CN110483625A - 一种牛支原体假想蛋白MbovP732及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛支原体假想蛋白MbovP732，该蛋白具有如序列表SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，编码所述蛋白的基因，具有如序列表SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。该蛋白具有反应原性和免疫原性，能特异性地与牛支原体野毒株反应，而不能与疫苗株反应，因此可用于鉴别牛支原体野毒株感染与疫苗株免疫。

Description

一种牛支原体假想蛋白MbovP732及其应用

技术领域

本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及到一种牛支原体假想蛋白MbovP732及其应用。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)是支原体属中牛的重要致病性病原，它能够引起牛的乳腺炎、肺炎、关节炎及角膜结膜炎等多种疾病，同时也是引起牛呼吸疾病综合征的主要病原。1961年，首次从美国患有严重乳腺炎的病牛中分离得到，之后便通过动物的迁徙在各个国家传播，对养牛业造成巨大的经济损失。

在我国，2008年在湖北省从外地引进的肉牛群中爆发了呼吸系统疾病，牛群引进后大约两周发病，表现为发热、咳嗽、流鼻涕，犊牛和体质弱的肉牛发病严重。华中农业大学微生物学国家重点实验室反刍动物病原分室通过病原分离鉴定，率先确定了该病为“传染性牛支原体肺炎”，之后陆续在新疆、宁夏、青岛等多个省份相继暴发相似的病例。传染性牛支原体肺炎发病率达到50-100％，病死率高达10-50％，严重威胁养牛业的发展。

由于抗生素治疗牛支原体病效果不佳，商业化灭活疫苗不能有效减缓该病的发生，本实验室前期已经成功研制出牛支原体弱毒疫苗(HB150株)，通过临床动物试验证明该疫苗保护性好、安全性高、免疫保护期长。但由于动物感染牛支原体野毒与免疫弱毒疫苗均能够引起血清抗体的升高，而目前缺乏有效的血清学方法以区分牛支原体自然感染与疫苗免疫的群体，临床上难以判断弱毒疫苗是否免疫成功。本申请人所在的农业微生物学国家重点实验室病毒分室通过比较基因组学与免疫蛋白质学发现牛支原体强弱菌株差异蛋白MbovP730蛋白具有很强的免疫原性和反应原性，并成功地将MbovP730蛋白作为鉴别诊断牛支原体野毒感染及疫苗免疫的分子靶标，该蛋白于2016年3月11日申请了发明专利，并在CN107176977A的专利文献中公开，但是MbovP730蛋白仍存在检测准确度不够高等缺陷。

发明内容

本发明的目的在于针对上述缺陷，提供一个可以鉴别诊断牛支原体野毒感染与疫苗免疫动物的分子标识MbovP732蛋白。

本发明的另一个目的在于提供一种检测牛支原体MbovP732蛋白抗体的特异性检测方法，用于区分牛支原体感染与否以及评价疫苗免疫效果，本发明的目的还包括重组MbovP732蛋白(即：His-rMbovP732)在鉴别诊断牛支原体野毒感染与疫苗免疫血清学方法中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施和路线：

申请人所用的牛支原体HB0801株(武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2010040)为申请人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原学分室于2008年6月从湖北省应城市某养牛场发病的黄牛的肺组织中分离得到，该牛支原体分离株已在CN109750054A的专利文献中公开。

牛支原体HB150株(武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2011102)为申请人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原学分室将牛支原体HB0801株体外连续传至150代所得到的弱毒株。

本发明以牛支原体HB0801(基因组在GenBank上的登录号为CP002058)中Mbov_0732基因为基础，根据大肠杆菌对密码子的偏爱性，将编码色氨酸的密码子TGA优化为密码子TGG，同时将某些密码子进行优化使其在大肠杆菌中高效表达，人工合成优化后Mbov_0732基因。

经过人工优化合成后的牛支原体基因Mbov_0732的核苷酸序列是序列表SEQ IDNO:2的1-990位碱基所示的序列，其长度为990bp。

该牛支原体MbovP732蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，共编码329个氨基酸。

将本发明的牛支原体Mbov_0732基因的核苷酸序列通过构建质粒载体pET-30a-Mbov_0732转化大肠杆菌DH5α得到重组的大肠杆菌菌株，申请人将该重组的大肠杆菌菌株命名为大肠杆菌pET-30a-Mbov_0732(Escherichia coli pET-30a-Mbov_0732)，于2019年5月20日送交湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2019375。该菌株在IPTG诱导下，表达Mbov_0732基因编码的重组蛋白His-rMbovP732。

经过验证，本发明纯化的His-rMbovP732蛋白具有反应原性和免疫原性，可以作为牛支原体血清抗体的诊断抗原，也可通过制备多克隆抗体进行牛支原体抗原检测。

另外，His-rMbovP732蛋白能特异性地与牛支原体野毒株反应，而不能与疫苗株反应，因此可用于鉴别牛支原体野毒株感染与疫苗株免疫。尤其是，His-rMbovP732蛋白与本申请人之前公开的MbovP730蛋白相比，具有更好的反应原性和特异性，能更加准确地区分牛支原体野毒感染与弱毒疫苗免疫血清，因此更适合作为牛支原体鉴别诊断的靶抗原。

本发明具有以下优点：

1、本发明的抗原蛋白MbovP732是发明人从牛支原体HB0801株全菌蛋白中筛选出来的新型免疫原性蛋白。

2、本发明的抗原蛋白MbovP732鉴别诊断牛支原体野毒株与弱毒疫苗株感染优于同类蛋白MbovP730，利用该蛋白抗原建立间接ELISA能有效区分牛支原体野毒感染与弱毒疫苗免疫群体。

3、目前国内外市场上商品化牛支原体ELISA抗体检测试剂盒不能区分牛支原体野毒感染与疫苗免疫动物，本发明的抗原蛋白His-rMbovP732能够有效鉴别诊断野毒株与弱毒疫苗株，以本发明的蛋白制备的试剂盒能够为牛支原体弱毒疫苗HB150的应用提供配套诊断技术。

更详细的发明方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

图1：pET-30a的质粒图谱。pET-30a为商业化质粒，购自Novagen公司。

图2：重组质粒pET-30a-Mbov_0732图谱。重组质粒pET-30a-Mbov_0732是由pET-30a质粒和优化合成后的Mbov_0732基因全长经过限制性内切酶消化后连接重组而成。

图3：本发明纯化的牛支原体His-rMbovP732蛋白胶图。泳道M：蛋白质marker；1：纯化的牛支原体His-rMbovP732重组蛋白。

图4：Western blot分析His-rMbovP732蛋白的反应原性。泳道M：蛋白质marker；1：牛支原体HB0801攻毒阳性血清；2：牛支原体HB150免疫阳性血清；3：牛支原体阴性血清。

图5：Western blot分析His-rMbovP732蛋白在强弱菌株间差异表达。泳道M：蛋白质marker；1：牛支原体HB0801株全菌蛋白；2：牛支原体HB150株全菌蛋白。

图6：His-rMbovP732蛋白作为包被抗原检测临床野毒感染、弱毒疫苗血清及阴性血清的结果。**P<0.01，***P<0.001。

图7：His-rMbovP730蛋白作为包被抗原检测临床野毒感染、弱毒疫苗血清及阴性血清的结果。*P<0.05。

图8：包被His-rMbovP732蛋白通过间接ELISA诊断牛支原体强弱菌株感染的结果。牛支原体野毒感染和疫苗株免疫检测及阈值的确定，当阈值为0.183时，检测的敏感性为94％，特异性为100％。

图9：免疫组加拿大牛支原体抗体检测试剂盒检测结果。

图10：免疫组His-rMbovP732-iELISA方法检测结果。

图11：对照组加拿大牛支原体抗体检测试剂盒检测结果。

图12：对照组His-rMbovP732-iELISA方法检测结果。

具体实施方式

实施例1：牛支原体MbovP732蛋白克隆表达和纯化

1.1牛支原体Mbov_0732基因克隆表达

由于大肠杆菌对密码子的偏爱性，本发明中牛支原体编码色氨酸的密码子UGA在大肠杆菌被用作终止子，因此，用大肠杆菌表达牛支原体基因时，需要对牛支原体基因进行突变，使密码子UGA突变为能在大肠杆菌中表达色氨酸的密码子UGG。

本发明根据大肠杆菌对密码子的偏爱性以及使基因在大肠杆菌中能够高效表达，对牛支原体HB0801(基因组GenBank登录号为CP002058)中的Mbov_0732基因序列进行克隆修饰，然后人工合成优化后Mbov_0732基因的全序列，序列长度为990bp(见序列表SEQ IDNO：2中1-990位碱基所示的序列，其编码区也是1-990位碱基对应的序列)。优化后的基因由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。

将合成的Mbov_0732基因产物，用BamHⅠ和XhoⅠ酶切(内切酶购自美国NEB公司)，同时将pET-30a质粒(图1)(购自默克中国有限公司)用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，将酶切后的Mbov_0732基因和pET-30a质粒用DNA连接酶(T4DNA ligase)连接。得到重组质粒pET-30a-Mbov_0732(图2).用该重组质粒pET-30a-Mbov_0732转化大肠杆菌DH 5α后，置于37℃摇床在180r/min下培养12小时，提取质粒经过测序正确后转化大肠杆菌BL21，将该大肠杆菌在LB液体培养基中培养至OD＝0.6时取1mL菌液作为诱导前对照，同时加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG，购自美国Invitrogen公司)至终浓度为0.8mM，37℃摇床诱导表达3小时。取1mL菌液进行下一步处理：样品处理方法为12000r/min离心1min后弃掉上清加入1mL磷酸盐缓冲液即PBS(配方：KCl 0.2g，NaCl 8g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，1000mL蒸馏水，pH＝7.6)溶液重悬后再以12000r/min离心1min弃掉上清，然后加入30uL的PBS和30uL上样缓冲液(1MTris-HCl(pH＝6.8)1mL，200mM DDT 0.31g，4％SDS 0.4g，0.2％溴酚蓝0.02g，20％甘油2mL，7mL超纯水)重悬。100℃沸水中煮沸10min。用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定是否表达。

经过密码子修饰和优化后的基因与牛支原体Mbov_0732基因的同源性为81％，但是在蛋白水平上的同源性达到100％。因此，重组MbovP732蛋白(His-rMbovP732)和牛支原体MbovP732天然蛋白应该具有相同的功能。

将本发明的蛋白核苷酸序列通过构建质粒载体pET-30a-Mbov_0732转化到大肠杆菌DH5α中得到重组大肠杆菌，申请人将该重组的大肠杆菌命名为大肠杆菌pET-30a-Mbov_0732；Escherichia coli pET-30a-Mbov_0732，于2019年5月20日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2019375。

1.2牛支原体His-rMbovP732重组蛋白的纯化

将重组的大肠杆菌BL21按上述方法诱导表达后，取菌液8000r/min离心10min后弃掉上清，用500mL的PBS洗一次后在8000r/min离心10min，再重复用500mL的PBS洗一次。弃掉上清后加入30mL的PBS重悬，加入蛋白酶抑制剂(购自罗氏公司)，使用液压破碎仪破碎。破碎后以12000r/min离心30min，取30μL上清加入30μL上样缓冲液，在沸水中煮沸10min作为上清组。取少许沉淀加入30μL的PBS和30μL上样缓冲液煮沸10min作为沉淀组。经过SDS-PAGE凝胶电泳后，确定His-rMbovP732蛋白大部分表达于上清中。

His-rMbovP732蛋白具体纯化步骤如下：

(1)向亲和层析柱中加入1mL Ni-NTA金属螯合His蛋白纯化介质填料(购自GE公司)；

(2)向亲和层析柱中加入12mL ddH₂O洗涤；

(3)加入12mL的Binding buffer(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl，20mM咪唑，pH＝7.4)平衡柱子；

(4)加入经过0.45μm孔径滤器过滤的蛋白表达上清，收集前几滴滤出液体，编号为1；

(5)加入50mL Binding buffer缓冲液平衡柱子，收集前几滴液体，编号为2；

(6)加入50mL Washing buffer缓冲液(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl，60mM咪唑，pH＝7.4)洗去杂蛋白，收集前几滴，编号为3；

(7)加入12mL Elute buffer缓冲液(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl,1M咪唑，pH＝7.4)洗脱目的蛋白，收集前几滴，编号为4；

(8)将编号为1到4的管中各加入50μL上样缓冲液煮沸10min；

(9)配置SDS-PAGE聚丙酰胺凝胶，将处理好的样品加入孔中(20μL/每孔)，电泳(浓缩胶电泳条件为直流电压为80伏特，分离胶电泳条件为直流电压为120伏特)，电泳完成后，取下凝胶用考马斯亮蓝染色过夜。然后脱色，确定得到纯化的目的蛋白。

结果显示经过层析柱纯化后的His-rMbovP732蛋白条带单一，分子量为45KDa(图3)。

实施例2：牛支原体His-rMbovP732蛋白反应原性验证

采用Western blot方法进行His-rMbovP732蛋白反应原性鉴定，主要步骤为：将纯化的重组蛋白His-rMbovP732进行SDS-PAGE电泳，将胶上蛋白转移到PVDF膜上，膜洗涤后，将膜放入用TBST稀释的5％脱脂奶中，室温封闭3h；充分洗涤后将PVDF膜放入100倍稀释的牛支原体HB0801攻毒阳性血清、牛支原体HB150免疫血清和阴性血清中(血清样本来源于临床动物试验)，4℃孵育过夜；充分洗涤后将PVDF膜放入5000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗牛IgG(购自Southern Biotech公司)中，室温1h；TBST洗涤三次后将混合好的ECL发光液(购自美国Thermo公司)均匀滴加在膜上，应用Kodak Image Station化学发光检测仪检测信号。结果显示：His-rMbovP732蛋白能与HB0801攻毒阳性血清发生反应，可检测到特异性反应条带，分子量约为45kDa(图4，泳道1)，同HB150免疫血清和阴性血清无反应条带，因此His-rMbovP732蛋白具有良好的反应原性。

实施例3：牛支原体His-rMbovP732蛋白在强弱菌株间差异表达的验证

3.1多克隆抗体制备

将制备的His-rMbovP732蛋白和完全弗氏佐剂(购自美国Sigma公司)按照1:1的比例混合，充分乳化，免疫3只六周龄Balb/c雌性小鼠制备多抗血清(实验动物使用许可证号为SYXK(鄂)2015-0084；实验动物伦理道德批准编号为HZAUMO-2018-026)。免疫程序：免疫前小鼠尾尖采血，收集的血清即为阴性血清。初次免疫时，His-rMbovP732蛋白免疫量为100μg/只，和完全弗氏佐剂以体积比为1:1混合，充分乳化后，采用颈背部皮下多点注射。初次免疫2周后，用不完全弗氏佐剂乳化等剂量的蛋白进行第二次免疫。两周后按照第二次免疫同样的方法进行第三次免疫，免疫后尾尖采血，分离血清备用。一周后，尾尖采血，分离血清，用间接ELISA方法测定其效价。以His-rMbovP732蛋白(100ng/孔)作为抗原包被酶标板于4℃过夜，经PBST洗涤后加入5％脱脂乳，然后在37℃封闭1h，PBST洗涤后将待检小鼠血清和阴性血清分别加2μL于198μL PBS中，混合均匀后加入酶标板中，倍比稀释15个孔，同时设置空白对照(PBS)，置于37℃，反应1h；PBST洗涤后加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗(购自Southern Biotech公司)(1：5000，V/V)37℃孵育45min。经PBST洗涤后加入TMB底物显色，经测定三只小鼠血清抗体效价均达到10⁶以上。

3.2Western blot验证His-rMbovP732蛋白在强弱菌株间差异表达

将牛支原体HB0801株和牛支原体HB150株37℃培养48h后收集菌液，l2000rpm/min离心15min后用PBS洗涤菌体3次，重悬菌体后超声破碎细胞进行SDS-PAGE电泳，将胶转移到PVDF膜上，膜洗涤后，将膜放入用TBST稀释的5％脱脂奶中，室温封闭3h；充分洗涤后将PVDF膜放入100倍稀释的His-rMbovP732蛋白多抗血清中，4℃孵育过夜；充分洗涤后将PVDF膜放入5000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG中，室温1h；TBST洗涤三次后将混合好的ECL发光液均匀滴加在膜上，应用Kodak Image Station化学发光检测仪检测信号。结果显示：牛支原体HB0801株全菌蛋白能与His-rMbovP732蛋白多抗血清发生反应，可检测到特异性反应条带，分子量约为45kDa(图5，泳道1)，同时，牛支原体HB150株全菌蛋白不能与His-rMbovP732蛋白多抗血清发生反应，未检测到信号(图5，泳道2)，表明His-rMbovP732多抗血清可以特异性检测出MbovP732蛋白，进而可以区分牛支原体野毒株与HB150疫苗株。

实施例4：间接ELISA方法比较牛支原体His-rMbovP732蛋白和His-rMbovP730蛋白

选取13份牛支原体野毒自然感染血清(来源于临床试验的牛支原体疑似感染牛)、13份人工HB150疫苗免疫血清(来源于临床动物试验)和5份牛支原体阴性血清(来源于临床免疫实验的空白组)作为比较实验的血清样本，按照间接ELISA方法用His-rMbovP732和His-rMbovP730蛋白进行检测。主要步骤为：以His-rMbovP732和His-rMbovP730蛋白分别作为抗原(100ng/孔)包被酶标板于4℃过夜，经PBST洗涤后加入5％脱脂奶(200μL/孔)，然后在37℃封闭1h，PBST洗涤后加入血清样本37℃孵育1h，血清样本稀释比例为体积比1:100。PBST洗涤后加入辣根过氧化物酶标记羊抗牛二抗(1：5000，V/V)37℃孵育45min。经PBST洗涤后加入TMB底物显色，测定OD630nm值，然后将所得的数据使用Graphpad prism6.0软件中的t-test程序进行比较分析。结果显示：His-rMbovP732作为包被抗原检测的野毒感染血清组与弱毒疫苗免疫血清组结果有极其显著统计学差异，野毒感染血清组与阴性血清组结果有显著统计学差异(图6)；His-rMbovP730作为包被抗原检测的野毒感染血清组与弱毒疫苗免疫血清组结果以及野毒感染血清组与阴性血清组有统计学差异(图7)。说明His-rMbovP732蛋白区分牛支原体野毒感染与弱毒疫苗免疫血清的能力优于His-rMbovP730蛋白，更适合作为牛支原体鉴别诊断的靶抗原。

实施例5：His-rMbovP732蛋白在鉴别诊断牛支原体野毒感染与疫苗免疫中的应用

2.1以牛支原体His-rMbovP732重组蛋白为抗原，通过间接ELISA方法诊断牛支原体野毒感染与疫苗免疫

ELISA方法的具体操作程序：

(1)抗原包被：用包被液(Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，加ddH₂O至1000ml)稀释浓缩后His-rMbovP732蛋白，按每孔50ng的比例加入稀释His-rMbovP732蛋白后的包被液100μL孔加入96孔酶标板，4℃包被过夜。弃去包被液，每孔加300μL PBST(PBS：NaCl 8.0g，KCl0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，NaH₂PO₄ 0.2g，加ddH₂O至1000ml。PBST：加入0.05％比例的Tween-20到PBS中)洗涤3次，每次2分钟。

(2)封闭：每孔加入200μL 5％脱脂奶(5g脱脂奶加PBST至100ml)，置于37℃温箱中封闭1h，甩干封闭液，加入300μL PBST洗3次，每次2分钟。

(3)加样：用PBST按1:100(V/V)比例稀释待检血清和对照血清，每孔加100μL稀释后的样本，37℃孵育1h。甩干孔中溶液，加入300μL PBST洗3次，每次2分钟。

(4)加酶标二抗：用PBST按(500μL Tween-20加入1000ml PBS)按V/V 1:5000的比例稀释羊抗牛酶标二抗，每孔加入100μL稀释后的二抗，置于37℃温箱培养30分钟。甩干孔中溶液，加入300μL PBST洗5次，每次2分钟。

(5)加底物显色：每孔加入TMB底物(购自美国Seracare公司)100μL，避光显色10min，每孔加50μL 2M硫酸终止反应，用酶标仪在450nm波长下测定OD₄₅₀值。使用在线工具(http://epitools.ausvet.com.au/content.php？page＝ROC_curves)软件确定阈值(图8)。

2.2基于His-rMbovP732蛋白抗原的间接ELISA与商品化ELISA试剂盒的比较

选取330份临床血清和50份人工HB150疫苗免疫血清作为比较实验的血清样本(临床血清采集自湖北、江西、内蒙古等不同地区的牛场；HB150疫苗免疫血清采集自临床动物试验)。商品化试剂盒包括哈尔滨兽医研究所牛支原体抗体检测试剂盒和加拿大Biovte牛支原体抗体检测试剂盒。具体步骤如下：

His-rMbovP732蛋白的包被、检测方法及条件按2.1中所述进行，商品化试剂盒的操作按照试剂盒的说明书进行。检测结果见表1、2，用本发明的His-rMbovP732蛋白作为抗原能够区分商品化试剂盒不能区分的牛支原体野毒感染与弱毒疫苗HB150免疫动物且同国外商品化试剂盒符合率较高。

表1：商品化牛支原体抗体ELISA试剂盒同His-rMbovP732间接ELISA检测比较

表2：商品化牛支原体抗体ELISA试剂盒同His-rMbovP732间接ELISA检测比较

2.3牛支原体MbovP732蛋白血清动力学试验

(1)动物血清样本收集：采集临床动物试验免疫组使用牛支原体弱毒疫苗HB150免疫后7、14、21、28、35d后的血清以及疫苗免疫35d后再用牛支原体HB0801野毒株攻毒后的7、14、21、28、35d后的血清样本，和对照组使用人工感染牛支原体HB0801野毒后7、14、21、28、35d血清样本

(2)His-rMbovP732蛋白的包被、检测方法及条件按2.1中所述进行，进口商品化试剂盒的操作按照试剂盒的说明书进行对所有血清样本进行检测(1705、1713、1720、1716及1721为免疫组牛的编号；1847、1855及1850为对照组牛的编号)。免疫组检测结果显示，试验牛免疫HB150弱毒疫苗后，加拿大试剂盒检测抗体水平一直在升高(图9)；His-rMbovP732-iELISA检测的值维持在较低的水平，近乎为0的直线(图10)，表明在HB150免疫后35d内动物体内没有产生针对MbovP732蛋白的特异性抗体。对照组检测结果显示加拿大试剂盒检测在攻毒后14d后血清由阴性转为阳性(图11)，His-rMbovP732-iELISA检测在攻毒后21d后抗体全部转为阳性(图12)。说明His-rMbovP732-iELISA方法可以检测牛支原体野毒株感染后21天的免疫反应，并且可以鉴别出加拿大试剂盒不能鉴别的免疫HB150疫苗后发生野毒感染的动物，可以区分野毒株感染与疫苗株接种产生的免疫反应。

名词术语说明：

牛支原体MbovP732重组蛋白：以His-rMbovP732表示；

牛支原体MbovP732蛋白基因：以Mbov_0732表示；

牛支原体本地分离株、牛支原体野毒株、野毒株：以牛支原体HB0801或M.bovisHB0801表示；

牛支原体弱毒疫苗株：以牛支原体HB150或M.bovis HB150表示。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种牛支原体假想蛋白MbovP732及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 329

<212> RNA

<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)

<400> 1

<210> 2

<211> 990

<212> DNA

<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)

<400> 2

atgaacaacg acgaagaaga aaaaaaactg aaagaaaaac aggaacagga tagcgttctg 60

cagaaagttc tggatacctg gaataaagat tttaaagatg atatttggga aaaatggagc 120

tataaagata tttttgaaaa actgaaaagc aaaattccga ataataatct gaaactggtt 180

agcgatcaga atacccgtcc gaccccgggt agcgaaaatc cgccgtttgt tattaaactg 240

aatgatagca gcaataaaca ggttctgccg tttggtatgg tttggccgat tagcagcaaa 300

accgaatata gcggtaatga agcaattacc attggttatg ataatgaagg taaaattgaa 360

aaatttcgta gcagcaccaa taaagttccg gaacatctgc cgaaatttat tagcagcctg 420

agcgaagcat ttgaaaatag cacccagaaa accattgaaa atctggataa atgggatacc 480

agcaatatta ataattttga aggtgttttt aaagatgcaa gcaattttaa tcatgatatt 540

agcggttgga ataccgatag cgcagaaacc atgcaggaaa tgtttaccgg tgcaacccat 600

tttaatcaga atattagcaa ttggaatacc agcaatgtta ccgatatgac cagcatgttt 660

tggggtgcaa ccaattttaa tcaggatctg aatagctgga atgttgaaaa agttaccagc 720

atgcagaata tgtttagcga aaccaaaaaa tttaatagcg atctggataa atggcagccg 780

aaaagcatta aaagcgtttt tggtatgttt gcaaatagca tgtttaataa aagcctgaaa 840

agctgggaaa gccatctgcc gaataaaatt ctgaatgcac aggattttaa tcgtaatgca 900

attctgaatg aagataatct gccggttcag attaccaaaa gcattaaaca ttttgaagat 960

ctgaaaaaag caggtaataa tcagaaataa 990

Claims (7)

1.一种牛支原体假想蛋白MbovP732，具有如序列表SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述牛支原体假想蛋白MbovP732的基因，具有如序列表SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

3.含有权利要求1所述牛支原体假想蛋白MbovP732的重组菌。

4.如权利要求3所述的重组菌，为大肠杆菌pET-30a-Mbov_0732(Escherichia colipET-30a-Mbov_0732)，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019375。

5.抗权利要求1所述牛支原体假想蛋白MbovP732的多克隆抗体。

6.权利要求1所述牛支原体假想蛋白MbovP732以及权利要求5所述多克隆抗体在制备牛支原体诊断试剂盒中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述牛支原体诊断试剂盒是鉴别牛支原体野毒株感染与疫苗株免疫的酶联免疫试剂盒。