CN107793473A - 一种副鸡禽杆菌的抗原蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种副鸡禽杆菌的抗原蛋白及其应用，所述抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。还提供了一种用于检测副鸡禽杆菌抗体的试剂盒。该试剂盒可用于检测或辅助检测副鸡禽杆菌A型菌、B型菌和C型菌体的外膜蛋白诱导的抗体。通过检测结果判断鸡的免疫状态，以便于养鸡业者采取相应的措施。所述试剂盒中含有阴性对照血清、阳性对照血清，保证检测结果准确、可靠。本发明还提供了一种副鸡禽杆菌的疫苗制剂，用于接种鸡，可有效保护鸡抵御A型、B型、C型副鸡禽杆菌的感染。

Description

一种副鸡禽杆菌的抗原蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种副鸡禽杆菌的抗原蛋白及其应用。

背景技术

副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum，Apg)是细小的革兰氏阴性菌，细菌长约1-3μm，宽0.4-0.8μm，无鞭毛，不形成芽孢，毒力菌株往往有荚膜。副鸡禽杆菌培养条件较为苛刻，需要在培养基中加入NAD，但在南非发现NAD非依赖性分离株，说明NAD不是必需的营养成分。该菌兼性厌氧，在固体培养基上培养时，需厌氧环境或3％-10％的CO₂。

副鸡禽杆菌是鸡传染性鼻炎(infectious coryza，IC)的致病菌，引起鸡的一种呼吸道传染病。引起鸡打喷嚏、流出稀薄水样鼻涕，鼻液逐渐粘稠并带有难闻的臭味，干燥后在鼻孔周围凝固成黄色结痂，影响呼吸，之后出现眼结膜和面部肿胀，甚至上下眼皮粘合在一起，消瘦，下痢，使产蛋鸡产蛋量下降，其经济损失较大。

Page等人通过血凝抑制(HI)方法将Apg分类为A、B和C型三种型，并且发现三种血清型之间没有交叉保护。1987年冯文达首先在北京分离得到A型副鸡禽杆菌，林毅在一个发病鸡场分离得到C型副鸡禽杆菌。之后国内陆续有B型副鸡禽杆菌的报道。并且发现A型和C型副鸡禽杆菌均为致病菌株，但同型的不同菌株之间存在差异，而B型副鸡禽杆菌的部分分离菌株也有很强的致病性。

疫苗免疫是预防和控制鸡传染性鼻炎发生的最有效的途径，而免疫后抗体水平的高低反映实际的疫苗免疫效果，直接关系到免疫鸡群对副鸡禽杆菌的抵抗力。关于鸡传染性鼻炎疾病的预防，以往广泛使用的是将Apg的菌体用福尔马林或硫柳汞等灭活方法得到的疫苗，但是这种方法也有一定的缺陷，在给与这些疫苗时，存在趴窝等一过性强烈的毒副作用。养殖户强烈期望能够开发一种安全性高的疫苗。在这种情况下，人们希望开发毒性成分较少的亚单位疫苗。

感染了Apg的鸡发病急、病程短，发病后不能快速诱导产生抗体。鸡传染性鼻炎的血清学诊断意义不大。但对于全菌灭活疫苗免疫后的鸡，能够诱导产生针对Apg菌体红细胞凝集素(Hemagglutinin，以下称为“HA”)的抗体，因此，在实践中常用抗HA抗体的红细胞凝集抑制试验(以下也称为“HI试验”)评价疫苗免疫效果。HI试验涉及到新鲜鸡红细胞或戊二醛固定的鸡红细胞。该方法具有以下几个方面的不足之处：1.在评价Apg A型菌的疫苗效果时必须采用新鲜的鸡红细胞，因此需要常年饲养试验鸡，且确保供血用鸡健康；采血和血液处理等过程费时费力；2.鸡红细胞批次间差异影响试验结果，3.该方法最终依靠测定者主观判定抗体的效价，难以获得稳定的标准。

Sun等人报道了利用型特异性单克隆抗体的竞争ELISA，以此代替HI试验的血清学诊断法。竞争ELISA是将菌体超声破碎所得的破碎物作为抗原，使用与各血清型反应的单克隆抗体竞争性检测血清中的抗体的ELISA法。本方法灵敏度高，具有一次处理多个样本的优点。但是，采用该方法需要确保型特异性单克隆抗体、血清样本中的抗体都可以和同一个表位结合，由于菌体的变异而失去该表位时，则无法检测菌体感染或疫苗接种所产生的抗体，该方法易出现假阴性结果。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种副鸡禽杆菌的抗原蛋白，当用于疫苗抗原时，以该成分制备的亚单位疫苗免疫后的鸡，能够诱导产生针对性的抗体，有效提高了免疫鸡群对副鸡禽杆菌的抵抗力。

本发明的另一个目的在于提供一种副鸡禽杆菌抗体检测试剂盒。具体地说，提供可针对所有副鸡禽杆菌血清型菌株的抗体的进行检测的试剂盒，其利用制备的Apg的抗原蛋白即重组外膜蛋白，包被酶标板并建立的ELISA检测方法能够检出针对Apg的A型菌、B型菌和C型菌的鸡血清抗体。尤其能够用于检测所述重组抗原蛋白作为疫苗抗原免疫后所产生的抗体。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种副鸡禽杆菌的抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码如上所述抗原蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种用于检测副鸡禽杆菌抗体的试剂盒，其含有如上所述的抗原蛋白用于样品中副鸡禽杆菌抗体水平的测定。

如上所述的试剂盒，优选地，所述与样品中抗体检测的方法为ELISA法、蛋白质印迹法、胶体金免疫法或斑点杂交法等免疫学方法。

一种用于检测副鸡禽杆菌抗体的ELISA试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的抗原蛋白包被的ELISA板、样品稀释液、酶标记结合物、洗涤液和终止液。

如上所述的ELISA试剂盒，还包括阴性对照血清、阳性对照血清，所述阴性对照血清是健康鸡血清，所述阳性对照血清是用如上所述的抗原蛋白接种健康鸡所得血清。

如上所述的ELISA试剂盒，优选地，所述ELISA板的制备方法包括如下步骤：将所述抗原蛋白用碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，按100μL/孔加入至96孔包被板中，置于4℃过夜，洗涤液300μL/孔洗涤3次，每次3min，之后，加入5％脱脂乳的PBS溶液，37℃封闭1h，甩去封闭液，套袋真空干燥保存。

如上所述的ELISA试剂盒，优选地，所述样品稀释液为含有1％的脱脂乳的PBS溶液，所述酶标记结合物为辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡酶标抗体；所述洗涤液为含有0.05％Tween 20的PBS溶液，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。

一种副鸡禽杆菌的疫苗制剂，其含有如上所述的抗原蛋白和佐剂。

如上所述的疫苗制剂，优选地，所述抗原蛋白的终浓度为20μg/ml。

本发明的有益效果为：

本发明提供一种副鸡禽杆菌的抗原蛋白，及副鸡禽杆菌抗体的检测试剂盒。本发明使用的副鸡禽杆菌抗原蛋白是来自涵盖Apg A型菌、B型菌和C型菌抗原表位的重组抗原肽段，可以与相应菌株或外膜蛋白制备的疫苗所诱导的抗体发生特异性的结合。结果确认：本发明利用制备的副鸡禽杆菌抗原蛋白建立的免疫检测试剂盒及方法可以检出针对Apg的A型菌、B型菌以及C型菌的特异性抗体，也可以通过检测结果判断鸡的免疫状态，以便于养鸡业者采取相应的措施。

本发明使用纯化的蛋白作为抗原，与以往的菌体破碎物技术相比，可以使更高纯度的抗原固相化，提高了抗体检测的灵敏度。另外，通过本发明的检测试剂盒进行检测，不仅可以识别给予疫苗后的鸡血清，对抗体效价进行监测，也可以识别非免疫鸡感染Apg后血清中的抗体，有效避免假阴性。本发明采用一种抗原蛋白可实现对Apg的A型菌、B型菌以及C型菌三种血清型抗体的检测，能有效避免漏检，并且不必采用对应血清型的抗原，使检测成本大大降低。

本发明具体还提供了ELISA检测试剂盒，该试剂盒中还含有阴性对照血清、阳性对照血清，能有效验证所用试剂盒的有效性，保证检测结果准确、可靠。

本发明还提供了一种副鸡禽杆菌的疫苗及其制备方法，所述疫苗接种鸡，可有效保护鸡抵御A、B、C三种血清型副鸡禽杆菌的感染。

附图说明

图1为本发明构建的重组质粒诱导表达后超声裂解后的SDS-PAGE电泳图。

图2为P9重组蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例详细介绍本发明，应理解，本发明要求保护的范围不受所述具体实施方案的限制，本发明提供的具体实施例仅作为进一步说明本发明的例子，本领域技术人员参照本案说明书的描述对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换，这些无需创造性劳动的改进和替换也应落入本发明所附权利要求书的保护范围之内。

本发明实施例中采用的试剂、耗材及动物实验材料可采用如下：

pET30a质粒(Pharmacia公司产品，购自北京百灵克生物技术有限责任公司)；大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态购自北京天根生物技术有限公司。

本实施例中所用副鸡禽杆菌菌株为Hp8、221、0083、BJ、222、Modesto、668菌株，购自中国北京中国兽医药品监察所，属于商业菌株。

氯化钠、EDTA二钠盐、乙醇、甲醇、丽春红S、三氯乙酸(TCA)是中国国药集团公司产品。

Tris碱(Tris-HCL)、二硫苏糖醇(DTT)、甘油、十二烷基磺酸钠(SDS)、丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺(TEMED)，碳酸钠、乙酸钠购自上海生工生物工程技术有限公司。

甘氨酸、考马斯亮蓝R-250购自AMRESCO公司。

牛血清白蛋白(BSA)、胰酶、蛋白酶抑制剂(PMSF)、甲醛均为Sigma公司产品。

蛋白酶K(贮存液浓度为20mg/ml，使用液浓度为1mg/mI)购自上海华舜生物工程有限公司。

卡那霉素(kanamycin)、胎牛血清、诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)均为Invitrogen公司产品。

吸头与离心管是AxyGen公司产品。

Taq酶及10xTaq酶缓冲液、EcoRI、Xho I等核酸内切酶及相关缓冲液、T4连接酶及10x T4连接酶缓冲液、Rnase、DNA marker(DL-2000、DL-15000)均为宝生物(大连)有限公司产品。

柱式离心式DNA凝胶回收试剂盒、辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗鸡IgG购自Sigma公司。

底物液配制：底物液A：0.006％H₂O₂缓冲液；底物液B：取Na₂HPO₄.12H₂O 14.2g，柠檬酸10.5g，用双蒸水定容至500mL配成0.1磷酸盐柠檬酸缓冲液(pH5.0)，然后加上联苯二胺(TMB)。使用时将A液和B液等体积混合，混合后5分钟内使用，现配现用。

大肠杆菌培养基：LB液体培养液及固体培养基：每升含酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，用10mol/L NaOH调pH至7.5，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用。在每100毫升LB液体培养基中加入1.5g琼脂即为固体LB培养基，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用。

副鸡禽杆菌培养基TSB、TSA购自Sigma公司。

纯化副鸡禽杆菌抗原蛋白采用Sepharose 4B纯化柱(Amershan pharmacia公司产品)购自北京百灵克生物技术有限公司。

PBS缓冲液：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.24g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.628g，溶于800ml蒸馏水中，用盐酸调pH值为7.4，蒸馏水定容至1000ml，121℃高压灭菌20min，室温保存。

Western-blotting缓冲液：

电转缓冲液：39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris碱，0.037％SDS(电泳级)，20％甲醇。配制1000mL转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸，5.8g Tris碱，0.37g SDS，加200mL甲醇，加ddH₂O至总量为1000mL。

TBS(pH8.0)缓冲液：10mmol/L Tris.HCl，150mmol/L NaCl。

TBST缓冲液：在上述TBS中加入终浓度为0.05％Tween-20即可。

丽春红S(10×)贮存液：2g丽春红S，30g三氯乙酸，30g磺基水杨酸，加dd H₂O至100mL。

试验动物：6周龄SPF鸡，购自北京梅里亚维通SPF鸡实验动物中心。

本发明实施例中未特别说明的生物化学试剂，均为本领域常规试剂，可以商购获得，或通过本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。

实施例1副鸡禽杆菌的外膜蛋白抗原选择

对GenBank中副鸡禽杆菌的抗原编码基因进行筛选，使用抗原表位预测软件geneious预测外膜蛋白的抗原表位，分析外膜蛋白的二级结构、亲疏水性、抗原性等信息等进行抗原表位预测。最后选定GenBank No.KJ867497副鸡禽杆菌的外膜蛋白作为目标抗原，并综合软件分析，根据蛋白序列抗原性，考虑蛋白表达、纯化的难易性，避开信号肽区域，从中选取合适抗原表位序列或抗原表位集中区域；根据预测结果和积累的实验经验对选取的抗原表位序列进行多次优化，截取部分抗原表位区域，使所得的抗原蛋白免疫原性强且适合进行蛋白表达和动物免疫的序列分析，并经过大量实验验证，最终从GenBankNo.KJ867497的长度为22038个氨基酸序列中获得本发明的抗原蛋白，命名为P9，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，再通过对密码子的优化、试验验证最后确定编码此氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2副鸡禽杆菌重组抗原蛋白P9的原核表达

1.序列的合成

抗原蛋白P9的基因编码序列如实施例1中所述，具体序列如SEQ ID NO.2所示，可由华大科技(北京)有限公司进行全基因合成。

按照各自的碱基序列分别设计上、下游引物，并在上、下游引物中分别引入EcoRI和XhoI酶切位点，可委托华大科技(北京)有限公司进行引物合成，引物序列如Seq ID No.3～4所示。

2.重组表达质粒的构建

2.1抗原蛋白P9编码基因的PCR扩增

以步骤1得到的合成产物为模板，利用合成的引物进行PCR，

PCR反应体系：

PCR各个成分的用量：(其中引物浓度为1OD溶于400μl ddH₂O)

PCR反应程序：在98℃反应1分钟后，进行30个循环的“变性(95℃，10秒)、退火(56℃，15秒)和延伸反应(72℃，120秒)”，然后修复延伸反应(72℃，7分钟)。

2.2PCR产物的酶切及回收

将上述PCR产物进行EcoRI和XhoI酶切，

酶切体系：

以上体系放入37℃恒温水浴锅中反应2h。

将全部的酶切产物通过0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离之后，采用北京天根生化技术有限公司的普通DNA胶回收试剂盒，按照试剂盒说明书的步骤进行DNA片段回收。回收的目的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。

2.3表达载体的酶切及回收

对表达载体pET30a进行EcoRI和XhoI酶切和酶切产物的回收，方法及步骤同3.2PCR产物的酶切及回收。

2.4目的片段与载体连接

将步骤2.2回收纯化的目的DNA片段和2.3回收纯化的表达载体pET30a进行连接，得到重组质粒，命名为pET30a-P9。

连接体系为：目的DNA片段，8μl；表达载体pET30a，4μl；10×T4 DNA连接酶缓冲液，2μl；T4 DNA连接酶，1μl(5μ/μl)；ddH₂O补充至20μl。

连接条件：上述连接体系的混合液放在22℃PCR仪1h即可。

2.5转化并筛选克隆

取大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞100μl加入到1.5ml EP管中，将步骤2.4获得的重组质粒pET30a-P9 5-10μl加入各自的EP管中并混匀。置冰上30min后，42℃热激90秒，冰浴3-5分钟。加入400μl LB，于37℃，200rpm振荡培养45min使其复苏。复苏后的重组大肠杆菌悬液于4℃，25000rpm离心10min，弃去400μl上清，用剩余的100μl重悬沉淀并涂布于含有25μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上。37℃增殖1h，再将平板翻过来，37℃倒置培养14h-16h至菌落出现。

2.6重组质粒的酶切鉴定

挑取步骤2.5中平板上长出的单菌落，分别接种于含25μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀达到0.6～1。

收集菌体，使用普通质粒提取试剂盒(天根生化技术有限公司)提取重组质粒，具体操作步骤依照试剂盒说明书进行。利用EcoRI+XhoI酶切鉴定重组质粒，酶切后出现预期大小的外源片段和载体片断的，即为正确的重组质粒pET30a-P9。

3.重组表达菌株的构建

取感受态细胞BL21(DE₃)100μl加入到1.5ml EP管中，将鉴定正确的重组质粒pET30a-P9 0.5μl加入各自的EP管中并混匀。置冰上30min后，42℃热激90秒，冰浴3-5分钟。将其涂布于含有25μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上。37℃置1h，再将平板翻过来，37℃倒置培养14h-16h至菌落出现。挑取单菌落，按照步骤2.1中的反应体系和反应程序进行菌落PCR并测序比对，鉴定阳性克隆。

4.目的基因在大肠杆菌中的表达及纯化

4.1目的基因的诱导表达：将含重组质粒pET30a-P9的阳性克隆分别接种于含有25μg/ml卡那霉素的3mL LB液体培养基，于37℃振荡培养。从培养好的菌液中取100μl接种于10mL含有25μg/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，于37℃振荡培养约3h，至OD₆₀₀达到0.6-1.0时，加IPTG至终浓度为1mmol/L，继续培养3h后收集菌体。分别于诱导前和诱导后的取出重组菌1mL，5,000r/min离心10min收集菌体，弃上清后加入2×SDS上样缓冲液，煮沸10min，用12％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检查。

4.2表达产物的SDS-PAGE电泳分析

(1)制胶：SDS-PAGE凝胶配制方法如表1所示：

表1 SDS-PAGE凝胶配制方法

12％的分离胶配制：将各成分加入后迅速混合，加入制胶板中，上面加纯化水。然后，再配制5％浓缩胶：将表中相关各成分加入后迅速混合，加入制胶板的分离胶的上面(先将分离胶上面的纯化水倒干净)，灌满后插入加样梳。待浓缩胶凝固后，取下梳子。

(2)PAGE：将凝胶固定于电泳装置上，加入足够量的Tris-甘氨酸电泳缓冲液，在加样孔中分别加入各样品：电泳电压200V，电流在20mA-40mA范围内，电泳1h，至溴酚蓝泳出胶底面，终止电泳。

(3)聚丙烯酰胺凝胶染色与脱色：卸下凝胶，用考马斯亮蓝R250染色液染色30min，再用脱色液进行脱色1min，观察结果。

将含有阳性重组质粒的大肠埃希菌以1mM IPTG诱导37℃诱导表达后，经SDS-PAGE检测，在预期位置出现蛋白目标条带，预期蛋白大小相一致，为68KD，未诱导菌没有此蛋白。

4.3重组蛋白的制备及纯化

1)挑取步骤3鉴定正确的阳性克隆，接种于3mL含25μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃活化过夜后，1:100稀释到含25μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃、230r/min振摇培养至对数生长期(OD₆₀₀ 0.6～1)，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，于37℃、230r/min振摇诱导培养6-8h。2)收集500mL经诱导表达6h后的菌液，8000r/min离心10min，沉淀用5mL的10mmol/LPBS溶解，超声波破碎后，12,000r/min离心10min后，保留上清。包涵体沉淀用8mol/L的尿素溶液溶解，8M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右，1mMEDTA，10％Triton X-100，二硫键还原剂中洗涤。洗涤4～8h，使包涵体变性可溶。包涵体溶解后的上清液，用镍亲和层析柱纯化。操作过程参照Amersham Pharmacia Biotech公司提供的操作指南进行。具体过程如下：转移树脂到柱子，待完全沉淀后，用三蒸水洗涤镍亲和层析柱，以除尽基质中的乙醇和空气，并防止下一步Ni²⁺沉淀；5×柱体积的Charge Buffer(50mM NiSO₄)充电；20×柱体积的三蒸水洗涤，去尽游离的Ni²⁺；10×柱体积的Binding Buffer平衡柱子；手工上样，根据蛋白的浓度来确定上样体积；20×柱体积的Binding Buffer洗涤；6×柱体积的Wash Buffer洗涤，至检出无蛋白；Elution Buffer洗脱，每次1ml，收集洗脱流出液，洗脱至检出无蛋白；然后进行SDS-PAGE电泳检测。并使用BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白的浓度。

本发明构建的重组质粒诱导表达后超声裂解后的SDS-PAGE，如图1所示，其中图中M为蛋白分子量，1为诱导后裂解沉淀、2为诱导后裂解上清液、3为诱导前重组菌即未诱导菌。可知P9蛋白大部分存在于裂解后的上清中。

诱导后裂解上清中的蛋白含量高于沉淀，纯化时可以直接使用裂解上清，省去包涵体变性复性的步骤，利用镍琼脂糖亲和层析原理处理经超声波裂解后的菌体上清液，具体操作如下：

①取5mLNi-IDA，用10倍柱床体积的Binding buffer清洗平衡柱子，流速5ml/min。

②样品(裂解液上清)上柱，流速为2ml/min，收集穿透液。

③10倍柱床体积的Binding buffer清洗柱子，流速10mL/min。

④Wash Buffer洗杂，流速5ml/min，收集洗脱液。

⑤Elution Buffer洗脱,，流速2ml/min，收集洗脱液。

⑥将纯化后的蛋白置于透析袋中，在PBS，缓冲液(pH＝7.4)中缓慢透析，收集透析后的样品进行SDS-PAGE分析。

注：Binding Buffer(PBS，0.5％Triton X-100，pH＝7.4)

Wash buffer-10(PBS，10mM咪唑，pH＝7.4)

Elution Buffer-500(PBS，500mM咪唑，pH＝7.4)

结果如图2所示，其中图中M为蛋白分子量，1为经纯化的目的蛋白P9，说明经过纯化，获得了较纯的目的蛋白P9。

实施例3副鸡禽杆菌疫苗制剂的制备

1、疫苗的制备及重组蛋白抗血清的制备

将实施例2中纯化后的重组抗原蛋白P9与MONTANIDE^TMISA 71VG佐剂(SEPPIC公司产品)按3:7重量比(30％重量的抗原,70％重量的佐剂)混合乳化(操作方法见SEPPIC公司产品使用方法介绍)，使疫苗中抗原蛋白终浓度为20μg/ml。所制备的疫苗命名为vP9。

免疫方法：取42日龄SPF鸡，分为5组，10只/组。其中3组为疫苗免疫组，分别胸部注射所述vP9疫苗0.5mL/只、0.2mL/只、0.1mL/只；一组为无抗原佐剂对照；另一组为非免疫对照组。第一次免疫后间隔4周，对所有免疫组的鸡进行二次免疫，剂量及免疫途径与首次免疫相同。之后，所有的鸡每周于翅静脉采血一次，分离血清，-20℃保存，留待检测ELISA抗体水平。

实施例4ELISA方法的建立

1、重组抗原蛋白最适包被浓度和阴阳性血清的最佳稀释度的确定

用包被液把实施例2纯化脱盐后的重组P9蛋白(1mg/ml)依次做50、100、500、1000、2000、4000、8000、16000倍稀释，包被反应板100μl/孔，4℃过夜。将包被好的酶标板倒去孔内液体，用PBST 300μL/孔洗涤三次后，每次3min，用5％的脱脂乳封闭液37℃封闭2小时，甩去封闭液。取上述免疫剂量为0.5mL/只，二次免疫后2周所采的免疫血清作为阳性血清，用未免疫的SPF鸡血清作为阴性血清，分别用封闭液稀释10、50、100、200、400倍与重组蛋白不同稀释度组成方阵100μl/孔，相同的浓度设一个重复。37℃孵育1小时，PBST洗涤三次后加入稀释好的酶标抗体HRP-兔抗鸡IgG 100μl/孔，37℃孵育1小时，洗涤后加入新配的底物100μl/孔，显色15分钟。在酶联仪上读出OD₄₅₀，比较阴阳性血清的OD值，选择阳性OD₄₅₀值为1左右和阴性OD₄₅₀值较低的抗原包被浓度和阴阳性血清的稀释度。从而确定了抗原的最适包被浓度和血清的最适稀释倍数，结果如表1：

表1最适抗原包被浓度和阴阳性血清最佳稀释度的确定

从表1得出，抗原最佳包被浓度可以定为1μg/ml，每孔包被液量100μl，样品血清最佳稀释度为1:100。

计算其OD₄₅₀的平均值及标准方差。阴阳性临界值＝阴性样本OD₄₅₀平均值+3×标准方差，阴阳性临界值＝0.097+3×0.066＝0.295。为便于判断，设定OD450＝0.3为本方法的阴阳性临界值。

2、P9与不同血清型副鸡禽杆菌单因子阳性血清的反应性

采用三种血清型副鸡禽杆菌多个菌株的单因子感染的鸡血清作为待测血清，如采用标记为Hp8、0221、0083、0222、BJ、668、Modesto分别为副鸡禽杆菌A型、A型、A型、B型、B型、C型和C型。用重组P9蛋白做包被抗原，1μg/ml，100μl/孔包被过夜。5％脱脂乳37℃1小时封闭，待测血清都用封闭液做了100倍稀释，每株血清都做4个重复，100μl/孔，37℃作用0.5小时，洗涤后加入酶标二抗100μl/孔，37℃作用0.5小时，洗涤后加底物100μl/孔显色。室温10分钟后测其OD₄₅₀。检测结果见表2，其中A、B、C、D表示为4个平行重复测试。

表2重组P9蛋白的群特异性

从上述数据表中得出该方法可以检出三个血清型不同菌株的副鸡禽杆菌阳性鸡血清。

3、P9蛋白与其他禽病病原体抗血清的交叉反应性

选用大肠杆菌O₁、O₂、O₇₈株单因子鸡血清；禽流感(AI)H9亚型、新城疫(ND)lasota株(NDla)和F48株(NDf48)、鸡传染性法氏囊病(IBD)、减蛋综合征(EDS’76)等禽病病原单因子的阳性鸡血清，以及SPF鸡血清进行交叉反应，上述血清均购自中国兽药监察所。根据上述已经建立的ELISA方法，各个血清样本做A、B、C、D4个平行重复测试，经本试剂盒检测后OD值及OD平均值如表3。

表3重组P9蛋白的交叉实验

结果表明，大肠杆菌O₁、O₂、O₇₈；AI、NDf48、NDla、EDS’76、IBD等病原体单特异性阳性血清的OD450值均小于0.1，为阴性。纯化的重组P9抗原蛋白与大肠杆菌O1、O2、O78株单因子、禽流感(AI)H9亚型、新城疫(ND)lasota株和F48株、鸡传染性法氏囊病(IBD)、减蛋综合征(EDS’76)等禽病病原单因子感染后获得的鸡血清没有交叉反应，能够特异性检测副鸡禽杆菌三种血清型病原菌感染的鸡血清。

实施例5通过ELISA确认与免疫剂量与抗体水平的关系

取6周龄SPF实验鸡，分为5组，10只/组。P9蛋白制作的油佐剂疫苗抗原含量为20μg/ml。采取胸部肌肉注射的方法，对实验鸡进行分组免疫。免疫剂量依次为0.5ml/只、0.2ml/只、0.1ml/只，并设无抗原佐剂对照和非免疫对照组，无抗原佐剂对照组只用等量的MONTANIDE^TMISA 71VG佐剂接种，不含P9抗原蛋白；非免疫对照组不做任何处理。72日龄时，对所有疫苗免疫组采用相同剂量和途径进行二次免疫，之后于28天翅静脉采血一次，分离血清，用实施例4中建立的ELISA方法进行抗体检测，检测结果见表4。

表4抗原与血清的反应性

通过将不同剂量的P9蛋白免疫鸡，在二免后28d采集鸡血得到血清，通过ELISA测定血清抗体效价以及攻毒保护率。测得给鸡注射0.5mL剂量时最适宜。通过结果也反应出P9蛋白作为抗原可以与所得的血清发生特异性反应，并与反应的剂量有关，蛋白免疫的剂量越小，反应性越低。

实施例6ELISA方法检测抗体免疫持续期

用P9蛋白制作的油佐剂疫苗免疫42日龄的SPF实验鸡，采取胸部肌肉注射的方法，0.5ml/只，P9抗原含量为20μg/ml。72日龄进行二次免疫，之后每隔一周翅静脉采血一次，分离血清留待抗体检测使用。用P9蛋白包被4℃过夜，5％脱脂乳37℃封闭1h，一抗为所得血清，1:100稀释，二抗为HRP标记的抗鸡抗体，TMB底物显色15min，之后2M的硫酸终止反应，仪器检测OD450nm读取数值，见表5。

表5抗体免疫持续期检测

	二免后时间	血清效价	二免后时间	血清效价
					A	5周	1.396±0.098	22周	1.316±0.113
B	7周	1.484±0.049	24周	1.380±0.077
					C	9周	1.400±0.026	26周	1.310±0.072
D	11周	1.504±0.096	28周	1.270±0.073
					E	13周	1.454±0.026	30周	1.265±0.056
F	15周	1.443±0.064	32周	1.334±0.150
					G	17周	1.318±0.196	34周	1.290±0.081
H	20周	1.390±0.150	36周	1.164±0.136

根据表5：用P9蛋白作为抗原进行包板检测的结果，P9蛋白与免疫P9蛋白产生的血清抗体可以发生特异性反应。二免后免疫P9蛋白产生的血清抗体效价值在1左右，抗体效价维持时间较长，到二免后36周血清效价在1.0以上，说明在免疫P9蛋白之后血清抗体效价可以维持36周以上的时间。

实施例7ELISA方法确认抗体水平与免疫保护率的相关性

将重组抗原蛋白P9与MONTANIDE^TMISA 71VG佐剂(SEPPIC公司产品)按3:7重量比(30％重量的抗原，70％重量的佐剂)混合乳化(操作方法见SEPPIC公司产品使用方法介绍)，使疫苗中抗原蛋白终浓度为20μg/ml。所制备的疫苗命名为vP9，在42日龄SPF鸡颈背部皮下注射一次，间隔4周进行第二次免疫。二免后4周，通过眶下窦注射的方法分别进行强毒攻击。强毒攻击前翅静脉采血，分离血清，检测ELISA抗体。分别用副鸡禽杆菌三个血清型的代表性菌株进行攻毒，攻毒剂量分别是A型Hp8株5×10⁵CFU，B型BJ株2×10⁵CFU，C型668株5×10⁵CFU，一周内观察颜面肿胀、鼻液流出、流泪等鸡鼻炎临床症状，出现上述症状的判为发病，否则判为保护。见表6，其中，不同剂量表示接种vP9疫苗的量不同，对照组为未接种vP9疫苗，“抗体水平”是指攻毒前所采血清经本ELISA检测后所得吸光度OD450数值，“保护率”为各组经相应强毒菌株攻击后，未发病鸡数/试验鸡数的比值。

表6抗体水平与免疫保护率相关性

结果表明，在受A型菌、B型菌以及C型菌攻击的任一组鸡中，根据免疫剂量的增加，攻毒保护率也随之提高，当免疫剂量为0.5mL时，保护率达90％以上。当ELISA值在0.1以下时，50％以上的鸡不能有效抵御副鸡禽杆菌的攻击。由此可以得出结论，本发明制备的外膜蛋白是副鸡禽杆菌重要的保护性抗原成分，以该成分制备的亚单位疫苗免疫后的鸡，能够诱导产生针对性的抗体，再通过使用本发明的ELISA系统，可以评价免疫抗体及鸡只防御Apg感染的水平。

作为与新型亚单位疫苗相适应的检测方法，本发明提供的副鸡禽杆菌外膜蛋白作为抗原成分的疫苗免疫鸡后，血清中的抗体可通过上述ELISA方法进行检测，有利于监测大规模群体的免疫状况。

田间实用性

上述实施例说明本申请发明的检测方法可以用于鸡的免疫状态的检测，尤其是外膜蛋白作为抗原主要成分的疫苗免疫后的抗体水平检测。本申请发明的检测方法还可以测定Apg感染的鸡的血清，用来进行发病机理或流行病学的研究。

[0001] 序列表

[0002] <110>北京市农林科学院

[0003] <120>一种副鸡禽杆菌的抗原蛋白及其应用

[0004] <160>4

[0005] <170>SIPOSequenceListing 1.0

[0006] <210>1

[0007] <211>558

[0008] <212>PRT

[0009] <213>P9蛋白的氨基酸(P9)

[0010] <400>1

[0011] Leu Ala Gln Ser Val Lys Thr Asn Phe Gly Gly Asn Ala Asn Leu Ala

[0012] 1 5 10 15

[0013] Thr Asp Gly Thr Ile Thr Phe Thr Asn Ile Gly Gly Thr Gly Gln Asp

[0014] 20 25 30

[0015] Thr Ile His Asp Ala Ile Asn Asn Val Leu Thr Lys Leu Ile Ser Leu

[0016] 35 40 45

[0017] Ser Ala Thr Glu Glu Glu Val Val Ser Gly Glu Ala Val Tyr Asp Ala

[0018] 50 55 60

[0019] Leu Lys Gly Ala Lys Pro Thr Val Ser Ala Glu Ala Asn Lys Gly Ile

[0020] 65 70 75 80

[0021] Thr Gly Leu Val Asp Val Val Lys Lys Ala Asn Ser Pro Ile Thr Val

[0022] 85 90 95

[0023] Glu Pro Ser Thr Asp Asn Asn Lys Lys Lys Thr Phe Thr Val Gly Leu

[0024] 100 105 110

[0025] Met Lys Asp Ile Glu Gly Val Asn Ser Ile Thr Phe Asp Lys Ser Gly

[0026] 115 120 125

[0027] Gln Asp Leu Asn Gln Val Thr Gly Arg Met Ser Ser Ala Gly Leu Thr

[0028] 130 135 140

[0029] Phe Lys Lys Gly Asp Thr Thr Asn Gly Ser Thr Thr Thr Phe Ala Glu

[0030] 145 150 155 160

[0031] Asp Gly Leu Thr Ile Asp Ser Thr Thr Asn Ser Ala Gln Thr Asn Leu

[0032] 165 170 175

[0033] Val Lys Val Ser Arg Asp Gly Phe Ser Val Lys Asn Gly Ser Asp Glu

[0034] 180 185 190

[0035] Ser Lys Leu Ala Ser Thr Lys Leu Ser Ile Gly Ala Glu Asn Ala Glu

[0036] 195 200 205

[0037] His Val Glu Val Thr Lys Ser Gly Ile Ala Leu Lys Ala Asp Asn Thr

[0038] 210 215 220

[0039] Ser Asp Lys Ser Ser Ile Thr Leu Ala Gln Asp Ala Ile Thr Leu Ala

[0040] 225 230 235 240

[0041] Gly Asn Ala Thr Gly Thr Ala Ile Lys Leu Thr Gly Val Ala Asp Gly

[0042] 245 250 255

[0043] Asn Ile Thr Val Asn Ser Lys Asp Ala Val Asn Gly Gly Gln Leu Arg

[0044] 260 265 270

[0045] Thr Leu Leu Gly Val Asp Ser Gly Ala Lys Ile Gly Gly Thr Glu Lys

[0046] 275 280 285

[0047] Thr Thr Ile Ser Glu Ala Ile Ser Asp Val Lys Gln Ala Leu Thr Asp

[0048] 290 295 300

[0049] Ala Thr Leu Ala Tyr Lys Ala Asp Asn Lys Asn Gly Lys Thr Val Lys

[0050] 305 310 315 320

[0051] Leu Thr Asp Gly Leu Asn Phe Thr Ser Thr Thr Asn Ile Asp Ala Ser

[0052] 325 330 335

[0053] Val Glu Asp Asn Gly Val Val Lys Phe Thr Leu Lys Asp Lys Leu Thr

[0054] 340 345 350

[0055] Gly Leu Lys Thr Ile Ala Thr Glu Ser Leu Asn Ala Ser Gln Asn Ile

[0056] 355 360 365

[0057] Ile Ala Gly Gly Thr Val Thr Val Gly Gly Glu Thr Glu Gly Ile Val

[0058] 370 375 380

[0059] Leu Thr Lys Ser Gly Ser Gly Asn Asp Arg Thr Leu Ser Leu Ser Gly

[0060] 385 390 395 400

[0061] Ala Gly Asn Ala Ala Thr Asp Gly Ile Lys Val Ser Gly Val Lys Ala

[0062] 405 410 415

[0063] Gly Thr Ala Asp Thr Asp Ala Val Asn Lys Gly Gln Leu Asp Lys Leu

[0064] 420 425 430

[0065] Phe Lys Ala Ile Asn Asp Ala Leu Gly Thr Thr Asp Leu Ala Val Thr

[0066] 435 440 445

[0067] Lys Asn Pro Asn Gln Thr Ser Ile Phe Asn Pro Ile Asn Gly Thr Ala

[0068] 450 455 460

[0069] Pro Thr Thr Phe Lys Asp Ala Val Asp Lys Leu Thr Thr Ala Val Asn

[0070] 465 470 475 480

[0071] Thr Gly Trp Gly Ser Lys Val Gly Ile Leu Ala Thr Gly Ile Asp Gly

[0072] 485 490 495

[0073] Ile Asp Ala Gly Asn Lys Lys Ile Ser Asn Val Ala Asp Gly Asp Ile

[0074] 500 505 510

[0075] Ser Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Thr Gly Arg Gln Leu Tyr Ala Leu

[0076] 515 520 525

[0077] Met Gln Lys Gly Ile Arg Val Tyr Gly Asp Glu Val Ser Pro Thr Lys

[0078] 530 535 540

[0079] Thr Gln Thr Thr Ala Pro Thr Ala Ser Ser Thr Gln Gly Gly

[0080] 545 550 555

[0081] <210>2

[0082] <211>1686

[0083] <212>DNA

[0084] <213>P9蛋白的基因编码序列(P9)

[0085] <400>2

[0086] gaattcctgg cacagagcgt aaaaaccaac tttggcggca atgcaaatct ggcaaccgac60

[0087] ggtaccatca cctttaccaa cattggcggt accggtcagg ataccattca cgacgcgatc120

[0088] aacaacgttc tgaccaaact gattagcctg agcgcaaccg aagaagaagt tgttagcggc180

[0089] gaagctgttt atgacgcact gaaaggcgca aaaccgaccg ttagcgcaga agcgaacaaa240

[0090] ggcattaccg gtctggttga cgtcgttaaa aaagcgaaca gtccgattac cgttgaaccg300

[0091] agtaccgaca acaacaagaa gaagaccttc accgtcggtc tgatgaagga tatcgaaggc360

[0092] gtcaacagca tcaccttcga caaaagcggt caggatctga accaggttac cggtcgtatg420

[0093] agttctgcag gtctgacctt taagaaaggc gataccacca acggtagtac caccaccttt480

[0094] gcagaagacg gtctgaccat tgatagcacc accaatagcg cacagaccaa tctggtcaaa540

[0095] gttagccgtg acggctttag cgttaaaaac ggtagcgacg aaagcaaact ggcaagcacc600

[0096] aaactgagca ttggcgcaga aaacgcagaa cacgttgagg ttaccaaaag cggcattgcg660

[0097] ctgaaagcgg ataacaccag cgacaaaagc agcattaccc tggcacaaga cgcaattacc720

[0098] ctggcaggta acgcaaccgg taccgcaatt aaactgaccg gcgttgcaga cggtaatatt780

[0099] accgtaaaca gcaaagacgc agttaacggc ggtcaactgc gtaccctgct gggcgtagat840

[0100] tcaggcgcaa aaattggcgg caccgaaaaa accaccatca gcgaagcgat cagcgacgtt900

[0101] aaacaggcac tgaccgacgc aaccctggca tataaagcgg acaacaagaa cggcaaaacc960

[0102] gtcaaactga ccgacggtct gaactttacc agtaccacca acatcgacgc gagcgttgaa1020

[0103] gataacggcg tcgtcaagtt caccctgaaa gacaaactga ccggcctgaa aaccattgca1080

[0104] accgaaagcc tgaacgcaag ccagaatatc attgcgggtg gtaccgtaac cgttggcggc1140

[0105] gaaaccgaag gtattgtcct gaccaaaagc ggtagcggta acgatcgtac cctgtctctg1200

[0106] tctggtgcag gtaacgcagc aaccgacggt attaaagtta gcggcgttaa agcaggtacc1260

[0107] gcagataccg acgcagttaa taaaggccag ctggataagc tgttcaaagc gattaacgac1320

[0108] gccctgggta ccaccgatct ggcagttacc aaaaacccga accagaccag catcttcaat1380

[0109] ccgattaacg gtaccgcacc gaccaccttt aaagatgcgg ttgataaact gaccaccgca1440

[0110] gttaacaccg gttggggtag taaagttggc attctggcaa ccggtattga cggtattgac1500

[0111] gcaggcaaca agaaaatcag caacgttgcg gacggcgata ttagtccgac ctcaggcgac1560

[0112] gttgttaccg gtcgtcaact gtacgcactg atgcagaaag gcattcgcgt ttacggcgac1620

[0113] gaagttagtc cgaccaaaac ccaaaccacc gcaccgaccg caagtagtac ccaaggcggt1680

[0114] ctcgag 1686

[0115] <210>3

[0116] <211>27

[0117] <212>DNA

[0118] <213>人工序列(Artificial Sequence)

[0119] <400>3

[0120] gaattcctgg cacagagcgt aaaaacc

[0121] 27

[0122] <210>4

[0123] <211>27

[0124] <212>DNA

[0125] <213>人工序列(Artificial Sequence)

[0126] <400>4

[0127] ctcgagaccg ccttgggtac tacttgc 27

Claims (10)

1.一种副鸡禽杆菌的抗原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码如权利要求1所述抗原蛋白的编码基因，其特征在于，其核苷酸的序列如SEQ IDNO.2所示。

3.一种用于检测副鸡禽杆菌抗体的试剂盒，其特征在于，其含有如权利要求1或2所述的抗原蛋白用于样品中副鸡禽杆菌抗体水平的测定。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述与样品中抗体检测的测定的方法为ELISA法、蛋白质印迹法、胶体金免疫法或斑点杂交法。

5.一种用于检测副鸡禽杆菌抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1或2所述的抗原蛋白包被的ELISA板、样品稀释液、酶标记结合物、洗涤液和终止液。

6.如权利要求5所述的ELISA试剂盒，其特征在于，还包括阴性对照血清、阳性对照血清，所述阴性对照血清是SPF鸡血清，所述阳性对照血清是用如上所述的抗原蛋白接种健康鸡所得血清。

7.如权利要求5所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述ELISA板的制备方法包括如下步骤：将所述抗原蛋白用碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，按100μL/孔加入至96孔包被板中，置于4℃过夜，洗涤液300μL/孔洗涤3次，每次3min，之后，加入5％脱脂乳的PBS溶液，37℃封闭1h，甩去封闭液。

8.如权利要求5的ELISA试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为含有1％的脱脂乳的PBS溶液，所述酶标记结合物为辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡酶标抗体；所述洗涤液为含有0.05％Tween 20的PBS溶液，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。

9.一种副鸡禽杆菌的疫苗制剂，其特征在于，其含有如权利要求1或2所述的抗原蛋白和佐剂。

10.如权利要求9所述的疫苗制剂，其特征在于，所述抗原蛋白的终浓度为20μg/ml。