨基酸序列分析结果。

图6为PET-32a-B2L-F1L重组质粒PCR扩增结果。

图7为PET-32a-B2L-F1L重组质粒双酶切鉴定结果。

图8为PET-32a-B2L-F1L重组蛋白表达形式分析结果。

图9为PET-32a-B2L-F1L重组蛋白表达温度优化结果。

图10为PET-32a-B2L-F1L重组蛋白表达IPTG浓度优化结果。

图11为PET-32a-B2L-F1L重组蛋白表达IPTG诱导时间优化结果。

图12为PET-32a-B2L-F1L重组蛋白纯化结果图。

图13为B2L-F1L融合蛋白Western-Blot分析结果。

其中，

图3中，M：DNA2000 marker；1：B2L基因；2：B2L基因阴性对照；3：F1L基因；4；F1L基因阴性对照。

图4中，M：DNA2000 marker；1：B2L-F1L融合基因；2：阴性对照。

图6中，M：DNA2000 marker；1-4：B2L-F1L融合基因；5：阴性对照。

图7中，M：DNA2000 marker；1-2：PET-32a-B2L-F1L重组质粒；3：PET-32a。

图8中，M：预染蛋白Marker；1：上清；2：沉淀；3：未诱导重组蛋白；4：PET-32a空载体。

图9中，M：预染蛋白Marker；1-4：PET-32a-B2L-F1L重组蛋白分别在37℃、30℃、25℃、18℃条件下的诱导表达。

图10中，M：预染蛋白Marker；1-5：PET-32a-B2L-F1L重组蛋白分别在0.2、0.4、0.6、0.8、1mmol/L IPTG(37℃、5h)条件下的诱导表达。

图11中，M：预染蛋白Marker；1-6：PET-32a-B2L-F1L重组蛋白分别诱导3h、4h、5h、6h、7h、8h(37℃、IPTG 0.2mmol/L)。

图12中，M：预染蛋白Marker；1：未纯化重组蛋白；2-3：纯化的重组蛋白。

图13中，1：B2L-F1L融合蛋白；2：PET-32a空载体。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

本发明实施例中，大肠杆菌感受态细胞(DH5α)、BL21(DE3)表达菌购自北京康维世纪生物科技有限公司；PMD18-T-B2L、PMD18-T-F1L、PET-32a载体、羊口疮病毒阴阳性血清、羊A型口蹄疫、O型口蹄疫、口蹄疫3ABC重组蛋白、小反刍兽疫、布鲁氏杆菌阳性血清由贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室保存。

本发明实施例中，限制性内切酶HindⅢ、EcoRⅠ、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、Solution I连接酶购自TAKARA有限公司，2×Taq PCR Master Mix、DL Plus 2000DNAMarker购自VazymE公司，DNA胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自Omega公司。SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、IPTG、预染蛋白Marker、蛋白纯化试剂盒、考马斯亮兰染色液、PVDF膜、His-Tag Mouse Monoclona1 Antibody、特超敏ECL化学发光试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；HRP标记兔抗山羊IgG购自重庆奥怡生物技术有限公司。

本发明实施例中，PCR扩增仪器购自杭州柏恒科技有限公司；电泳凝胶图像分析系统购自香港Gene公司；垂直电泳槽、制胶器购自北京市六一仪器厂；脱色摇床购自江苏其林贝尔仪器制造有限公司；化学发光自动分析成像系统购自美国BIO-RAD公司；数据恒温水浴锅购自易晨仪器有限公司。微量核酸浓度测定仪购自德国Implen公司。

实施例1OrfV B2L-F1L融合蛋白制备

(1)OrfV B2L、F1L基因截短片段的设计

运用生物信息学软件DNAstar分别对B2L、F1L基因序列进行生物信息学分析，在B2L基因编码的第208位氨基酸至378位氨基酸之间和F1L基因编码的第2位氨基酸至182位氨基酸之间，该两片段的抗原性较强，亲水性好，无跨膜结构域(见图1和图2)。因此分别截取B2L基因编码的第208位氨基酸至378位氨基酸，F1L基因编码的第2位氨基酸至182位氨基酸作为羊口疮病毒双基因融合的主要基因片段。

(2)引物设计与合成

根据截取B2L、F1L基因的最佳优势抗原片段，分别设计一对引物，同时在B2L基因引物的下游5’端添加一段含10个疏水性的氨基酸多肽碱基Linker，在F1L基因引物的上游5’端添加与之完全反向互补的多肽碱基Linker；在B2L基因引物的上游5’端添加酶切位点HindШ，F1L基因引物的下游5’端添加酶切位点EcoR I。引物序列送往上海生物工程有限公司合成，引物信息见表1。

表1引物信息

注：表1中，下划线部分为酶切位点，加粗部分为多肽碱基Linker。

(3)OrfV B2L-F1L融合基因的扩增

分别以PMD18-T-B2L、PMD18-T-F1L克隆质粒为模板进行PCR扩增，扩增体系50μL：2×PrimesTAR GC Buffer(Mg2+Plus)25μL，dNTP Mixture 4μL，B2L-F/F1L-F和B2L-R/F1L-R各1μL，PrimesTAR HS DNA Polymerase 0.5μL，模板各2μL，ddH2O补足至50μL，混匀离心后进行PCR扩增，PCR反应程序为：98℃10s，60℃50s，72℃1min，总共30个循环。PCR扩增结束后，取10μL PCR产物于1.2％的琼脂糖凝胶中进行电泳分析。结果鉴定正确后，按胶回收试剂盒纯化回收B2L、F1L目的基因，再以回收的目的基因为模板，以B2L-F和F1L-R为上下游引物进行SOE-PCR扩增，扩增体系及PCR反应程序同上，PCR扩增结束后，取10μL PCR产物于1.2％的琼脂糖凝胶中进行电泳分析。

结果:经PCR扩增B2L、F1L基因，分别扩增出约510bp和540bp的目的片段，与预期目的片段大小相符(如图3所示)。通过重叠延伸PCR成功扩增出大小约为1080bp目的片段，与预期目的片段大小相符(如图4所示)。结果鉴定正确后，按上述方法纯化回收B2L-F1L融合基因，并将B2L-F1L融合基因送往上海生物工程有限公司进行测序分析，测序比对正确(如图5所示)，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

(4)OrfV B2L-F1L融合基因原核表达载体的构建

将回收纯化的B2L-F1L融合基因和PET-32a原核表达载体，分别用HindⅢ、EcoRⅠ双酶切，酶切体系30μL：B2L-F1L模板/PET-32a质粒20μL，10×Green Buffer 3μL，HindⅢ、EcoRⅠ各2μL，ddH2O补足至30μL，37℃水浴中酶切2h，酶切结束后，将酶切产物于1.2％的琼脂凝胶中进行电泳分析，并分别纯化回收，用Solution I将B2L-F1L与PET-32a原核表达载体进行连接，连接体系为：B2L-F1L融合基因8μL，PET-32a载体2μL，Solution I连接酶10μL，混匀离心后16℃连接过夜，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，并均匀涂布于含Amp霉素的LB平板中，置于37℃恒温箱中过夜培养。挑取单个菌落于5mL含有Amp霉素的LB液体培养基中37℃过夜培养，按照质粒提取试剂盒提取PET-32a-B2L-F1L质粒进行PCR和双酶切验证，同时将PET-32a-B2L-F1L质粒送往上海生物工程有限公司进行测序验证。

结果：以提取的PET-32a-B2L-F1L重组质粒为模板进行PCR扩增，成功扩增出大小约为1080bp目的片段(如图6所示)。重组质粒经双酶切分别获得5900bp和1080bp的PET-32a空载体片段和B2L-F1L融合基因目的片段(如图7所示)。

(5)OrfV B2L-F1L融合蛋白的表达与鉴定

将PET-32a-B2L-F1L质粒转化至宿主表达菌BL21(DE3)中，挑取单菌落进行扩大培养，取1mL菌液加入至200mL含有Amp霉素的LB液体培养基中37℃培养至OD600值至0.4-0.8时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达蛋白5h。收集菌液于4℃10000r/min离心10min，弃掉上清，加入2mL非变性裂解液重悬菌体，在冰浴中超声波破碎菌体，离心后收集上清及沉淀，同时设置空载体组，取40μL样品进行SDS-PAGE检测。

结果：重组菌液超声波破碎后，经SDS-PAGE电泳，结果显示，在39KD处出现一明显蛋白条带，未诱导组蛋白条带不明显，空载体未见蛋白表达，且该蛋白主要存在于上清中，以可溶形式表达为主，沉淀中有少量蛋白，结果表明PET-B2L-F1L重组质粒在BL21中成功表达目的蛋白，且表达量较高(如图8所示)，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2 OrfV B2L-F1L融合蛋白诱导条件的优化

将实施例1步骤(5)中，将重组菌液接种至含有Amp霉素的LB液体培养基中37℃培养至OD600值至0.4-0.8时，分别对重组蛋白的表达条件进行优化，诱导温度分别为：37℃、30℃、25℃、18℃；IPTG诱导终浓度分别为：0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L；诱导时间分别为：3h、4h、5h、6h、7h、8h后收集菌液，经超声波破碎后离心，取40μL样品样品进行SDS-PAGE检测，以期筛选出最佳的诱导条件。

结果：经对重组蛋白的诱导条件进行优化，该蛋白的最佳诱导温度为37℃(如图9所示)，最佳IPTG终浓度为0.2mmol/L(图10)，最佳诱导时间为5h(如图11所示)。

实施例3 OrfV B2L-F1L融合蛋白的纯化和Western-Blot鉴定

将成功验证表达的目的蛋白通过Ni柱纯化，并将纯化后的目的蛋白取少量进行SDS-PAGE分析。将纯化的目的蛋白经SDS-PAGE电泳后，电转至PVDF膜，用5％的脱脂奶粉37℃封闭2h，洗膜5次，每次5min，加入羊口疮病毒阳性血清(1:50)，4℃孵育过夜，洗膜5次，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗羊IgG(1:5000)，37℃90r/min摇床孵育1h，洗膜5次，加入ECL显色液避光显色1-3min，置于化学发光成像仪中进行结果分析。

结果：重组蛋白经Ni柱纯化后，经SDS-PAGE电泳检测，得到的蛋白较纯，杂蛋白较少，说明纯化后的蛋白效果良好(如图12所示)。纯化后的蛋白经Western-Blot检测，该融合蛋白能够与羊口疮病毒阳性血清发生特异性反应，且与SDS-PAGE结果一致，而空载体对照组未见明显特异性条带(如图13所示)。

实施例4基于OrfV B2L、F1L蛋白间接ELISA方法的建立

(1)抗原最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的筛选

采用方正滴定法对重组融合蛋白包被浓度及一抗稀释倍数的优化：将蛋白浓度分别稀释至8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL和0.25μg/mL，并分别包被于96孔酶标板中，4℃过夜，洗涤3次/3min，用5％的脱脂奶粉封闭2h；将羊OrfV阳性血清及羊阴性血清分别按照1:50、1:100、1:200、1:400稀释作为一抗孵育1h；洗涤3次/3min，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗羊IgG(1:8000)孵育1h；洗涤3次/3min，每孔加入100μL的TMB显色液，避光显色10min，后加入50μL的终止液终止显色，酶标仪读取OD450nm值。根据阳性血清的OD450nm值/阴性血清的OD450nm值的比值最大，阳性血清的OD450nm值接近于1.0综合分析判定，以筛选出最佳抗原包被浓度及一抗稀释倍数。

结果：通过方正滴定法筛选最佳的蛋白包被浓度与血清稀释倍数，结果见表2，当蛋白包被浓度为0.25μg/mL，阴阳性血清稀释倍数为1:200时，阳性血清OD450nm值(P)为1.226，阴性血清OD450nm值(N)为0.142，P/N值最大，为8.634。综合分析确定最佳的蛋白包被浓度为0.25μg/mL，最佳的血清稀释倍数为1:200。

表2蛋白包被浓度及血清稀释倍数优化结果

(2)最佳抗原包被条件的优化

以筛选出最佳的蛋白浓度进行包被，并分别设置3个不同的包被条件，分别为：4℃包被过夜、37℃作用2h后再4℃包被过夜和37℃2h，其余步骤同上，以筛选出最佳的抗原包被条件。

结果：包被条件的优化结果见表3，当4℃包被过夜时，其阳性血清(P)的OD450nm值为1.091，阴性血清血清(N)OD450nm值为0.136，此时P/N的值最大为8.022，且阳性血清(P)OD450nm值接近于1.0，综合分析得出包被该蛋白的最佳条件为4℃包被过夜。

表3蛋白的最佳包被条件优化结果

(3)最佳封闭时间的优化

以最佳的包被条件及最佳工作条件进行ELISA试验，对ELISA试验的封闭时间进行优化，分别设置封闭时间为：0.5h、1h、1.5h和2h，其他工作条件同上，以筛选出最佳的封闭时间。

结果：用5％的脱脂奶粉设置不同的封闭时间进行优化，封闭时间的优化结果见表4，当封闭时间为1h时，其阳性血清(P)的OD450nm值为1.078，阴性血清血清(N)OD450nm值为0.088，此时P/N的值最大为12.314，且阳性血清(P)OD450nm值接近于1.0，综合分析得出最佳的封闭时间为1h。

表4最佳封闭时间优化结果

(4)一抗及酶标二抗的最佳孵育时间的优化

以最佳的包被条件及最佳工作条件进行ELISA试验，分别对ELISA试验的一抗和酶标二抗的孵育时间进行优化，孵育时间分别设置为：0.5h、0.75h、1h和1.25h，其他工作条件同上，以筛选出最佳的一抗及酶标二抗的最佳孵育时间。

结果：分别设置一抗和酶标二抗孵育时间，对孵育时间进行优化，结果见表5和6，当一抗孵育时间为1h时，其阳性血清(P)的OD450nm值为1.044，阴性血清血清(N)OD450nm值为0.132，此时P/N的值最大为7.939，且阳性血清(P)OD450nm值接近于1.0，；当二抗孵育时间为1h时，其阳性血清(P)的OD450nm值为0.915，阴性血清血清(N)OD450nm值为0.175，此时P/N的值最大为5.244，且阳性血清(P)OD450nm值接近于1.0，综合分析得一抗及酶标二抗的最佳孵育时间为1h。

表5一抗孵育时间的优化结果

表6酶标二抗孵育时间的优化结果

(5)最佳酶标二抗稀释倍数的优化

将辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗羊IgG分别稀释为：1:5000、1:8000、1:10000:、1：12000和1:15000，其余步骤同上，以筛选出最佳的酶标二抗稀释倍数。

结果：对酶标二抗稀释倍数进行优化，优化结果见表7，当二抗稀释倍数为1:8000时，其阳性血清(P)的OD450nm值为1.126，阴性血清血清(N)OD450nm值为0.119，此时P/N的值最大为9.462，且阳性血清(P)OD450nm值接近于1.0，综合分析得出酶标二抗的最佳稀释倍数为1:8000。

表7酶标二抗稀释倍数的优化结果

(6)TMB最佳显色时间的优化

以最佳的工作条件进行ELISA试验，TMB的显色时间分别设置为：10min、15min和20min，其余步骤同上，以筛选出最佳的TMB显色时间。

结果：对TMB显色时间进行优化，结果见表8，当TMB显色时间为15min时，其阳性血清(P)的OD450nm值为0.993，阴性血清血清(N)OD450nm值为0.160，此时P/N的值最大为6.226，且阳性血清(P)OD450nm值接近于1.0，综合分析得出TMB的最佳显色时间为15min。

表8TMB显色时间的优化结果

(7)ELISA方法临界值的确定

按照初步建立的ELISA方法对已经确定为阴性的48份羊血清进行检测，用酶标仪读取48份阴性血清的OD450nm值，同时设置2孔阳性对照。将得到的48份阴性血清的OD450nm值进行数据处理，计算出其平均值

和标准差(SD)，根据统计学公式：

则可判定建立该方法的阴阳性临界值；若待检样品的

则可判定为阳性；待检样品的

判为阴性；若

则判为可疑。

结果：按照所确定的最佳条件包被目的蛋白，并运用最佳反应条件检测临床采集的48份阴性血清，结果见表9，48份阴性血清的平均OD450nm值

为0.169，标准差(SD)为0.063，根据统计学原理计算阴阳性血清临界值：

为上限临界值；

为下限临界值，由以上判定标准为待检血清OD450nm值≥0.358时判断为阳性，若待检血清OD450nm值≤0.295时，则判为阴性，待检血清OD450nm值介于0.295-0.358时，则判定为可疑。

表9阴阳性临界值的确定结果

实施例5ELISA方法验证

(1)敏感性试验

对建立的ELISA方法进行敏感性试验，将OrfV阳性血清按1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1：128、1:256、1:512、1:1024、1:2048进行倍比稀释，检测不同稀释倍数的阳性血清，根据检测的最高血清稀释度来评价ELISA方法的敏感性。

结果：按照所确定的最佳条件包被目的蛋白，对建立的ELISA方法进行敏感性试验，将阳性血清从1:1进行倍比稀释至1:2048，结果见表10，当阳性血清稀释至256倍时，其OD450nm值为0.494，当阳性血清稀释至512倍时，其OD450nm值为0.339小于阴阳性临界值0.358，所以判定建立的ELISA方法的敏感性可以达到256倍，其敏感性较好。

表10敏感性试验结果

(2)特异性试验

分别将羊A型口蹄疫、O型口蹄疫、口蹄疫3ABC重组蛋白、小反刍兽疫、布鲁氏杆菌阳性血清按照1:200倍稀释，用所建立的ELISA方法进行检测，对ELISA方法特异性进行评价。

结果：用上述建立的ELISA方法进行特异性试验，结果显示(见表11)羊口蹄疫(A型、O型)、口蹄疫3ABC重组蛋白、小反刍兽疫、布鲁氏杆菌阳性血清的OD450nm均小于0.358，说明建立的ELISA方法特异性良好。

表11特异性试验结果

(3)重复性验证

应用初步建立的ELISA方法进行重复性试验，选取阳性血清4份，阴性血清1份，进行批内和批间ELISA检测，并计算批内和批间的变异系数，以评价该方法的重复性。

结果：批内重复性：按照所确定的最佳条件包被目的蛋白，对该建立的ELISA方法进行批内重复性试验，结果见表12，ELISA试验结果显示批内重复性的变异系数在7.4％-10.0％之间，其变异系数符合国家标准(≤15％)，因此，可以初步判断建立的间接ELISA方法具有良好的批内重复性。

表12批内重复性试验结果

批间重复性：按照所确定的最佳条件包被目的蛋白，对该建立的ELISA方法进行批间重复性试验，结果见表13，ELISA试验结果显示批间重复性的变异系数在4.8％-13.2％之间，其变异系数符合国家标准(≤15％)，因此，可以初步判断建立的间接ELISA方法具有良好的批间重复性。

表13批间重复性试验结果

(4)临床样品检测

采用本研究建立的间接ELISA方法对临床采集的182份血清进行OrfV抗体检测，以初步评价该方法的临床应用效果。

结果：采用建立的间接ELISA方法对临床上采集的180份血清样品进行OrfV抗体检测，结果见表12。检出86份阳性血清，94份阴性血清，阳性率为47％。

表12临床血清样品检测结果

	阳性(份)	阴性(份)	合计	阳性率
					临床血清样品	86	94	180	47.8％

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 贵州大学

<120> 羊口疮病毒抗体捕捉剂及其试剂盒和检测方法与应用

<130> 2021-3-31

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1080

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ccggagcgct tcctaggctt ctaccgcacg ctcgacgagg acctcgtgct gcaccgcatc 60

gagaacgcca agaacagcat cgacctctcg ctgctctcga tggtgccggt gatcaagcac 120

gccggcgccg tggagtactg gccgcggatc atagacgcgc tgctgcgcgc ggccatcaac 180

cgcggcgtgc gcgtgcgcgt gatcttcacc aagtggaaga acgcggaccc gctgtcggtc 240

tcggccgcgc gcagcctcga cgactttggc gtcggcagcg tggacatgtc cgtgcgcaag 300

ttcgtggtac ccggccggga cgacgctgcg aacaatacta agctgctcat cgtggacgac 360

accttcgcgc acctcacggt cgccaacctc gacggcacgc actaccgcta ccacgccttc 420

gtgagcgtga acgccgagaa gggcgacatc gtcaaggacc tgtccgcggt cttcgagcgg 480

gactggcgct cggagttctg caaaccaata ggtggcggtg gaagcggcgg tggcggaagc 540

aaaggccgcg ggaccaagga ggtgttcccc acgctgccgt acctggtggg cctcgccgac 600

gacccgccca agcctcaacc cgcacctgct ccctctcctg cgccagcgcc agccccagcg 660

ccatccccag ccccgtcgcc ggcccccgcg ccggcaccca agccatctcc tcccgcgccg 720

caccccaagg gtgaccacgt gctcaaggcg gtggaatgga aagacgtgga ctccaaagac 780

tacccgcact tcttcacgga catgtgcaag tccacgtgtc cgaaggagat gcagcgccgc 840

gcggcacacc acctcaacct ctgggagagc atatcagccg gcactgtccc caccaagtac 900

tccgacgacg acttcatcct ggtggtcgac aacgacatga cctttcgcaa gcccgagatg 960

gtaaagccgc tcatcgaggc gatgaagacg aacggctggt atatggcgca gctcaaggag 1020

acctacatga ccggcgcgct ggccaccaac gtccccggca ccggcgaccc cgagctcatg 1080

<210> 2

<211> 360

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Pro Glu Arg Phe Leu Gly Phe Tyr Arg Thr Leu Asp Glu Asp Leu Val

1 5 10 15

Leu His Arg Ile Glu Asn Ala Lys Asn Ser Ile Asp Leu Ser Leu Leu

20 25 30

Ser Met Val Pro Val Ile Lys His Ala Gly Ala Val Glu Tyr Trp Pro

35 40 45

Arg Ile Ile Asp Ala Leu Leu Arg Ala Ala Ile Asn Arg Gly Val Arg

50 55 60

Val Arg Val Ile Phe Thr Lys Trp Lys Asn Ala Asp Pro Leu Ser Val

65 70 75 80

Ser Ala Ala Arg Ser Leu Asp Asp Phe Gly Val Gly Ser Val Asp Met

85 90 95

Ser Val Arg Lys Phe Val Val Pro Gly Arg Asp Asp Ala Ala Asn Asn

100 105 110

Thr Lys Leu Leu Ile Val Asp Asp Thr Phe Ala His Leu Thr Val Ala

115 120 125

Asn Leu Asp Gly Thr His Tyr Arg Tyr His Ala Phe Val Ser Val Asn

130 135 140

Ala Glu Lys Gly Asp Ile Val Lys Asp Leu Ser Ala Val Phe Glu Arg

145 150 155 160

Asp Trp Arg Ser Glu Phe Cys Lys Pro Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly

165 170 175

Gly Gly Gly Ser Lys Gly Arg Gly Thr Lys Glu Val Phe Pro Thr Leu

180 185 190

Pro Tyr Leu Val Gly Leu Ala Asp Asp Pro Pro Lys Pro Gln Pro Ala

195 200 205

Pro Ala Pro Ser Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Pro Ala

210 215 220

Pro Ser Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ser Pro Pro Ala Pro

225 230 235 240

His Pro Lys Gly Asp His Val Leu Lys Ala Val Glu Trp Lys Asp Val

245 250 255

Asp Ser Lys Asp Tyr Pro His Phe Phe Thr Asp Met Cys Lys Ser Thr

260 265 270

Cys Pro Lys Glu Met Gln Arg Arg Ala Ala His His Leu Asn Leu Trp

275 280 285

Glu Ser Ile Ser Ala Gly Thr Val Pro Thr Lys Tyr Ser Asp Asp Asp

290 295 300

Phe Ile Leu Val Val Asp Asn Asp Met Thr Phe Arg Lys Pro Glu Met

305 310 315 320

Val Lys Pro Leu Ile Glu Ala Met Lys Thr Asn Gly Trp Tyr Met Ala

325 330 335

Gln Leu Lys Glu Thr Tyr Met Thr Gly Ala Leu Ala Thr Asn Val Pro

340 345 350

Gly Thr Gly Asp Pro Glu Leu Met

355 360

Claims

1.羊口疮病毒抗体捕捉剂，其特征在于，所述羊口疮病毒抗体捕捉剂与所述羊口疮病毒抗体特异性结合，编码所述羊口疮病毒抗体捕捉剂的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.羊口疮病毒ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述ELISA检测试剂盒包括权利要求1所述的羊口疮病毒抗体捕捉剂包被的固相载体。

3.根据权利要求2所述的羊口疮病毒ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述羊口疮病毒抗体捕捉剂的浓度为0.25±0.05 μg/mL。

4.根据权利要求3所述的羊口疮病毒ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述羊口疮病毒ELISA检测试剂盒还包括待检测血清和酶标二抗；所述待检测血清稀释倍数为1:200±50；所述酶标二抗的稀释倍数为1:8000±50。

5.根据权利要求4所述羊口疮病毒ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG。

6.食源羊口疮病毒的检测方法，其特征在于，所述检测方法为间接ELISA方法，包括以下步骤：将权利要求1所述的羊口疮病毒抗体捕捉剂包被于固相载体中；所述羊口疮病毒抗体捕捉剂的浓度为0.25±0.05 μg/mL；所述方法不用于疾病诊断。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述方法还包括：将稀释1:200±50倍的待检测血清孵育，然后加入稀释倍数1:8000±50的酶标二抗孵育。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括：使用酶标仪读取OD₄₅₀nm值，若OD₄₅₀nm≥0.358，则所述待检测血清判定为含有羊口疮病毒；若OD_450nm≤0.295，则所述待检测血清判定为不含有羊口疮病毒；若 0.295＜OD_450nm＜0.358，则所述待检测血清判定为可疑。

9.组合物，其特征在于，所述组合物由B2L和F1L截短融合蛋白与羊口疮病毒抗体结合而成，其中，所述B2L和F1L截短融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，其浓度为0.25±0.05 μg/mL。

10.B2L和F1L截短融合蛋白在制备羊口疮病毒ELISA检测试剂盒或羊口疮病毒ELISA检测试剂中的应用，所述B2L和F1L截短融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。