KR20210123234A - 코로나바이러스 감염증１９의 진단 및 백신을 위한 재조합 뉴클레오캡시드 단백질 및 이의 용도 - Google Patents
코로나바이러스 감염증１９의 진단 및 백신을 위한 재조합 뉴클레오캡시드 단백질 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 코로나바이러스 감염증１９의 진단을 위한 재조합 뉴클레오캡시드 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 대장균 또는 식물세포에서 발현시킨 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(NP: nucleocapsid protein)로 이루어진 코로나바이러스 감염증-19 진단용 항원단백질 및 백신 조성물에 관한 것이고, 또한 상기 항원단백질을 이용한 코로나바이러스 감염증-19 진단을 위한 정보제공방법, SARS-CoV-2 바이러스에 대한 항체 측정방법 및 코로나바이러스 감염증-19 진단키트와 백신 후보 물질에 관한 것이다.
Description
본 발명은 코로나바이러스 감염증１９의 진단 및 백신을 위한 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
코로나바이러스 감염증-19(coronavirus disease 2019, COVID-19)는 SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)에 의해 발병하는 새로운 호흡기 감염질환이다. 2019년 12월 중국 우한지역에서 처음 발생한 뒤 전 세계적으로 확산되고 있으며, 국내 확진자가 급속도로 증가하여 2020년 3월 14일 현재 8,086명의 환자가 발생하였고, 사망자는 72명(0.9 %) 으로 확인되었다. 이러한 확진자는 국내를 포함하여 전 세계적으로 급속도로 증가하고 있으나 현재, 백신이나 치료제가 개발되지 않은 상황으로 세계적으로 심각한 보건 문제로 대두되고 있다.
중국에서 7 만명 이상의 환자를 분석한 자료에 따르면 약 15%에서 중증 폐렴이 발생하고, 약 5%에서 중환자실 치료가 필요한 환자로 보고되었으며, 중환자실 치료를 받는 환자의 약 절반에서 사망하는 것으로 알려져 있다. 이와 같이 코로나바이러스 감염증-19에 감염되면 나타나는 주 중상으로는 무기력감, 37.5도 이상의 고열, 기침, 인후통, 가래, 근육통, 두통, 호흡곤란 및 폐렴 등의 증상이 발생하며, 폐 손상에 의한 호흡부전 등이 있으며, 심하면 사망에 이를 수 있다. 그러므로 코로나바이러스 감염증-19에 대한 진단, 치료제 및 백신 개발이 매우 시급한 실정이다.
현재 코로나바이러스 감염증-19 진단법 시행은 코로나바이러스-19 발생국가·지역 방문 후 14일 이내 발열 또는 호흡기증상(기침, 인후통 등)이 나타나는 자 및 확진환자와 밀접한 관련성이 있는 의심환자 대상으로 진단법이 시행되고 있으며, COVID-19의 주요 진단 방법은 중합효소 연쇄반응(PCR) 기반 기술 또는 차세대 염기 서열 분석을 포함한 유전적 접근 방식에 의한 바이러스 핵산 식별을 포함하는 방법으로 진단하고 있다. 그러나 많은 관련 응용분야를 지원하는 것으로 잘 알려진 검증된 혈청학적 분석 방법이 필요한데, 첫째, 혈청학적 분석은 SARS-CoV-2에 대한 면역반응을 정량적으로나 정성적으로 이해하는 데 중요하며, 둘째, 혈청 조사는 특정 감염률을 확인하는데 필수적이고, 이는 사망률을 정확하게 결정하는 핵심 매개 변수가 될 수 있다. 셋째, 이러한 분석은 상당한 항체 반응을 보이며 혈장 기증자 역할을 할 수 있는 개인을 인식함으로써 회복기 혈장 치료의 개발에도 기여할 수 있기 때문이고, 마지막으로 혈청학적 분석은 SARS-CoV-2에 대한 항체 반응을 결정하는데 도움이 될 수 있다.
특히, SARS-CoV-2 바이러스에 감염되어도 증상이 거의 없거나 전혀 증상이 발생되지 않은 환자의 감염을 확인하는데 매우 중요한 검사방법이 될 수 있으므로, 혈청학적 방법을 이용한 COVID-19의 진단제나 면역형성을 위한 백신으로서의 기술이 필요하다.
또한, COVID-19의 급속한 확산에 따라 치료제나 백신을 찾기 위한 많은 연구들이 시도되고 있다. SARS-CoV-2는 SARS-CoV-1과 마찬가지로 N, E(evelope), S, M의 4개의 구조 단백질을 발현하고 있다. 이전 보고에 따르면 스파이크 단백질 (spike protein) (S)는 ~180 kDa의 당단백질이며, 숙주 수용체를 인지하여 그에 결합한다고 알려져 있다. 스파이크 단백질의 수용체-결합 모티프는 중화항체를 생성시켜 SARS-CoV에 의한 감염을 예방할 수 있다는 보고가 있다. 일반적으로 백신개발은 T세포를 자극할 수 있는 항원을 이용하고 있다. T 세포 중 CD8+ T 세포는 바이러스에 감염된 세포를 파괴하는 역할을 하고 있으며 CD4+ T 세포는 다양한 면역기능을 가지고 있으며 그중에는 항체 및 CD8+ T 세포를 생성을 촉진하는 기능이 있다. 현재 많은 백신 개발에는 T 세포를 더욱 효율적으로 자극하는 백신 개발 방안을 모색하고 있다. 스파이크 단백질의 경우 매우 가변적으로서 변이될 가능성이 높은 단백질로서 최근 변이주들의 스파이크 단백질의 서열을 분석한 결과 매우 다양한 변이들이 일어나고 있는 것을 볼 수 있었다. 그러기 때문에 스파이크 단백질보다 덜 변이가 형성되는 단백질을 겨냥하는 백신을 설계하는 것이 필요한 상황이다.
한편, SARS-CoV-2 바이러스는 약 30kb의 염기서열을 가지며 4개의 중요한 구조 단백질인 Nucleocapsid (NP), Spike(S), Membrane glycoprotein(M) 및 Envelope(E) 단백질을 생산해 내는 Open Reading Frame (ORF)을 가지고 있다. 이중 뉴클레오캡시드 (Nucleocapsid; NP) 단백질은 사스코로나바이러스의 9번째 ORF에 의해 encoding되며 422개 아미노산으로 이루어진 분자량이 약 46 kDa인 단백질 이다(P.A. Rota, M.S. Oberste and S.S. Monroe et al., (2003) Science 300: 1394-1399). 뉴클레오캡시드 단백질의 주요 기능으로는 genomic RNA를 encapsidation 하는 것으로서 이를 위해 뉴클레오캡시드 단백질은 genomic RNA를 인식하고 결합하는 기능과 캡시드를 형성하기 위해 self-association을 통해 올리고머(oligomer)를 형성하는 기능을 가지고 있다. 이 기능 외에도 뉴클레오캡시드 단백질은 host cellular machinery를 조절하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Genetics and Evolution 8(4): 397-405). 뉴클레오캡시드 단백질은 SARS 바이러스 감염 초기 상태에서 우선적으로 발현되는 단백질로서 숙주세포는 뉴클레오캡시드 단백질을 대항하여 강한 항체반응을 시작한다. 사스코로나바이러스는 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 항체 반응은 주도적으로 Immunoglobulin G 항체 반응을 강하게 일으킨다(J. Infect. Dis. 2004;190:379-386).
이에 본 발명자들은 코로나바이러스-19(COVID-19) 감염증을 보다 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 혈청학적 진단 및 백신으로 활용 가능한 방법을 연구하던 중, 식물 및 대장균으로부터 발현 및 정제하여 수득한 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 항원성 단백질을 이용할 경우, COVID-19 감염증을 신속하고 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였고, 특히 식물에서 정제한 재조합 뉴클레오캡시드 단백질이 대장균에서 정제한 재조합 뉴클레오캡시드 단백질에 비해 더 우수한 민감도 및 특이성으로 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
또한 백신으로 활용 가능성을 알아보기 위하여 식물 단백 뉴클레오캡시드의 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 반응 유도 분석을 진행한 결과, 이들 분석에서 모두 T 세포 반응을 유도하는 것으로 나타남으로써 백신으로도 매우 유용할 수 있음을 확인하였다.
1.Circ Res. 2016 April 15; 118(8): 1313-1326.
2.Nature. 2005 Jul;436(7047):112-6.
따라서 본 발명의 목적은 대장균 또는 식물세포에서 발현시킨 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(NP: nucleocapsid protein)로 이루어진, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 진단용 항원단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 대장균 또는 식물세포에서 발현시킨 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(NP: nucleocapsid protein)을 포함하는 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (1) 코로나바이러스 감염증-19 의심환자로부터 시료를 채취하는 단계; (2) 상기 본 발명의 항원단백질을 항원으로 이용하여 상기 시료로부터 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19)의 진단을 위한 정보제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 대장균 또는 식물세포에서 발현시킨 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(NP: nucleocapsid protein)을 항원으로 이용하는, SARS-CoV-2 바이러스에 대한 항체 측정방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 항원단백질을 포함하는, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 진단키트를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은, 대장균 또는 식물세포에서 발현시킨 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(NP: nucleocapsid protein)로 이루어진, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 진단용 항원단백질을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한 본 발명은, (1) 코로나바이러스 감염증-19 의심환자로부터 시료를 채취하는 단계; (2) 상기 본 발명의 코로나바이러스 감염증-19 진단용 항원단백질을 항원으로 이용하여 상기 시료로부터 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19)의 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시료는 타액, 소변, 혈액, 혈장, 혈청, 객담, 비인두 도말 및 기관지 폐포 세척액으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (2) 단계의 항체 검출은 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블롯팅(Western Blotting), 면역형광(Immunofluorescence), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry staining), 유세포분석법(Flow cytometry), 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법 (Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay) 또는 단백질 칩(Protein Chip)으로 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 방법은 혈청을 이용한 혈청학적 분석으로 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 혈청학적 분석은 상기 혈청에 본 발명의 코로나바이러스 감염증-19 진단용 항원단백질을 처리한 후, 항원-항체 반응에 의한 항체 검출율의 ROC 곡선에서 나타나는 컷오프(cut-off) 값을 확인하는 것으로 수행할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항원단백질로서 식물세포에서 발현시킨 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 사용하는 경우, 컷오프(cut-off) 값이 0.5를 초과하면 SARS-CoV-2 바이러스에 감염된 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항원단백질로서 대장균에서 발현시킨 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 사용하는 경우, 컷오프(cut-off) 값이 1.8을 초과하면 SARS-CoV-2 바이러스에 감염된 것으로 판단할 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 대장균 또는 식물세포에서 발현시킨 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(NP: nucleocapsid protein)을 항원으로 이용하는, SARS-CoV-2 바이러스에 대한 항체 측정방법을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 진단용 항원단백질을 포함하는, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 진단키트를 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 진단용 항원단백질을 포함하는, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항원단백질은 세포성 면역반응 유도활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포성 면역반응 유도활성은 INF-γ 또는 TNF-a를 분비하는 CD4+ T세포 또는 CD8+ T세포의 활성 및 증식을 촉진시키는 것일 수 있다.
본 발명은 코로나바이러스 감염증１９의 진단을 위한 재조합 뉴클레오캡시드 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 대장균 및 식물체에서 발현 및 정제한 신종 코로나바이러스 19(SARS-CoV-2)의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질이 항원단백질로 작용할 수 있음을 확인하였고, 따라서 본 발명의 재조합 뉴클레오캡시드 항원단백질에 대한 특이적 항체 검출을 통해 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19)의 진단이 가능함을 확인하였다. 뿐만 아니라 증상이 있는 환자 또는 증상이 거의 없거나 전혀 증상이 발생되지 않은 환자의 시료를 이용한 경우에도 SARS-CoV-2 감염 여부에 따른 코로나바이러스 감염증-19의 발병여부를 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다.
또한, 백신 조성물로서 가능성을 확인하기 위하여 마우스에 본 항원단백질을 면역화 한 후 면역 조직을 분리하였으며, 본 항원단백질을 면역화된 세포에 자극을 유도한 결과 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에 TNF-α의 발현 유도를 확인하였다. 또한 코로나19 환자 혈액으로부터 분리한 PBMC 세포에 본 항원단백질을 이용하여 세포를 자극한 결과 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에서 TNF-α, IFN-γ의 증가를 확인하였다. 따라서 본 발명의 재조합 뉴클레오캡시드 항원 단백질은 백신 조성물로 활용 가능성을 확인하였다.
그러므로 본 발명의 재조합 뉴클레오캡시드 항원단백질은 신속하고 정확하게 코로나바이러스 감염증-19 진단을 위한 용도로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 대장균으로부터 SARS-CoV-2의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(rNP)을 발현 및 정제하기 위해 제조한 재조합 발현벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 2는 식물세포로부터 SARS-CoV-2의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(rNP)을 발현 및 정제하기 위해 제조한 재조합 발현벡터의 개열지도를 나타낸 것으로, 도 2의 백터에는 NR(Rbc-TP; 루비스코 트랜짓 펩타이드), COVID19 NP(SARS-CoV-2의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(rNP)), H(6xHis) 및 HDEL 펩타이드 코딩 유전자 구조물이 삽입되어 있다.
도 3은 식물세포로부터 정제한 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(rNP) 및 대장균으로부터 정제한 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(rNP)을 이용하여 ELISA 분석을 통해 COVID-19의 진단 정확도(민감도 및 특이도)를 평가하기 위한 ROC 곡선 비교결과를 나타낸 것이다.
도 4는 ROC 곡선에서 권장하는 컷오프 값(식물 rNP의 경우> 0.5, 대장균 rNP의 경우> 1.8)을 이용하여 증상 발병 후 시간에 따른 총 항체를 450nm의 광학밀도 분석으로 분석한 결과를 나타낸 것으로, A는 식물 유래 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(rNP)에 대한 분석결과이고, B는 대장균 유래 재조합 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 증상 발병 후 시간에 따른 SARS-CoV-2 바이러스 특이적 총 항체에 대한 양성률 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 뉴클레오캡시드 항원 단백질을 마우스에 면역화 한 후 면역세포를 분리하였고, 분리된 세포를 이용하여 본 항원단백질의 면역 유도반응을 확인한 결과, T 세포인 CD4+, CD8+ T 세포의 면역반응을 유도함을 확인한 결과이다.
도 7은 증상 발생일에 따른 코로나19환자의 혈액을 확보한 후 혈액에서 PBMC 세포를 분리한 다음, 분리된 세포에 본 항원 단백질을 자극하여 T 세포 면역반응 분석을 위하여 유세포분석 분석을 수행한 결과로서, 본 항원 단백질을 이용하여 코로나19 환자의 PBMC 세포에 자극을 주었을 경우 자극을 주지 않은 대조군과 비교하여 Th1, Th2 반응에서 CD3, CD4, CD8, TNF-α, IFN-γ 검출이 증가됨을 확인한 것을 나타낸 것이고, 또한 증상 발생일에 따른 T 세포 면역 반응을 분석한 결과 증상발생 후 4주째 검체에서 높은 T 세포 면역 반응이 일어나는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 식물세포로부터 SARS-CoV-2의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(rNP)을 발현 및 정제하기 위해 제조한 재조합 발현벡터의 개열지도를 나타낸 것으로, 도 2의 백터에는 NR(Rbc-TP; 루비스코 트랜짓 펩타이드), COVID19 NP(SARS-CoV-2의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(rNP)), H(6xHis) 및 HDEL 펩타이드 코딩 유전자 구조물이 삽입되어 있다.
도 3은 식물세포로부터 정제한 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(rNP) 및 대장균으로부터 정제한 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(rNP)을 이용하여 ELISA 분석을 통해 COVID-19의 진단 정확도(민감도 및 특이도)를 평가하기 위한 ROC 곡선 비교결과를 나타낸 것이다.
도 4는 ROC 곡선에서 권장하는 컷오프 값(식물 rNP의 경우> 0.5, 대장균 rNP의 경우> 1.8)을 이용하여 증상 발병 후 시간에 따른 총 항체를 450nm의 광학밀도 분석으로 분석한 결과를 나타낸 것으로, A는 식물 유래 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(rNP)에 대한 분석결과이고, B는 대장균 유래 재조합 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 증상 발병 후 시간에 따른 SARS-CoV-2 바이러스 특이적 총 항체에 대한 양성률 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 뉴클레오캡시드 항원 단백질을 마우스에 면역화 한 후 면역세포를 분리하였고, 분리된 세포를 이용하여 본 항원단백질의 면역 유도반응을 확인한 결과, T 세포인 CD4+, CD8+ T 세포의 면역반응을 유도함을 확인한 결과이다.
도 7은 증상 발생일에 따른 코로나19환자의 혈액을 확보한 후 혈액에서 PBMC 세포를 분리한 다음, 분리된 세포에 본 항원 단백질을 자극하여 T 세포 면역반응 분석을 위하여 유세포분석 분석을 수행한 결과로서, 본 항원 단백질을 이용하여 코로나19 환자의 PBMC 세포에 자극을 주었을 경우 자극을 주지 않은 대조군과 비교하여 Th1, Th2 반응에서 CD3, CD4, CD8, TNF-α, IFN-γ 검출이 증가됨을 확인한 것을 나타낸 것이고, 또한 증상 발생일에 따른 T 세포 면역 반응을 분석한 결과 증상발생 후 4주째 검체에서 높은 T 세포 면역 반응이 일어나는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 코로나바이러스 감염증１９를 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 방법으로서, 대장균 또는 식물세포에서 발현시킨 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(NP: nucleocapsid protein)로 이루어진, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 진단용 항원단백질 및 이를 이용한 코로나바이러스 감염증１９ 진단방법을 제공한다는 점에 특징이 있다.
특히 본 발명에서는 코로나바이러스 감염증１９의 진단을 위한 항원성 단백질로서 대장균 또는 식물세포에서 발현시킨 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(NP: nucleocapsid protein)을 사용할 수 있음을 확인하였다.
또한 본 발명은 뉴클래오캡시드 단백질이 코로나바이러스 감염증-19의 감염을 효과적으로 예방할 수 있는 백신 조성물로서 활용 가능성이 있다는 것을 확인하였다.
본 발명에서는 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(NP: nucleocapsid protein)을 대장균 또는 식물세포에서 발현 및 정제할 수 있도록 재조합 발현벡터를 각각 제조하였고, 당업계에 공지된 단백질 분리방법을 통해 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 분리하였다.
구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 서열번호 1의 SARS-CoV-2 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조 후, 대장균을 형질절환시킨 다음, 단백질의 발현을 유도하고 대장균으로부터 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 분리하였다.
본 발명의 다른 일실시예에서는, 식물세포 발현시스템에 적합하도록 코돈 최적화시킨 서열번호 2의 SARS-CoV-2 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조 후, 식물세포를 형질절환시킨 다음, 단백질의 발현을 유도하고 식물세포로부터 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 분리하였다.
본 발명에서 상기 ‘재조합 발현벡터(recombinant expression vector)’란, 벡터 내에 삽입된 핵산에 의해 코딩되는 펩타이드 또는 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 지칭하는 것으로, 바람직하게는 본 발명에 따른 COVID-19 백신용 재조합 항원 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 제조된 벡터를 의미한다. 상기 "벡터"는 시험관 내, 생체 왜 또는 생체 내에서 숙주세포로 염기의 도입 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말하며, 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있으며, "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 자체의 조절로 복제 가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스 등)를 말한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 바람직하게는 RNA 중합효소가 결합하는 전사 개시 인자인 프로모터(promoter), 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 터미네이터 등을 포함할 수 있다.
또한, 재조합 단백질의 생산량을 증가시키기 위한 태그용 유전자, 재조합 단백질의 구조적 안정성을 유지하기 위한 태그용 유전자, 재조합 단백질을 용이하게 분리하기 위한 태그용 유전자, 형질전환체를 선별하기 위한 항생제 내성 유전자 등의 선별용 마커 유전자 등을 추가로 포함할 수 있으며, 용이한 분리를 위한 태그로는 이에 제한되지는 않으나, Avi 태그, Calmodulin 태그, polyglutamate 태그, E 태그, FLAG 태그, HA 태그, His 태그, Myc 태그, S 태그, SBP 태그, IgG-Fc 태그, CTB 태그, Softag 1 태그, Softag 3 태그, Strep 태그, TC 태그, V5 태그, VSV 태그, Xpress 태그 등이 포함될 수 있으며, 상기 선별용 마커 유전자에는 대표적으로 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페닐콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 포함될 수 있으며, 상기 프로모터에는 대표적으로 pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터, 유비퀴틴 단백질 프로모터, CMV (Cytomegalovirus) 프로모터, SV40 (Simian virus 40) 프로모터, RSV (Respiratory syncytial virus) 프로모터, EF-1α (Elongation factor-1 alpha) 프로모터 등이 포함될 수 있으며, 상기 터미네이터는 대표적으로 노팔린 신타아제(NOS), 벼 아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 터미네이터, 아그로박테리움 튜머패시언스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이나, 상기 추가되는 유전자의 종류는 기존에 재조합 단백질의 제조에 사용되고 있는 종류라면 제한이 없다.
또한 본 발명의 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환체는 대장균 및 식물체를 포함할 수 있으며, 상기 식물체로는 이에 제한되지는 않으나, 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근 및 샐러리로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 쌍자엽 식물; 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
상기 “형질전환(transformation)”이란 주입된 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 총칭하며, “형질전환체(transgenic organism)”란 분자유전학적 방법으로 외부의 유전자를 주입하여 제조된 생명체로서, 바람직하게는 본 발명의 재조합 발현 벡터에 의하여 형질전환된 생명체이며, 상기 생명체는 미생물, 진핵세포, 곤충, 동물, 식물 등 생명이 있는 생물이라면 제한이 없으며, 바람직하게는 대장균, 살모넬라, 바실러스, 효모, 동물 세포, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 말, 소, 아그로박테리움 튜머패시언스, 식물 등이나 이에 제한되지 않는다. 상기 형질전환체는 형질전환(transformation), 형질감염(transfection), 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법(electroporation), PEG (Polyethylen glycol)-매개 형질전환 방법 등의 방법으로 제조될 수 있으나, 본 발명의 벡터를 주입할 수 있는 방법이라면 제한이 없다.
또한 상기 형질전환된 세포로부터 재조합 뉴클레오캡시드 항원단백질의 정제 및 분리를 위해서는, 형질전환된 세포로부터 본 발명의 재조합 뉴클레오캡시드 항원단백질의 과발현을 유도시키는 과정을 수행할 수 있고, 단백질의 발현 유도는 당업계에 공지된 방법이라면 사용 가능하며, 일예로, 목적 단백질의 발현 유도를 위해 배양액에 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 처리하여 유도시킬 수 있다. 이후 과발현된 세포를 파쇄하고 본 발명의 재조합 뉴클레오캡시드 항원단백질을 분리 및 정제하며, 이때 컬럼크로마토그래피 등을 이용하여 타겟 단백질만을 고수율로 정제한다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 대장균 또는 식물세포에서 발현시킨 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(NP: nucleocapsid protein)을 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19)의 진단을 위한 항원단백질로 사용할 수 있는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였는데, 이를 위해 SARS-CoV-2 바이러스 감염 양성 및 음성으로 판정된 환자로부터 혈청을 각각 수득한 후, 상기 혈청에 본 발명에 따른 상기 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 처리하여, 항원-항체 반응 여부에 따른 COVID-19 진단 가능성 여부를 분석하였다.
그 결과, 양성으로 판정된 환자의 혈청 시료에 대한 분석에서는 ELISA 분석결과, 항원-항체 반응을 확인하였고, 상기 혈청 내에 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 항체가 존재한다는 것을 확인할 수 있었다.
반면, 음성으로 판정된 시험자의 혈청 시료에 대한 분석에서는 항원-항체 반응이 나타나지 않았고, 이를 통해 상기 시험자는 SARS-CoV-2 바이러스에 감염되지 않아 혈청 내에 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 항체가 형성되지 않았음을 확인할 수 있었다.
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질이 항원단백질로 작용할 수 있으며, 궁극적으로 COVID-19의 진단에 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
그러므로 본 발명은, (1) 코로나바이러스 감염증-19 의심환자로부터 시료를 채취하는 단계; (2) 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 항원단백질을 항원으로 이용하여 상기 시료로부터 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19)의 진단을 위한 정보제공 방법을 제공할 수 있다.
상기 시료는 이에 제한되지는 않으나, 타액, 소변, 혈액, 혈장, 혈청, 객담, 비인두 도말 및 기관지 폐포 세척액으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있고, 바람직하게는 혈청일 수 있다.
또한 상기 항체 검출은 상기 시료에서 본 발명의 재조합 뉴클레오캡시드 항원단백질과 결합 또는 반응할 수 있는 항체의 존재 여부를 검출하는 것일 수 있고, 상기 항체 검출을 위한 방법은 이에 제한되지는 않으나, 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블롯팅(Western Blotting), 면역형광(Immunofluorescence), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry staining), 유세포분석법(Flow cytometry), 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법 (Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay) 또는 단백질 칩(Protein Chip)으로 수행할 수 있다.
바람직하게, 상기 항체 검출은 혈청을 이용한 혈청학적 분석을 통해 수행할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 효소면역분석법(ELISA)을 통해 상기 혈청 내에 존재하는 본 발명의 항원단백질 특이적 항체를 검출할 수 있다.
또한, 본 발명의 일실시예에서는, 혈청 시료에 본 발명의 재조합 항원단백질을 처리한 후, 항체 검출율의 ROC 곡선에서 나타나는 컷오프(cut-off) 값을 확인하였는데, 식물세포에서 정제한 항원단백질을 사용하는 경우, 컷오프(cut-off) 값이 0.5를 초과하면 SARS-CoV-2 바이러스에 감염된 것, 즉 COVID-19 양성으로 판단할 수 있음을 확인하였다. 또한, 대장균에서 정제한 항원단백질을 사용하는 경우에는 컷오프(cut-off) 값이 1.8을 초과하면 SARS-CoV-2 바이러스에 감염된 것, 즉 COVID-19 양성으로 판단할 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 코로나바이러스 감염증-19 진단에 있어서, 대장균 및 식물세포에서 각각 정제한 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질에 대하여, 코로나바이러스 감염증-19 진단의 민감성 및 특이도를 분석하였는데, 그 결과, 식물 유래 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 이용한 경우, 92.91%의 검출 민감도를 나타내었고, 대장균 유래 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 이용한 경우에는 75.89 %의 검출 민감도를 나타내었다.
검출 특이도 분석에서는 대장균 및 식물세포 유래 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질 모두 90% 이상의 높은 특이도를 보이는 것으로 나타났다.
이러한 결과를 통해, 코로나바이러스 감염증-19 진단을 위해 대장균 및 식물세포에서 정제한 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 각각 사용할 수 있으며, 바람직하게는 식물세포에서 정제한 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 사용할 수 있다.
나아가 본 발명은 대장균 또는 식물세포에서 발현시킨 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(NP: nucleocapsid protein)을 항원으로 이용하는, SARS-CoV-2 바이러스에 대한 항체 측정방법을 제공할 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 항원단백질을 포함하는, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 진단 키트를 제공한다.
본 발명에서 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 신종 코로나바이러스 19(SARS-CoV-2)의 감염 여부 또는 상기 바이러스의 감염에 따른 COVID-19 발병 가능성 여부를 확인하는 것이다.
상기 진단 키트는 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 이러한 진단 키트는 코로나바이러스 19(SARS-CoV-2)의 뉴클레오캡시드 항원 단백질뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
나아가 본 발명은 본 발명의 재조합 단백질에 대한 COVID-19의 백신 제조로 사용가능한지 확인하기 위해, 본 발명의 식물세포 유래 뉴클레오캡시드 항원 단백질을 마우스에 면역화 한 후 비장을 분리하여 비장세포를 얻었고, 수득한 비장 세포는 면역 유도 반응을 확인하기 위하여 형광이 표지된 Anti-CD4 T+ 및 Anti-CD8+ 항체를 이용하여 염색하였다. 또한 각각의 T세포에서 분비되는 TNF-α 및 IFN-γ의 분비량을 확인하기 위하여, 각각의 사이토카인에 대한 형광이 표지된 항체로 염색한 후 유세포 분석법을 통하여 T 세포 면역 유도 반응을 확인하였다.
또한, 본 발명에서는 코로나 19 환자의 PBMC 세포에서도 본 발명의 항원단백질의 면역 반응을 확인하기 위하여 증상 발생일에 따른 코로나19환자의 혈액을 확보한 후 혈액에서 PBMC 세포를 분리하였고, 분리된 세포에 본 발명의 항원 단백질을 자극하여 T 세포 면역반응 분석을 수행하였다. 그 결과 본 발명의 항원 단백질을 이용하여 코로나19 환자의 PBMC 세포에 자극을 주었을 경우 자극을 주지 않은 대조군과 비교하여 Th1, Th2 반응에서 CD3, CD4, CD8, TNF-α, IFN-γ 검출이 증가됨을 확인하였다. 또한 증상발생일에 따른 T 세포 면역 반응을 분석한 결과 증상발생 후 4주 째 검체에서 높은 T 세포 면역 반응이 일어나는 것을 확인하였다.
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 대장균 또는 식물세포에서 발현시켜 정제한 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(NP: nucleocapsid protein)을 SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 바이러스 감염에 의한 COVID-19의 예방 또는 치료를 위한 백신의 제조에 각각 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
그러므로 본 발명은 대장균 또는 식물세포에서 발현시켜 정제한 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(NP: nucleocapsid protein)을 포함하는 COVID-19 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 백신(vaccine)은, 생체에 면역반응을 일으키는 항원을 함유하는 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원을 말한다. 상기 동물은 인간 또는 비인간 동물로서, 상기 비인간 동물은 돼지, 소, 말, 개, 염소, 양 등을 지칭하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 "백신 조성물"은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 때는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제가 포함된다. 비수용성 제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥 내, 근육 내, 관절 내, 활액낭 내, 흉골 내, 경막 내, 병소 내 및 두개골 내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 백신 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 별다른 부작용 없이 개체에 면역반응을 유도하기에 필요한 양은 면역원으로써 사용된 재조합 단백질 및 부형제의 임의 존재에 따라 다양할 수 있다.
본 발명에서, 상기 백신 조성물의 제조방법은 아주번트(Adjuvant)를 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "아주번트(Adjuvant)"는 백신 또는 약학적으로 활성 있는 성분들에 첨가되어 면역반응을 증가시키거나 영향을 주는 물질 또는 조성물을 말한다. 대표적으로 면역원(immunogen)용 캐리어(carrier) 또는 보조 물질 및/또는 다른 약학적으로 활성 있는 물질 또는 조성물을 통상적으로 의미한다. 전형적으로, 용어 "아주번트"는 넓은 개념에서 해석되어야 하며, 상기 아주번트에 통합되거나 상기 아주번트와 함께 투여된 항원의 면역원성(immunogenicity)을 증진할 수 있는 넓은 범위의 물질 또는 책략(stratagerm)을 의미한다. 또한, 아주번트는, 이에 제한되지 않고, 면역 강화제(immune potentiator), 항원 전달계 또는 이들의 조합으로 나누어질 수 있다.
본 발명의 백신 조성물에는 아주번트가 추가로 더 포함될 수 있다. 또한, 상기 아주번트는 알럼(alum)일 수 있으나, 아주번트로 사용하기에 적합한 어떤 종류의 알루미늄 솔트(aluminium salt), 고분자라도 본 발명에 사용될 수 있다. 알루미늄 솔트는 알루미늄 하이드록사이드(Al(OH)3), 알루미늄 포스페이트(AlPO4), 알루미늄 하이드로클로라이드, 알루미늄 설페이트, 암모늄 알럼, 포타슘 알럼 또는 알루미늄 실리케이트 등이 포함된다. 바람직하게는, 알루미늄 솔트 아주번트로서 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포스페이트가 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
대장균으로부터 COVID-19 진단용 재조합 뉴클레오캡시드 단백질의 생산
SARS-CoV-2 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid protein; NP)의 유전자 서열을 히스티딘이 표지된 T7 프로모터를 포함하는 발현 벡터에 클로닝하여 재조합 발현벡터를 제조한 다음, 상기 발현벡터를 대장균에 형질전환하고 배양하여 상기 대장균으로부터 항원성 단백질인 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 분리 및 정제하였다.
구체적으로, SARS-CoV-2 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 대장균으로부터 대량으로 생산할 수 있는 발현벡터를 얻기 위하여 pET21a의 T7 프로모터 하류에 서열번호 1의 뉴클레오캡시드 유전자를 클로닝 하여 pET21a-NP 재조합 발현벡터를 제작하였다(도 1 참조). 상기 발현벡터에는 lac l 유전자가 존재하기 때문에, IPTG(Isopropyl thio-beta-D-galscoside) 첨가하여 T7 프로모터로부터 뉴클레오캡시드 단백질의 발현을 유도하였다. 이후, 대장균에서 발현벡터의 도입에 의해 발현된 재조합 뉴클레오캡시드 단백질은 위양성에 영향을 주지 않는 6개의 히스티딘 잔기가 C-말단에 융합된 상태로 발현되므로, 히스티딘 친화 수지를 이용하여 당업계에 공지된 단백질 정제 방법에 따라 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 정제하였고, 상기 방법에 따라 대장균으로부터 발현 및 정제한 본 발명의 항원성 재조합 뉴클레오캡시드 단백질은 419개의 아미노산으로 이루어진 약 48 kDa의 크기를 가진 단백질임을 확인하였다. 상기와 같이 대장균으로부터 정제한 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(rNP)의 아미노산 서열은 서열번호 3에 나타내었다.
<실시예 2>
식물체로부터 COVID-19 진단용 재조합 뉴클레오캡시드 단백질의 생산
SARS-CoV-2 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid protein; NP)을 식물체로부터 발현 및 정제하기 위해 다음과 같은 과정을 수행하였다.
상기 실시예 1에 나타낸 바와 같이, SARS-CoV-2 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid protein; NP)을 식물체에서 발현하기 위해 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)에서의 발현에 최적화된 서열로 유전자를 합성하였고, 코돈 최적화된 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 염기서열은 서열번호 2에 나타내었다.
니코티아나 벤타미아나의 엽록체로 표적화시켜 본 발명의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 발현하기 위한 발현용 식물 벡터는 pCAMBIA1300 벡터를 기본 벡터로 사용하였으며, CaMV35S 프로모터 유전자와 HSP 종결자(terminator) 사이에 NR(Rbc-TP, 루비스코 트랜짓 펩타이드)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 4), 코돈 최적화된 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 2), 6xHis(폴리히스티딘-태그)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 6), HDEL(ER retention signal peptide) 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 7)를 순차적으로 연결하여 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질 발현용 벡터(pCAMBIA1300-NP Recombinant vector)를 제조하였다(도 2 참조).
제조된 식물발현 재조합 벡터는 아그로박테리아 LBA4404 균주에 전기충격법 (Electrophoration)을 이용하여 형질전환 후 5mL의 YEP 액체배지 (효모 추출물 10g, 펩톤 10g, NaCl 5g, 카나마이신 50mg/L, 리팜피신 25mg/L)에서 28℃의 조건으로 16시간 동안 1차로 진탕배양 했다. 배양액 1ml을 50ml의 새 YEP 배지에 접종하여 28℃의 조건에서 6시간 동안 2차로 진탕배양 하였다. 이렇게 배양된 아그로박테리아는 원심분리(7,000rpm, 4℃, 5분)하여 수집한 후, 600nm의 파장에서 흡광도(O.D) 값이 1.0이 되도록 인필트레이션(Infiltration) 버퍼[10mM MES (pH 5.7), 10mM MgCl₂, 200μM 아세토시링곤]에 현탁 시켰다. 아그로박테리아 현탁액은 주사바늘을 제거한 주사기를 이용하여 니코티아나 벤타미아나 잎의 뒷면에 주입하는 방법으로 아그로-인필트레이션(Agro-infiltration)을 수행하였다. 상기 방법에 따라 제작된 NP 발현용 식물은 파쇄 후 히스티딘 친화 수지를 이용하여 당업계에 공지된 단백질 정제 방법에 따라 본 발명에 따른 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 식물로부터 정제하였다. 또한 상기 방법에 따라 식물로부터 정제한 본 발명의 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(rNP)의 아미노산 서열은 서열번호 3에 나타내었다.
<실시예 3>
본 발명의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 이용한 혈청학적 분석으로COVID-19 진단 가능성 확인
본 연구는 조선대학교 병원(IRB 2020-02-011-003), 서울대학교(IRB B-2008 / 633-304), 영남대학교(IRB 2020-05-080)의 기관 심의위원회(IRB)의 승인을 받아 수행하였고, 모든 참가자로부터 서면 동의를 얻었으며, 모든 실험은 관련 지침 및 규정에 따라 수행하였다.
<3-1> 실험방법
① SARS-CoV-2에 감염된 양성 환자의 정의
양성 사례는 하기 설명된 바와 같이 바이러스 분리 및 2개 유전자를 표적으로 하는 rRT-PCR을 포함하는 진단방법에 의해 확진된 COVID-19 감염증 환자로 정의하였다. 음성 혈청은 COVID-19 대유행 이전에 수득한 시료들을 사용하였다. 이들은 아래에 언급 된 두 가지 컷오프 값을 기준으로 실제 SARS-CoV-2 진단과의 적합성을 평가하여 총 Ab ELISA 분석에 대한 양성 및 음성을 확인하였다. 결과적으로 환자 샘플의 OD 값이 SARS-CoV-2 샘플로부터 계산된 컷오프 값보다 큰 경우, 총 Ab ELISA 결과는 참 양성으로 간주하였다(하기 표 1 참조).
② 환자 및 데이터 소스
COVID-19 확진 환자를 모집하고 COVID-19 관련 증상의 존재 여부에 따라 추가 분류를 수행하였으며, 이 환자들은 조선대학교 병원, 영남대학교 병원, 분당 서울대학교 병원의 3개 병원에 입원한 환자들이다. SARS-CoV-2에 대한 총 Ab (IgG, IgM 및 IgA) 반응은 식물 및 대장균 유래의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 기반으로 하는 간접 ELISA로 분석하였고, 각 시점에서 450nm(OD450)에서 평균 OD를 측정하였다. 음성 대조군은 2015년~2017년까지 COVID-19 대유행 이전에 조선대학교 병원에서 정기 건강검진을 받은 건강한 개인으로부터 얻은 158개의 혈청 샘플을 사용하였다.
③ 정량적 실시간 RT-PCR 및 SARS-CoV-2의 분리
Real-prep viral DNA/RNA Kit(한국, Biosewoom)를 이용한 완전 자동화 기기(Bio-seam, 대한민국)를 사용하여 비인두 및 객담으로부터 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 제조업체의 지침(Kogenebiotech, 대한민국 서울)에 따라 E 유전자와 RNA 의존성 RNA 중합효소를 표적으로 하는 실시간 역전사 PCR(rRT-PCR)을 수행하였다. SARS-CoV-2 바이러스를 분리를 위해, 각 환자의 임상 검체를 20X 페니실린/스트렙토마이신(ThermoFisher Scientific, Loughborough, United Kingdom)으로 4°C에서 1 시간 동안 처리하였고, 이후 20분 동안 원심분리하여 바이러스 입자를 함유한 상등액을 수득하였으며, 이를 Vero 세포 E6에 접종하였다. 세포를 바이러스 세포 배양배지에 현탁하고, 3~5 일 동안 37 ℃에서 배양하였다. 이어서, 상기 기술한 바와 같이, RNA 추출을 위해 상등액을 수득하였다. 또한 바이러스의 증식확인은 5일 간격으로 2회 계대배양 후, rRT-PCR을 수행하여 확실하게 Ct(cycle threshold) 값 <20인 것을 확인함으로써 수행하였다.
④ ELISA로 SARS-CoV-2의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(rNP)에 대한 총 항체 확인
ELISA를 사용하여 SARS-CoV-2에 대한 혈청 항체를 분석하였다. 구체적으로, 96-웰 ELISA 마이크로 플레이트(Thermofisher Scientific Korea. Ltd.)를 웰당 100ul의 식물 유래 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(2ug/ml) 또는 대장균 유래 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(2ug/ml)로 4℃에서 밤새도록 처리하여 코팅하였다. 0.05% 의 Tween-20(PBS-T)이 함유된 PBS 버퍼로 마이크로 플레이트를 3회 세척하였고, 이후 블록킹 버퍼(5% 스킴밀크를 포함하는 PBS-T 버퍼)를 첨가하고 2시간 동안 37℃에서 처리하였다. 4회 세척 후, 검체(혈청)를 블록킹 용액으로 100배 희석하여 처리하고 37°C에서 2시간 동안 반응시켰다. 플레이트를 5회 재세척하고, 100μl 희석된 HRP-접합 염소 항-인간 총 Ab(1 : 40,000, ThermoFisher Scientific, Cat 31418, 2차 항체) 용액을 처리하고 37 °C에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 50μl의 3, 3 ', 5, 5'- 테트라메틸벤지딘 기질(TMB, Sigma-Aldrich, USA)을 암 조건의 실온에서 각 웰에 첨가하였고, 60 분 후 1M H2SO4 25μl로 반응을 중단하였으며, 각 웰을 450nm 흡광도로 측정하였다. 모든 실험은 3번 수행하였다.
⑤ 데이터 분석
(i) 컷오프 값을 통한 양성 또는 음성 ELISA 결과 결정
총 Ab를 이용한 ELISA 분석에 대하여 최상의 컷오프 값을 확인하기 위해 하기 기술된 2 가지 계산 방법을 수행하였다.
a. 생성된 ROC(receiver operating characteristic) 곡선(벨기에 Ostend에 소재한 MedCalc Software Ltd)을 통해 첫 번째 최적 컷오프 값(민감도와 특이성 간의 최대 절충)을 확인함. 권장 컷오프 값은 각각 식물 유래 rNP 및 E. coli 유래 rNP 기반 ELISA 분석에 대해 >0.5 및 >1.2이고, 테스트의 정확성을 평가하기 위해 ROC 곡선 아래 면적(AUC)도 계산하였다.
b. 두 번째 컷오프 값은 158개의 음성대조군을 이용하여 450nm에서 평균 OD+ 3배 표준편차 (평균 + 3SD)로 식별하였다. 획득한 컷오프 값은 각각 식물 rNP 및 E. coli rNP 기반 ELISA 분석에 대해 >0.7 및>2.2이었다.
(ii) 컷오프 값 및 SARS-CoV-2- 양성 샘플을 사용한 ELISA 성능분석
총 Ab ELISA의 성능분석을 위해, 획득한 2가지의 컷오프 값 각각은 SARS-CoV-2 양성 샘플을 이용하여 평가하였다. 민감도, 특이성, 양성 예측값 (PPV), 음성 예측값(NPV) 및 정확도를 계산하고 비교하였고(상기 표 2 참조), 매개 변수의 결과는 표 2에서 추가로 분석하였다.
⑥ 유세포 분석법을 통한 뉴클레오캡시드 항원 단백질의 T 세포 면역 반응 유도 반응 검사
본 발명의 뉴클레오캡시드의 면역 유도능을 확인하기 위하여 유세포 분석법을 통하여 분석하였다. 구체적으로는 마우스에 재조합 뉴클레오캡시드 항원 단백질로 면역화하였다. 이후 비장을 적출한 후 세포 스트레인어(cell strainer)를 이용하여 비장세포 얻었다. 얻어진 비장세포에 RBC 용해버퍼를 첨가하고 상온에서 5분간 반응시켰다. 이후 원심분리(800g, 5 min) 진행 후, 상층액을 버린다음 배지를 첨가하고 96웰 플레이트에 세포를 분주하였다. 세포의 면역을 자극하기 위하여 본 발명의 식물 유래 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 2ug/웰로 넣은 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 13시간 배양하였다. 위 방법을 통하여 면역화된 면역세포에 형광이 표지된 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 특이 항체 및 형광이 표지된 TNF-α, IFN-γ 항체로 염색한 유세포 분석을 이용하여 분석하였다.
또한 본 발명에서는 코로나 19 환자의 PBMC 세포에서도 본 항원단백질의 면역 반응을 확인하기 위하여 코로나 19 환자의 증상 발생일에 따른 환자의 혈액을 수득하였고, 당일 PBMC를 일련의 과정을 통하여 분리, 보관, 시험하며, 면역반응 분석을 진행하였다. 분리된 PBMC 세포는 본 발명의 식물 유래 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 이용하여 세포를 자극 하였다. 이후 CD3, CD4, CD8 마커와 각각의 T 세포들이 분비하는 사이토카인을 확인하기 위하여 TNF-α, IFN-γ 마커를 이용하여 세포 면역반응을 분석하였다.
<3-2> 결과
SARS-CoV-2 감염에 양성인 32명의 환자로부터 총 141개의 샘플을 수득하였는데, 구체적으로 30명의 증상이 있는 환자로부터 128개의 혈청을 수득하였고, 2명의 무증상 환자로부터 13개의 혈청을 수득하였다.
① ROC 곡선에서 권장하는 컷오프 값을 이용한 식물 및 대장균 유래 재조합 뉴클레오캡시드 단백질 기반의 ELISA 분석비교 결과
본 발명의 실시예에 따라 식물 및 대장균으로부터 발현 및 정제한 각각의 항원성 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(rNP)의 민감도를 확인하기 위해, 증상 및 무증상의 모든 양성 환자로부터 수득한 혈청 샘플에서 SARS-CoV-2에 대한 총 항체(Ab) 수준을 평가하였다.
총 141 개의 혈청 표본 중, 식물 유래 rNP 기반의 분석 결과, 131개, 즉 92.91 % [95 % 신뢰 구간 (87.34, 96.55)]의 검출 민감도를 나타내었고, 대장균 유래 rNP 기반의 분석 결과, 107개, 즉 75.89 % (67.97, 82.69)의 검출 민감도를 나타내었다(상기 표 2 참조). 이들 결과는 모두 통계적으로 유의미한 값인 것으로 나타났다(p=0.0001). 또한, 식물 rNP 기반 ELISA 분석에 사용한 10개의 위 음성 샘플은 증상 발병 후 10일 이내에 얻은 샘플을 사용한 것이다(도 4A).
또한, 식물 및 대장균 유래 rNP를 이용한 ROC 분석 결과에서, 식물 유래 rNP를 사용한 경우, AUC 값이 0.936 (0.902, 0.961)으로 나타났고, 대장균 유래 rNP를 사용한 경우에는 AUC 값이 0.870 (0.826, 0.906)으로 나타났다(도 3 참조).
또한, 검출 특이성 분석을 위해 COVID-19 대유행 이전에 수득한 건강한 검체 유래 혈청을 대상으로 분석한 결과, 총 158개의 혈청 시료를 대상으로 분석한 결과에서 특이성은 식물 유래 rNP의 경우, 94.30 % (89.46, 97.36)인 것으로 나타났고, 대장균 유래 rNP의 경우, 98.10 %(94.55, 99.61)인 것으로 나타났다(표 2 참조).
② 평균+3SD로 확인된 컷오프 값을 이용한 식물 및 대장균 유래 재조합 뉴클레오캡시드 단백질 기반의 ELISA 분석비교 결과
상기 기술된 분석결과에서 식물 유래 rNP의 민감도 및 AUC 값이 대장균 유래 rNP 보다 유의적으로 높게 확인되었다(각각 p = 0.0001 및 p <0.0001). 한편, 식물 및 대장균 유래 재조합 단백질 모두 100 %의 검출 특이성이 있는 것으로 나타났다(표 3 참조). 참고로, AUC는 진단 분석의 정확도를 측정하는데 사용되는 지표이며, 일반적으로 0.90 이상의 값은 우수한 진단 정확도를 갖는 것으로 인정된다.
③ 질병 기간에 따른 총 항체의 혈청 전환(seroconversion) 분석결과
나아가 본 발명자들은 COVID-19 감염증이 걸린 질병 기간에 대한 전체 항체(Ab)의 생성 정도를 분석하기 위해, 혈청 샘플을 주별로 그룹화하여 수집하였다. 이를 위해 30 명의 증상이 있는 환자로부터 128개의 샘플을 수집하였고, 이중 증상 발병일(0 일)과 6일 PSO(1 주) 사이에 28개의 샘플이 수집되었고, 7일에서 13일(2 주)사이에는 25개의 샘플이 수집되었으며, 14일에서 20일까지 21개의 샘플이 수집되었고, 20일 이후(>3주)로는 54개의 샘플이 수집되었다. 긍정적인 결과의 비율은 PSO시간이 증가함에 따라 증가하는 것으로 나타났다(표 4, 표 5 및 도 5 참조).
ROC에서 권장하는 컷오프 값의 결과를 사용하여 전체 Ab의 혈청전환 분석에서, 식물 유래 rNP를 이용한 ELISA 분석결과, 증상이 시작된 날에 PSO 중앙값이 5일(interquartile range, IQR, 1-9 days)로 일찍 발생하는 것으로 나타난 반면, 대장균 유래 rNP 기반 ELISA 분석결과에서는 7일 PSO(IQR, 1-10 일)인 것으로 나타났다. 전체 Ab가 출현되는 시간은 PSO 0일에서 90일 사이인 것으로 나타났다(도 4 참조). 또한 민감도 분석에서 2주 이내에 식물 유래 rNP를 사용한 군이 대장균 유래 rNP 보다 유의하게 높은 민감도를 보였고(p = 0.0313), 우수한 검출능을 나타내었다(표 4 참조). 특히, 식물로부터 발현 및 정제한 rNP의 경우, 혈청 전환된 샘플에서 증상 발병 10일 후 100% 수준의 안정된 상태를 보이는 것으로 나타났다(도 4A 및 도 5). 또한 식물유래 rNP를 이용한 경우, 처음 양성 결과를 받고 혈청학적으로 음성으로 확인된 예는 발견되지 않았다. 한편, 대장균 유래 rNP를 이용한 경우에서는 3명의 환자에서 양성 결과 후 혈청학적으로 음성으로 확인되는 결과를 확인하였다.
또한, 식물 및 대장균 유래 rNP을 함유한 음성 샘플의 중앙값은 식물 유래 rNP의 경우, 0.3 (IQR, 0.2-0.4)인 것으로 나타났고, 대장균 유래 rNP는 1(IQR, 0.7-1.3)인 것으로 나타났다. 양성 혈청에 대한 중앙 OD는 질병 기간에 따라 증가한 것으로 나타났는데, 1 ~ 10 일 PSO에서 식물 유래 rNP는 0.9(IQR, 0.4 ~ 1.8), 대장균 유래 rNP는 1.9 (IQR, 1.4 ~ 2.3)인 것으로 나타났다(도 4). 특히, 식물 유래 rNP의 경우, 중앙값 OD가 계속 증가하여 61-70 일에는 2.7 (IQR, 2.7-2.9)의 피크에 도달했으며, 이는 PSO 90 일까지 유지되는 것으로 나타났다(도 2A). 한편, 식물 유래 rNP의 결과는 대장균 유래 rNPs에서 관찰되지 않았다(도 4B).
④ 무증상 감염의 진단 가능성 확인
나아가 본 발명자들은 식물 및 대장균에서 발현 및 정제한 본 발명의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질이 무증상 COVID-19 감염 여부를 진단할 수 있는지 확인하기 위해, 다음과 같은 실험을 수행하였다.
실험에 참여한 환자들 중, 2명의 환자(2/32, 6.25 %)가 잠복성 무증상 감염자이고 접촉 추적을 통해 확인하였다. 2명 모두 질병이 진행되는 동안 증상이 없었지만, 본 발명의 식물 및 대장균 유래 rNP를 이용한 ELISA 분석을 통해, 입원한지 3 일과 10일 이내에 혈청을 이용한 반응에서 양성을 보였고, 항원-항체 반응은 3 주 이상 지속되는 것으로 나타났다.
⑤ 본 발명의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질의 T 세포 면역 유도 규명
또한, 본 발명에서는 본 발명의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질의 T 세포 면역 유도 반응을 확인하기 위하여 마우스를 면역화 후 유세포 분석법으로 분석하였는데, 그 결과 CD4+ T 세포에서는 본 발명의 재조합 뉴클레오캡시드 항원 단백질로 자극하였을 경우 TNF-α의 생산이 유도되는 것으로 나타났고, CD8+ T 세포의 경우에도 TNF-α의 생산이 유도되는 것으로 나타났다(도 6 참조).
또한, 코로나19 환자의 혈액에서 분리한 PBMC 세포를 대상으로 본 발명의 항원 단백질인 재조합 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 면역반응을 확인한 결과, Th1, Th2 반응에서 CD3-CD4 T 세포에서 TNF-α, IFN-γ 가 코로나19 환자에서 증가함을 확인하였으며, 또한 CD3-CD8 T 세포에서도 마찬가지로 TNF-α, IFN-γ 증가됨을 확인하였다. 뿐만 아니라 코로나 19 증상 일자에 따른 T 세포 면역반응에 대해 확인한 결과, 증상 발생 후 2-4개월째에 CD4, CD8 T세포에서 TNF-α, IFN-γ 분비하는 세포의 양이 가장 높은 경향 보이는 것을 확인하였다(도 7 참조).
이러한 결과를 통해 본 발명에 따른 식물 및 대장균에서 발현되고 정제한 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(rNP)은 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 주요 면역원성 단백질, 즉 항원 단백질로 작용할 수 있음을 확인하였고, 이를 이용하여 SARS-CoV-2의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(rNP)에 대한 전체 항체(Ab)를 검출할 수 있음을 알 수 있었고, 혈청학적 분석을 통해 COVID-19 감염증을 신속하고 정확하게 진단할 수 있음을 알 수 있었으며, 특히 식물 유래 재조합 단백질이 대장균 유래 재조합 단백질 보다 더 우수한 검출 및 진단 효과가 있는 것으로 나타났다.
또한, 상기와 같은 실험을 통해 SARS-CoV-2 감염의 진단 및 스크리닝을 위한 컷오프를 설정할 수 있었고, 결과에 따르면 식물 유래 rNP를 기반으로 한 분석은 평균+3SD와 비교하여 ROC 분석으로 산출된 컷오프 값을 사용하는 것이 더 우수한 검출능을 보임을 알 수 있었다.
또한, 본 발명에 따른 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(rNP)을 이용하여 COVID-19 환자의 총 Ab 검출을 기반으로 한 분석은 무증상 감염을 식별하기 위한 혈청학적 조사로서 유용하게 사용될 수 있으며, 질병 진행의 전체 과정에서 생성되는 모든 항체를 모니터링하여 면역반응의 역학을 규명하는데 도움을 줄 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(rNP)은 T 세포 반응에서 우수한 항원 특이 면역원성을 나타내는 것으로 나타났고, 궁극적으로 면역활성의 증진을 통해 SARS-CoV-2 바이러스 감염을 방어할 수 있으며, COVID-19의 예방 또는 치료하기 위한 백신 제조에 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Chosun University
<120> Recombinant nucleocapsid protein for diagnosis and vaccine of
COVID-19 and use thereof
<130> NPDC85905.01
<160> 7
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1260
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 nucleocapsid DNA sequence for E.coli expression system
<400> 1
atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60
tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120
cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180
aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240
gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300
atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360
cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420
acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480
cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540
caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600
agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660
ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720
caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780
aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840
caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900
tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960
ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 1020
gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080
aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140
gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200
gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260
1260
<210> 2
<211> 1257
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Codon optimized SARS-CoV-2 nucleocapsid DNA sequence for plant
<400> 2
atgtccgata atggacccca aaatcaacga aatgcaccca gaattacttt tggtgggcca 60
tcagattcta ctggatctaa ccaaaatgga gaacgaagtg gtgcgcgatc aaaacaacgt 120
aggcctcaag gtttacccaa taatacggcc tcttggttta ccgctctcac gcaacatggc 180
aaggaagatc ttaagttccc taggggtcaa ggagttccaa ttaacaccaa ttcttcccct 240
gatgaccaaa ttggctatta cagaagggca accagaagaa ttaggggagg tgacggtaaa 300
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caacaaggcc aaactgtcac taaaaaatct gctgctgagg cttctaagaa acctagacaa 780
aagagaactg ccactaaggc atacaacgta acacaagctt ttggcagacg tggaccagaa 840
caaacacaag ggaattttgg ggaccaagaa cttatcagac aaggaactga ttacaagcat 900
tggccacaaa ttgcacaatt tgcaccaagt gcttcagcgt tcttcggcat gagtagaatt 960
ggcatggagg ttacaccttc gggaacgtgg ttgacctata caggagctat caaattggac 1020
gacaaagacc caaattttaa agatcaagtg atattgctga ataagcatat agatgcatat 1080
aaaacattcc ctccaacaga gcctaaaaag gataagaaga agaaagcaga tgaaactcaa 1140
gcattaccgc aaagacaaaa gaaacaacaa actgtgactc ttcttcctgc tgcggatctt 1200
gatgatttct ccaagcaatt acaacaatcc atgagctctg ctgattctac tcaagct 1257
<210> 3
<211> 419
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant nucleocapsid protein for diagnosis and prevention of
<400> 3
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg
20 25 30
Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
35 40 45
Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu
50 55 60
Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro
65 70 75 80
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
85 90 95
Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr
100 105 110
Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp
115 120 125
Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
130 135 140
His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln
145 150 155 160
Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser
165 170 175
Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn
180 185 190
Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala
195 200 205
Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu
210 215 220
Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln
225 230 235 240
Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys
245 250 255
Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln
260 265 270
Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp
275 280 285
Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile
290 295 300
Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile
305 310 315 320
Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala
325 330 335
Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu
340 345 350
Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro
355 360 365
Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu
385 390 395 400
Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser
405 410 415
Thr Gln Ala
<210> 4
<211> 237
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NR(Rbc-TP) polynucleotide sequence
<400> 4
atggcttcct ctatgctctc ttccgctact atggttgcct ctccggctca ggccactatg 60
gtcgctcctt tcaacggact taagtcctcc gctgccttcc cagccacccg caaggctaac 120
aacgacacta cttccatcac aagcaacggc ggaagagtta actgcatgca ggtgtggcct 180
ccgattggaa agaagaagtt tgagactctc tcttaccttc ctgaccttac cgattcc 237
<210> 5
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NR(Rbc-TP) polypeptide sequence
<400> 5
Cys Met Gln Val Trp Pro Pro Ile Gly Lys Lys Lys Phe Glu Thr Leu
1 5 10 15
Ser Tyr Leu Pro Asp Leu Thr Asp Ser
20 25
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6xHis DNA sequence
<400> 6
caccaccacc accaccac 18
<210> 7
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of HDEL
<400> 7
cacgatgagc tc 12
Claims (14)
- 대장균 또는 식물세포에서 발현시킨 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(NP: nucleocapsid protein)로 이루어진, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 진단용 항원단백질.
- 제1항에 있어서,
상기 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 진단용 항원단백질. - (1) 코로나바이러스 감염증-19 의심환자로부터 시료를 채취하는 단계;
(2) 제1항의 항원단백질을 항원으로 이용하여 상기 시료로부터 항체를 검출하는 단계를 포함하는,
코로나바이러스 감염증-19(COVID-19)의 진단을 위한 정보제공 방법. - 제3항에 있어서,
상기 시료는 타액, 소변, 혈액, 혈장, 혈청, 객담, 비인두 도말 및 기관지 폐포 세척액으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19)의 진단을 위한 정보제공 방법. - 제3항에 있어서,
상기 (2) 단계의 항체 검출은 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블롯팅(Western Blotting), 면역형광(Immunofluorescence), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry staining), 유세포분석법(Flow cytometry), 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법 (Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay) 또는 단백질 칩(Protein Chip)으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19)의 진단을 위한 정보제공 방법. - 제3항에 있어서,
상기 방법은 혈청을 이용한 혈청학적 분석으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19)의 진단을 위한 정보제공 방법. - 제3항에 있어서,
상기 혈청학적 분석은 상기 혈청에 제1항의 항원단백질을 처리한 후, 항원-항체 반응에 의한 항체 검출율의 ROC 곡선에서 나타나는 컷오프(cut-off) 값을 확인하는 것을 특징으로 하는, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19)의 진단을 위한 정보제공 방법. - 제7항에 있어서,
상기 항원단백질로서 식물세포에서 발현시킨 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 사용하는 경우, 컷오프(cut-off) 값이 0.5를 초과하면 SARS-CoV-2 바이러스에 감염된 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19)의 진단을 위한 정보제공 방법. - 제7항에 있어서,
상기 항원단백질로서 대장균에서 발현시킨 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 사용하는 경우, 컷오프(cut-off) 값이 1.8을 초과하면 SARS-CoV-2 바이러스에 감염된 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19)의 진단을 위한 정보제공 방법. - 제1항의 대장균 또는 식물세포에서 발현시킨 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(NP: nucleocapsid protein)을 항원으로 이용하는, SARS-CoV-2 바이러스에 대한 항체 측정방법.
- 제1항의 항원단백질을 포함하는, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 진단키트.
- 제1항의 항원단백질을 포함하는, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 예방 또는 치료용 백신 조성물.
- 제12항에 있어서,
상기 항원단백질은 세포성 면역반응 유도활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 예방 또는 치료용 백신 조성물. - 제13항에 있어서,
상기 세포성 면역반응 유도활성은 INF-γ 또는 TNF-a를 분비하는 CD4+ T세포 또는 CD8+ T세포의 활성 및 증식을 촉진시키는 것을 특징으로 하는, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 예방 또는 치료용 백신 조성물.
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|---|---|---|---|
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| KR20200040525 | 2020-04-02 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| KR20230123774A (ko) | 2022-02-17 | 2023-08-24 | (주) 팬젠 | 코로나바이러스 유래 신규 융합 단백질 및 이의 용도 |
| WO2023211281A1 (en) * | 2022-04-28 | 2023-11-02 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Antiviral vaccine composition |
-
2021
- 2021-04-02 KR KR1020210043346A patent/KR20210123234A/ko not_active Application Discontinuation
Non-Patent Citations (2)
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|---|
| 1.Circ Res. 2016 April 15; 118(8): 1313-1326. |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20230123774A (ko) | 2022-02-17 | 2023-08-24 | (주) 팬젠 | 코로나바이러스 유래 신규 융합 단백질 및 이의 용도 |
| WO2023211281A1 (en) * | 2022-04-28 | 2023-11-02 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Antiviral vaccine composition |
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