CN110133284A

CN110133284A - 蛋白抗原及其编码基因和它们在鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗抗体和自然感染抗体中的应用

Info

Publication number: CN110133284A
Application number: CN201910374742.3A
Authority: CN
Inventors: 丁红雷; 徐作波; 文玉康
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2019-05-07
Filing date: 2019-05-07
Publication date: 2019-08-16

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及蛋白抗原及其编码基因和它们在鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗抗体和自然感染抗体中的应用，所述蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明的检测体系能快速、方便、高特异性、高灵敏度的鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗免疫抗体和自然感染抗体，不需要复杂仪器，能较好的满足目前对鉴别猪肺炎支原体高免血清抗体和恢复期血清抗体的需要，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

Description

蛋白抗原及其编码基因和它们在鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗抗体和自然感染抗体中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种蛋白抗原及其编码基因和它们在鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗抗体和自然感染抗体中的应用。

背景技术

猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS)又称猪喘气病或猪气喘病，是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)引起的一种慢性、接触性传染病，通过呼吸道在猪只和猪群之间传播，是猪场最常见的疫病之一。该病通常不引起猪的死亡，但会使其出现发热、咳嗽、呼吸困难等症状，造成食欲减退、生长阻滞、饲料转化率降低、上市时间延迟。本病一旦传入猪群，很难彻底清除，且Mhp通常与其他病毒或细菌引起猪呼吸系统疾病综合征(Porcine respiration disease complex，PRDC)。根据流行病学资料，该病广泛分布于包括发达国家在内的世界各地。在我国有超过95％的猪场均为Mhp血清阳性(陈财,华利忠,甘源,等.猪支原体肺炎净化研究进展[J].中国动物保健,2014,16(11):16-19.)。因此，Mhp是一种在我国广泛存在，长期危害养猪业并造成巨大损失的病原菌之一。

灭活疫苗免疫是当前防控该病的主要手段。由于Mhp广泛存在于各个猪场，在猪只刚出生之时即可能被Mhp感染，这就造成无论是否使用Mhp疫苗，猪群中所有的猪只均会产生针对Mhp的抗体，但这些抗体是由灭活疫苗免疫产生还是自然感染产生，现有的Mhp血清抗体检测试剂盒无法区分。若能够区分是疫苗抗体还是自然感染抗体，则可以针对不同来源的抗体，通过调整免疫方案，提高免疫接种率，降低由于Mhp自然感染造成的经济损失。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种能够有效区分是灭活疫苗抗体还是自然感染抗体的蛋白抗原及其编码基因和应用，以及提供一种鉴定猪肺炎支原体自然感染抗体检测试剂盒，用于检测猪肺炎支原体自然感染抗体。

为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种蛋白抗原，所述蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

第二方面，本发明提供了一种能够编码如上所述的蛋白抗原的基因。

第三方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体含有如上所述的基因。

第四方面，本发明提供了一种重组菌株，所述重组菌株含有如上所述的重组载体。

第五方面，本发明提供了如上所述的蛋白抗原、如上所述的基因、如上所述的重组载体或如上所述的重组菌株在鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗抗体和自然感染抗体中的应用。

第六方面，本发明提供了一种用于鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗抗体和自然感染抗体的试剂盒以及用于鉴定猪肺炎支原体自然感染抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括如上的蛋白抗原。

通过采用本发明提供的技术方案，可以获得如下几方面的效果：

(1)高特异性：因猪肺炎支原体与猪鼻支原体等具有免疫交叉，因此猪肺炎支原体全菌特异性差，本发明使用的蛋白抗原为猪肺炎支原体的特异性蛋白，与猪鼻支原体等其他病原无交叉，保证了ELISA的高度特异性。

(2)高灵敏度：血清样本在1:2000稀释时仍然能判断为阳性，与一般的猪传染病ELISA诊断试剂盒要求的血清在1:20-1:100稀释相比，显示其具有较高的灵敏性。

(3)简单快速：采用本发明的检测试剂盒仅需要移液器和酶标仪进行加样和读数，操作仅需约3h。

本发明的检测体系能快速、方便、高特异性、高灵敏度的鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗免疫抗体和自然感染抗体以及检测猪肺炎支原体自然感染抗体，不需要复杂仪器。其中，本发明所述鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗免疫抗体和自然感染抗体的体系相比于IDEXX试剂盒，只能检测自然感染猪肺炎支原体产生的抗体，不能检测由于注射灭活疫苗而产生的抗体，而IDEXX试剂盒不能够区分自然感染猪肺炎支原体产生的抗体和注射灭活疫苗而产生的抗体，对二者均具有检测性。因此，本发明的检测体系能较好的满足目前对鉴别猪肺炎支原体高免血清抗体和恢复期血清抗体以及检测猪肺炎支原体自然感染抗体的需要，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为琼脂糖凝胶电泳检测蛋白抗原编码基因片段的PCR扩增产物图谱。泳道M为DNA大小标准(DNA Marker)，泳道1为PCR扩增产物。电泳条带位于750-1000bp之间，扩增片段与预期片段大小837bp一致。

图2为插入有蛋白抗原编码基因片段的重组质粒pET-28a(+)酶切鉴定结果。其中，泳道M为DNA大小标准(DNA Marker)，泳道1为重组质粒pET-28a(+)酶切结果。酶切后的质粒为5369bp，目的基因片段为837bp，与预期结果相符。

图3为蛋白抗原的表达形式鉴定结果。其中，泳道M为蛋白分子量标准(蛋白Marker)；泳道1为全菌蛋白；泳道2为破菌去除细胞碎片后的离心上清，泳道3为破菌去除细胞碎片后的离心沉淀。蛋白抗原大小为40kDa，与预期结果相符。

图4为蛋白抗原的Western blotting鉴定结果。用His抗体检测蛋白抗原。M为蛋白分子量标准(蛋白Marker)；泳道1为未经IPTG诱导的全菌蛋白；泳道2为经1mmol/L IPTG诱导的全菌蛋白。经His抗体检测，重组菌经1mmol/L IPTG诱导后，蛋白抗原在重组菌表达。

图5为蛋白抗原纯化结果。M为蛋白分子量标准(蛋白Marker)；泳道1为经IPTG诱导的破菌上清，泳道2为流穿蛋白，泳道3-11为纯化的蛋白抗原。经纯化后，蛋白抗原的纯度可以达到90％以上。

图6为鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗抗体和自然感染抗体最佳蛋白抗原浓度的确定。根据恢复期血清与高免血清的P/N值，确定最佳抗原包被浓度为0.25μg/mL。

图7为鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗抗体和自然感染抗体最佳封闭液的确定。根据恢复期血清与高免血清的P/N值，确定最佳封闭液为含终浓度2.5％脱脂奶粉的PBS。

图8为鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗抗体和自然感染抗体最佳封闭时间的确定。根据恢复期血清与高免血清的P/N值，确定最佳封闭时间为0.5h。

图9为鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗抗体和自然感染抗体最佳一抗稀释比例的确定。根据恢复期血清与高免血清的P/N值，确定最佳一抗稀释比例为1:1000稀释。

图10为鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗抗体和自然感染抗体一抗孵育时间的确定。根据恢复期血清与高免血清的P/N值，确定最佳一抗孵育时间为0.5h。

图11为鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗抗体和自然感染抗体最佳二抗稀释比例的确定。根据恢复期血清与高免血清的P/N值，确定最佳二抗稀释比例为1:10000稀释。

图12为鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗抗体和自然感染抗体最佳二抗孵育时间的确定。根据恢复期血清与高免血清的P/N值，确定最佳二抗孵育时间为2h。

图13为鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗抗体和自然感染抗体最佳显色时间的确定。根据恢复期血清与高免血清的P/N值，确定最佳显色时间为10min。

图14为鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗抗体和自然感染抗体特异性的确定。根据确定的判定标准，猪鼻支原体、猪圆环病毒2型、胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌2型、猪瘟病毒、高致病性蓝耳病病毒、伪狂犬病毒gE蛋白、伪狂犬病毒gB蛋白阳性血清检测结果均为阴性。证明所建立的鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗抗体和自然感染抗体的ELISA方法具有良好的特异性。

图15为鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗抗体和自然感染抗体灵敏性的确定。根据确定的判定标准，所能检测的血清最大稀释倍数为1:2000。

图16为鉴定猪肺炎支原体自然感染抗体最佳蛋白抗原浓度的确定。根据恢复期血清与阴性血清的P/N值，确定最佳抗原包被浓度为0.25μg/mL。

图17为鉴定猪肺炎支原体自然感染抗体最佳封闭液的确定。根据恢复期血清与高免血清的P/N值，确定最佳封闭液为含终浓度2.5％脱脂奶粉的PBS。

图18为鉴定猪肺炎支原体自然感染抗体最佳封闭时间的确定。根据恢复期血清与阴性血清的P/N值，确定最佳封闭时间为1h。

图19为鉴定猪肺炎支原体自然感染抗体最佳一抗稀释比例的确定。根据恢复期血清与阴性血清的P/N值，确定最佳一抗稀释比例为1:500稀释。

图20为鉴定猪肺炎支原体自然感染抗体一抗孵育时间的确定。根据恢复期血清与阴性血清的P/N值，确定最佳一抗孵育时间为0.5h。

图21为鉴定猪肺炎支原体自然感染抗体最佳二抗稀释比例的确定。根据恢复期血清与阴性血清的P/N值，确定最佳二抗稀释比例为1:10 000稀释。

图22为鉴定猪肺炎支原体自然感染抗体最佳二抗孵育时间的确定。根据恢复期血清与阴性血清的P/N值，确定最佳二抗孵育时间为1h。

图23为鉴定猪肺炎支原体自然感染抗体最佳显色时间的确定。根据恢复期血清与阴性血清的P/N值，确定最佳显色时间为15min。

图24为鉴定猪肺炎支原体自然感染抗体特异性的确定。根据确定的判定标准，猪鼻支原体、猪圆环病毒2型、胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌2型、猪瘟病毒、高致病性蓝耳病病毒、伪狂犬病毒gE蛋白、伪狂犬病毒gB蛋白阳性血清检测结果均为阴性。证明所建立的鉴定猪肺炎支原体自然感染抗体的ELISA方法具有良好的特异性。

图25为鉴定猪肺炎支原体自然感染抗体灵敏性的确定。根据确定的判定标准，所能检测的血清最大稀释倍数为1:2 000。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

在本发明中，在未作相关说明的情况下，使用的术语“灭活疫苗抗体”是指因接种猪肺炎支原体灭活疫苗而产生的血清抗体；

术语“自然感染抗体”是指感染猪肺炎支原体而产生的血清抗体；

术语“高免血清”是指猪肺炎支原体阴性猪场采集的经猪肺炎支原体灭活疫苗免疫一段时间且猪肺炎支原体ELISA检测试剂盒检测为阳性的猪血清；

术语“恢复期血清”是指未经免疫且猪肺炎支原体ELISA检测试剂盒检测为阳性的猪血清；

术语“自然感染抗体”是指感染野生型猪肺炎支原体而产生的血清抗体；

术语“阴性血清”是指猪肺炎支原体阴性猪场采集的经猪肺炎支原体ELISA检测试剂盒检测为阴性的猪血清。

第一方面，本发明提供一种蛋白抗原，所述蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

SEQ ID NO：1

MKKMVKYFLVLSSISPFLVLSCTYKIESSKTKKKILPEIRSEETPEKSEDKLDPTKESKVSPVEENTQKENSQKNDVVNSQNKTEKTEKTQGTENQTTDNNFWSESTSDLSDQTNFDFAKVNQNSIKININGLTQASESDFSKNEVKNIAKTPTYYKYQLKNWENVIKKENETTFLGQKNDNLNIFLIKQMNNNLVDNVNAKANYYSYFNPNRLGNYYILPYFGFKSDSLEEKRYANIFTRNIRFAPGTAVFLNANSGKAAFLTNRHVLYPYHNGGPFW

根据本发明，本发明提供的蛋白抗原还可以进行修饰，修饰(通常不改变一级结构，即不改变氨基酸序列)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。

为了方便纯化，还可以采用本领域常见的标签对SEQ ID NO：1所示的蛋白抗原进行添加修饰，举例来说，可以通过在SEQ ID NO：1所示的蛋白抗原的氨基末端和/或羧基末端连接下表1所示的标签(如Poly-Arg、Poly-His、FLag、Strep-TagⅡ和C-myc中的至少一种)而获得。所述标签不会影响本发明的蛋白抗原的活性，在实际应用过程中，可以根据需求选择是否添加标签。

表1

标签	残基数	氨基酸序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR(SEQ ID NO：3)
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH(SEQ ID NO：4)
			Flag	8	DYKDDDDK(SEQ ID NO：5)
Strep-tagⅡ	8	WSHPQFEK(SEQ ID NO：6)
			C-myc	10	EQKLISEEDL(SEQ ID NO：7)

上述SEQ ID NO：1所示的蛋白抗原可以通过人工合成得到，也可以先合成其编码基因，再通过生物表达获得。

第二方面，本发明还提供了能够编码如上所述的蛋白抗原的基因。

本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如PCR方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。

优选地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

SEQ ID NO：2

ATGAAAAAAATGGTAAAATATTTTCTAGTTTTAAGTTCTATAAGTCCTTTTTTAGTTCTAAGTTGTACTTATAAAATTGAATCTAGCAAAACTAAGAAAAAAATATTACCGGAAATAAGAAGTGAAGAAACTCCCGAAAAAAGTGAAGATAAATTAGATCCAACAAAAGAATCAAAAGTAAGTCCAGTTGAAGAAAATACCCAAAAAGAAAATAGCCAAAAAAATGATGTAGTAAATAGCCAAAATAAAACAGAAAAAACGGAAAAAACACAAGGAACGGAAAATCAAACCACAGATAACAATTTTTGGTCTGAATCTACAAGTGATTTATCAGACCAAACTAATTTTGATTTTGCAAAGGTAAATCAAAATTCAATAAAAATTAATATTAATGGACTAACACAAGCCAGCGAAAGCGATTTTAGCAAAAATGAGGTAAAAAATATTGCTAAAACGCCAACTTATTATAAATATCAGCTTAAAAATTGGGAAAATGTTATAAAAAAAGAAAATGAAACTACTTTTTTAGGTCAGAAAAATGATAATTTAAATATTTTTCTAATAAAACAAATGAATAATAATTTAGTCGATAATGTTAATGCAAAAGCAAATTATTATTCCTATTTTAACCCAAATAGACTAGGAAATTATTATATTCTACCTTACTTTGGATTTAAATCAGATAGTCTTGAAGAAAAAAGATATGCAAATATTTTTACTCGAAACATTCGGTTTGCCCCTGGAACTGCAGTTTTTTTAAACGCTAATTCCGGAAAAGCCGCTTTTTTAACTAACAGACACGTTTTATATCCTTACCATAACGGTGGCCCATTTTGG

如上所述，相应地，核苷酸序列的5'端和/或3'端还可以连接有上表1所示的标签的编码序列。

本发明提供的核苷酸序列通常可以用聚合酶链式反应(PCR)扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列，可以很容易得到模板和引物，利用PCR进行扩增获得有关序列。

一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得相关的氨基酸序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。

此外，还可用公知的人工化学合成的方法来合成有关核苷酸序列。

第三方面，本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体含有如上所述的基因。

根据本发明，重组载体中使用的“载体”可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等，本发明优选pET28a(+)质粒。重组载体构建可采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种核酸内切酶(如对于pUC18，可用SalⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ等；对于pET28a(+)，可用NdeⅠ、NheⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ等)进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒。本发明优选采用BamHⅠ和Xho I双酶切pET28a(+)及与其连接的基因片段，经连接酶连接，构建得到重组载体。

根据本发明，可以通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到宿主细胞(菌株)中，如氯化钙法化学转化、高压电击转化，优选氯化钙法化学转化。所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，优选为杆状菌(如大肠杆菌(Escherichia coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))或酵母菌(如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))，更优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌(如大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌DH5α)。

根据本发明，利用所述重组菌种制备本发明的蛋白抗原的方法可以包括：培养本发明提供的重组菌株，诱导编码蛋白抗原的基因的表达；分离提纯所表达的蛋白抗原。所述培养条件为常规的培养条件，如使用LB培养基(溶剂为水，溶质及其终浓度分别为：Tryptone 10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5-10g/L)，在35-37℃下培养至OD₆₀₀为0.7-0.9，再加入IPTG进行诱导目标蛋白的表达。由于本发明提供的重组菌株中含有编码蛋白抗原的基因，IPTG诱导后可以高效地表达蛋白抗原。培养后经过分离提纯，即可得到高纯度的蛋白抗原。可以采用本领域技术人员公知的方法进行分离提纯(如，往菌体中加入Binding buffer(20mmol/L Na₂HPO₄、20mmol/L NaH₂PO₄、0.5mol/L NaCl)，超声破碎细菌，再经过镍柱纯化即可得到蛋白抗原)，在此不再赘述。

(一)鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗抗体和自然感染抗体

本发明提供了如上所述的蛋白抗原、如上所述的基因、如上所述的重组载体或如上所述的重组菌株在鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗抗体和自然感染抗体中的应用。

本发明提供了一种用于鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗抗体和自然感染抗体的试剂盒，该试剂盒中包括如上所述的蛋白抗原。

根据本发明，所述蛋白抗原可以包被在ELISA板上，从而可以通过ELISA的方法对猪肺炎支原体灭活疫苗抗体和自然感染抗体进行区分，其中，将所述蛋白抗原包被在ELISA板上的方法可以按照本领域公知的方法进行，例如，可以包括：将蛋白抗原以0.1-8μg/mL(例如，可以为0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL)的包被浓度加入ELISA板的孔中，34-40℃孵育0.5-1.5h、2-6℃过夜进行包被，然后加入封闭液封闭0.3-2h。

为了进一步提高检测的特异性和灵敏度，优选的，所述蛋白抗原溶解在碳酸盐缓冲液中配制成0.1-8μg/mL的浓度，其中，所述碳酸盐缓冲液的pH值为9-10，例如，可以为9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0；所述碳酸盐缓冲液中，基于100mL的总体积，可以含有0.15-0.17g的Na₂CO₃，0.29-0.3g的NaHCO₃。

其中，最优选的，所述蛋白抗原的浓度为0.25μg/mL。

根据本发明，所述封闭液可以为本领域常规使用的各种封闭液，例如可以为含有脱脂奶粉的PBS缓冲液、含有明胶的PBS缓冲液、含有卵清蛋白的PBS缓冲液，优选的，所述封闭液为含0.5-10重量％，更优选2-3重量％脱脂奶粉的PBS缓冲液，例如，可以为2重量％、2.1重量％、2.2重量％、2.3重量％、2.4重量％、2.5重量％、2.6重量％、2.7重量％、2.8重量％、2.9重量％、3.0重量％，最优选的，所述封闭液为含有2.5重量％脱脂奶粉的PBS缓冲液。

进一步优选的，所述封闭的时间0.3-0.8h，例如，可以为0.3h、0.4h、0.5h、0.6h、0.7h、0.8h，最优选的，所述封闭的时间0.5h。

根据本发明，所述试剂盒中还可以含有ELISA检测用的其他试剂，例如，还可以含有用于作为对照的含有猪肺炎支原体灭活疫苗抗体的高免血清、含有自然感染抗体的恢复期血清，以及洗涤液、二抗、显色液和终止液等组分。

其中，所述高免血清和恢复期血清的存在可以用于判断检测是否有效，例如，当用于待测血清的检测时，如果高免血清阴性，恢复期血清显色则说明检测有效，待测血清如果阳性则说明其含有猪肺炎支原体自然感染抗体，如果待测血清阴性则说明其含有猪肺炎支原体灭活疫苗抗体；但如果高免血清阳性，则说明检测失效。

其中，术语“阳性”是指检测结果达到了可检测的范围，也即在检测限以上，也即可检出，术语“阴性”是指检测结果未达到可检测的范围，也即在检测限以下，也即不可检出。例如，可以测定ELISA检测结束时ELISA板孔中液体的OD_450nm，当OD_450nm达到0.319以上时则判断为阳性；当OD_450nm小于0.319时则判断为阴性。

根据本发明，为了进一步提高检测结果的精准性，在进行检测之前，优选将血清样本(以及一抗)稀释500-2000倍，最优选稀释1000倍。其中，所述血清样本的稀释优选采用封闭液进行稀释。优选的，一抗的孵育时间为0.5-2h，例如，可以为0.5h、0.8h、1h、1.5h、1.8h、2h小时，最优选为0.5h。

根据本发明，为了进一步提高检测结果的精准性，在进行检测之前，优选将二抗稀释10 000-80 000倍，最优选稀释10 000倍。其中，所述二抗的稀释优选采用封闭液进行稀释。优选的，所述二抗为HRP标记的兔抗猪IgG，其可以通过商购获得。优选的，二抗的孵育时间为0.5-2h，可以为0.5h、0.8h、1h、1.5h、1.8h、2h，最优选为2h。

根据本发明，在一抗和二抗孵育结束后还包括使用洗涤液对ELISA板进行洗涤，所述洗涤可以重复3-5次，每次2-5min。所述洗涤液可以为本领域常规的洗涤液，优选的，洗涤液为含0.04-0.06重量％的Tween-20和0.008-0.012重量％硫柳汞的PBS缓冲液。

根据本发明，所述显色液可以为本领域常规的显色液，优选的，所述显色液包括显色液A和显色液B；其中，所述显色液A中，相对于100mL的显色液A，含有2-3g的醋酸钠，0.3-0.35g的柠檬酸，以30％双氧水浓度计的0.04-0.08mL的双氧水；所述显色液B中，相对于100mL的显色液B，含有0.02-0.06g的EDTA·2Na，0.15-0.25g的柠檬酸，8-12mL的甘油，0.035-0.045g的TMB·2HCl。其中，当二抗孵育结束并洗涤ELISA板后，加入显色液A和显色液B进行显色，所述显色的时间可以在根据实际情况下进行选择，优选的，显色时间为5-15min，优选为8-12min，最优选为10min，显色结束后加入终止液终止显色。

优选的，所述终止液为1.5-2.5mol/L的硫酸溶液。

(二)鉴定猪肺炎支原体自然感染抗体

所述的重组菌株还可以用于检测猪肺炎支原体自然感染抗体中的应用。

本发明还提供了一种用于检测猪肺炎支原体自然感染抗体的试剂盒，该试剂盒中包括如上所述的蛋白抗原。所述蛋白抗原可以包被在ELISA板上，从而可以通过ELISA的方法对猪肺炎支原体阴性血清和恢复期血清进行区分，其中，将所述蛋白抗原包被方法、溶解、封闭液的选择同上。

其中所述封闭的时间0.3-2h，例如，可以为0.3h、0.5h、0.8h、1.0h、1.3h、1.5h、1.8h、2.0h，最优选的，所述封闭的时间1h。

用于检测猪肺炎支原体自然感染抗体的试剂盒，所述试剂盒中还包括：含有猪肺炎支原体阴性血清、含有自然感染抗体的恢复期血清、洗涤液、二抗、显色液和终止液。

其中，所述阴性血清和恢复期血清的存在可以用于判断检测是否有效，例如，当用于待测血清的检测时，如果阴性血清阴性，恢复期血清显色则说明检测有效，待测血清如果阳性则说明其含有猪肺炎支原体自然感染抗体，如果待测血清阴性则说明其不含猪肺炎支原体自然感染抗体；但如果阴性血清阳性，则说明检测失效。

其中，术语“阳性”是指检测结果达到了可检测的范围，也即在检测限以上，也即可检出，术语“阴性”是指检测结果未达到可检测的范围，也即在检测限以下，也即不可检出。例如，可以测定ELISA检测结束时ELISA板孔中液体的OD_450nm，当OD_450nm达到0.296以上时则判断为阳性，当OD_450nm小于0.296时则判断为阴性。

根据本发明，为了进一步提高检测结果的精准性，在进行检测之前，优选将血清样本(以及一抗)稀释50-2 000倍，最优选稀释500倍。其中，所述血清样本的稀释优选采用封闭液进行稀释。优选的，一抗的孵育时间为0.5-2h，例如，可以为0.5h、0.8h、1h、1.5h、1.8h、2h小时，最优选为0.5h。

根据本发明，为了进一步提高检测结果的精准性，在进行检测之前，优选将二抗稀释10 000-80 000倍，最优选稀释10 000倍。其中，所述二抗的稀释优选采用封闭液进行稀释。优选的，所述二抗为HRP标记的兔抗猪IgG，其可以通过商购获得。优选的，二抗的孵育时间为0.5-2h，可以为0.5h、0.8h、1h、1.5h、1.8h、2h，最优选为1h。

根据本发明，所述显色液可以为本领域常规的显色液，优选的，所述显色液包括显色液A和显色液B；其中，所述显色液A中，相对于100mL的显色液A，含有2-3g的醋酸钠，0.3-0.35g的柠檬酸，以30％双氧水浓度计的0.04-0.08mL的双氧水；所述显色液B中，相对于100mL的显色液B，含有0.02-0.06g的EDTA·2Na，0.15-0.25g的柠檬酸，8-12mL的甘油，0.035-0.045g的TMB·2HCl。其中，当二抗孵育结束并洗涤ELISA板后，加入显色液A和显色液B进行显色，所述显色的时间可以在根据实际情况下进行选择，优选的，显色时间为5-15min，优选为10-15min，最优选为15min，显色结束后加入终止液终止显色。

优选的，所述终止液为1.5-2.5mol/L的硫酸溶液。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1.pET-28a(+)载体、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)：实验室保存。

2.Primestar Max Premix、蛋白Marker、T4DNA ligase、BamHI、XhoI：购自宝日医生物技术(北京)有限公司。

3.细菌基因组DNA提取试剂盒、核酸Marker：购自天根生化科技(北京)有限公司。

4.胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒：购自美国Omega公司。

5.HRP标记兔抗猪IgG二抗：购自Thermo Fisher科技公司。

6.His-tag(4C2)单克隆抗体：购自Bioworld公司。

7.BCA蛋白浓度测定试剂盒：购自碧云天生物技术研究所。

8.亲和层析预装柱：购自GE公司。

9.猪肺炎支原体抗体检测试剂盒：购自美国IDEXX公司。

10.酶标板：购自康宁公司。

11.猪肺炎支原体灭活疫苗(商品名：喜宜丰)：购自西班牙海博莱公司。

12.碳酸盐缓冲液：Na₂CO₃ 0.159g，NaHCO₃ 0.293g溶于50mL ddH₂O中，加ddH₂O定容至100mL，调节pH到9.6。

13.PBS缓冲液：NaCl 8g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，KCl 0.2g，加ddH₂O定容至1L。

14.洗涤液：含0.05重量％Tween-20和0.01重量％硫柳汞的PBS缓冲液。

15.显色液A：醋酸钠2.72g，柠檬酸0.32g，30％双氧水0.06mL，加ddH₂O定容至100mL。

16.显色液B：EDTA·2Na 0.04g、柠檬酸0.19g、甘油10mL，TMB·2HCl 0.0391g，加ddH₂O定容至100mL。

17.终止液为2mol/L的硫酸溶液。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的蛋白抗原的制备方法

1、重组菌的构建

委托成都擎科梓熙生物技术有限公司合成SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，以及SEQ ID NO:1的扩增引物，扩增引物的上下游5'端分别引入限制性内切酶BamHI和XhoI酶切位点(下划横线)和相应的保护性碱基(下划波浪线)序列如下：

上游引物(SEQ ID NO:8)：

下游引物(SEQ ID NO:9)：

PCR反应体系为50μL：Primestar Max Premix 25μL，DNA模板0.5μL，上游引物(10pmol/μL)0.5μL，下游引物(10pmol/μL)0.5μL，ddH₂O 23.5μL。

PCR反应条件为：98℃预变性5min；98℃预变性30s，52℃退火30s，72℃延伸50s，共25个循环；最后72℃延伸6min。

PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(电泳图如图1所示，电泳条带位于750-1000bp之间，扩增片段与预期片段大小837bp一致)，并按照胶回收试剂盒说明书进行PCR产物回收，然后使用BamHI和XhoI双酶切，再次胶回收，使用T4 DNA ligase连接同样经BamHI和XhoI双酶切和胶回收的pET-28a(+)载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(参照《精编分子生物学实验指南》制备大肠杆菌DH5α感受态，以及将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态)，筛选阳性重组子，用BamHI和XhoI双酶切鉴定(酶切电泳图如图2所示，酶切后的质粒为5369bp，目的基因片段为837bp，与预期结果相符)，选取双酶切鉴定正确的阳性重组子送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。

2.重组菌的筛选鉴定及表达形式鉴定

挑取Kan⁺LB平板单克隆接种Kan⁺LB液体培养基，37℃180r/min摇床培养6h。取2mL菌液按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒。用BamHI和XhoI双酶切鉴定。酶切鉴定正确的质粒送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。测序正确的质粒为重组质粒。

重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，经质粒酶切鉴定后保存重组菌。重组菌接种于含100μg/mL Kan⁺的LB液体培养基，37℃摇床培养至600nm处吸光度(OD₆₀₀)为0.7-0.9时，部分加入终浓度为1mmol/L IPTG，16℃诱导表达目的蛋白20h。部分不加入IPTG，16℃表达目的蛋白20h。各自收集菌体，收集的菌体加入适量的Binding buffer(20mmol/L Na₂HPO₄、20mmol/L NaH₂PO₄、0.5mol/L NaCl)，超声破碎细菌，部分破碎产物800g离心25min，取上清，再次12 000g离心30min，分别取离心上清和离心沉淀。

其中，对于经诱导的菌体，超声破碎产物(全蛋白)、离心上清和离心沉淀经SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况(图3，泳道1为全菌蛋白；泳道2为破菌去除细胞碎片后的离心上清，泳道3为破菌去除细胞碎片后的离心沉淀。蛋白抗原大小为40kDa，与预期结果相符)。

其中，对于未经诱导和经过诱导的菌体，使用His-tag(4C2)单克隆抗体通过WB(Western blotting)确认目的蛋白的表达(图4，M为蛋白分子量标准(蛋白Marker)；泳道1为未经IPTG诱导的全菌蛋白；泳道2为经1mmol/L IPTG诱导的全菌蛋白。经His-tag(4C2)单克隆抗体检测，重组菌经1mmol/L IPTG诱导后，蛋白抗原在重组菌表达)。

由图3和图4可知，重组蛋白在重组菌能够表达，且由图3可以看出，重组蛋白能以可溶和包涵体两种形式表达。

3.重组蛋白的纯化

亲和层析柱经硫酸镍再生后，Binding buffer洗涤柱子，重组菌的可溶蛋白(离心上清)上样后，经含Washing buffer(20mmol/L Na₂HPO₄、20mmol/L NaH₂PO₄、0.5mol/LNaCl、0.5mol/L咪唑)洗涤柱体，洗去杂蛋白，再经Elution buffer(20mmol/L Na₂HPO₄、20mmol/L NaH₂PO₄、0.5mol/L NaCl、1mol/L咪唑)洗脱，得到纯化的蛋白，纯化结果如图5所示，其中，M为蛋白分子量标准(蛋白Marker)；泳道1为经IPTG诱导的破菌上清，泳道2为流穿蛋白，泳道3-11为纯化的蛋白抗原。经纯化后，蛋白抗原的纯度可以达到90％以上。

鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗抗体和自然感染抗体

实施例2

本实施例用于说明猪血清的采集及检测

在猪肺炎支原体阴性猪场，仔猪21天断奶后，在第28天免疫猪肺炎支原体疫苗喜宜丰，第42天加强免疫一次，第63天前腔静脉取血。共采集血清28份。

在猪肺炎支原体阳性猪场采集90-200日龄的商品猪血液30份。

采集的血清经IDEXX公司猪肺炎支原体抗体试剂盒检测，保存疫苗免疫后猪肺炎支原体抗体阳性血清(高免血清)20份和猪肺炎支原体阳性猪场抗体阳性血清(恢复期血清)20份。

实施例3

本实施例用于说明ELISA试剂盒最佳反应条件的确定以及操作步骤

1、最佳抗原包被浓度、封闭液和封闭时间的确定

用碳酸盐缓冲液稀释纯化蛋白。浓度分别为0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL，ELISA板的每孔加入100μL，37℃孵育1h后4℃过夜。洗涤液洗涤5次，每次3min，加入200μL含2.5重量％脱脂奶粉的PBS封闭0.5h。洗涤液洗涤5次，每次3min，3份高免血清和3份恢复期血清经含2.5重量％脱脂奶粉的PBS 1:1000稀释，每孔加入100μL，37℃孵育0.5h。洗涤液洗涤5次，每次3min，HRP标记的兔抗猪IgG用含2.5重量％脱脂奶粉的PBS1:10000稀释，每孔加入100μL，37℃孵育2h。洗涤液洗涤5次，每次3min，每孔加入底物液A、B各50μL，混匀，室温避光显色10min后加入50μL终止液，酶标仪测定OD_450nm。以P(3份恢复期血清OD_450nm平均值)/N(3份高免血清OD_450nm平均值)的最大值确定最佳抗原包被浓度为0.25μg/mL(如图6)。

酶标板经最佳抗原包被浓度包被后，用洗涤液洗涤5次，每次3min。分别加入200μL封闭液(封闭液分别为PBST、含1重量％BSA的PBS、含2.5重量％脱脂奶粉的PBS、含1重量％明胶的PBS、含1重量％卵清蛋白的PBS)37℃封闭0.5h、1h、2h，然后洗涤液洗涤5次，每次3min。洗涤液洗涤5次，每次3min，3份高免血清和3份恢复期血清经含2.5重量％脱脂奶粉的PBS 1:1000稀释，每孔加入100μL，37℃孵育0.5h。洗涤液洗涤5次，每次3min，HRP标记的兔抗猪IgG用含2.5重量％脱脂奶粉的PBS 1:10 000稀释，每孔加入100μL，37℃孵育2h。洗涤液洗涤5次，每次3min，每孔加入底物液A、B各50μL，混匀，室温避光显色10min后加入50μL终止液，酶标仪测定OD_450nm。以P/N的最大值确定最佳封闭液为2.5重量％脱脂奶粉(如图7)的PBS和最佳封闭时间为0.5h(如图8)。

2、一抗最佳稀释度和孵育时间的确定

取高免血清3份(一抗)和恢复期血清3份(一抗)，分别用抗体稀释液(含2.5重量％脱脂奶粉的PBS)按1:50、1:200、1:500、1:1 000、1:2 000、1:4 000比例稀释后，在步骤一中确定的最佳条件的ELISA板每孔加入100μL，37℃孵育0.5h、1h、2h，洗涤液洗涤5次，每次3min。HRP标记的兔抗猪IgG用含2.5重量％脱脂奶粉的PBS 1:10 000稀释，每孔加入100μL，37℃孵育2h。洗涤液洗涤5次，每次3min，每孔加入底物液A、B各50μL，混匀，室温避光显色10min后加入50μL终止液，酶标仪测定OD_450nm。以P/N的最大值确定最佳一抗稀释比例为1:1000(如图9)和最佳一抗孵育时间为0.5h(如图10)。

3、二抗最佳稀释度和孵育时间的确定

HRP标记的兔抗猪IgG用抗体稀释液1:10 000、1:20 000、1:40 000、1:80 000比例稀释后，步骤二中确定的最佳条件的ELISA板每孔加入100μL，37℃孵育0.5h、1h、2h，洗涤液洗涤5次，每次3min。每孔加入底物液A、B各50μL，混匀，室温避光显色10min后加入50μL终止液，酶标仪测定OD_450nm。以P/N的最大值确定最佳二抗稀释比例为1:10 000(如图11)和最佳二抗孵育时间为2h(如图12)。

4、最佳显色时间的确定

步骤三中确定的最佳条件的ELISA板每孔加入底物液A、B各50μL，混匀，室温避光显色5min、10min、15min后加入50μL终止液，酶标仪测定OD_450nm，确定最佳显色时间为10min(如图13)。

实施例4

本实施例用于说明阳性判定标准的确定

对12份高免血清按实施例3确定的最适条件进行ELISA检测，每份血清重复三孔。12份高免血清的OD_450nm值的平均值(X)和标准差(SD)分别为0.178和0.047。因此确定恢复期血清的临界值为X+3SD，即0.319，也即OD_450nm在0.319以上为阳性，也即，判断为自然感染抗体，低于0.319为阴性，也即，判断为灭活疫苗免疫产生的抗体。

实施例5

本实施例用于说明本发明方法的重复性

高免血清和恢复期血清各随机选择2份。用3个不同批次制备的重组抗原包被酶标板，在同一条件下按照确定的最佳ELISA的程序进行检测，测定并记录OD_450nm值，结果进行统计学分析，计算变异系数(变异系数＝标准差/平均值×100％)结果显示，批间重复性试验的变异系数在3.18-6.44％之间。同一批次每个血清做5个重复，结果显示，批内重复性试验的变异系数在0.88-6.01％之间。说明，批间和批内重复试验的变异系数均小于7％，具有良好的重复性。

实施例6

本实施例用于说明本发明方法的特异性

以随机选择的猪高免血清和恢复期血清各两份为对照，用已建立的ELISA方法检测猪的猪鼻支原体(江苏省农业科学院提供)、猪圆环病毒2型(北京金诺百泰生物技术有限公司，货号：IPCVB18059)、胸膜肺炎放线杆菌(武汉科前生物股份有限公司)、猪链球菌2型(武汉科前生物股份有限公司)、猪瘟病毒(美国IDEXX生物科技公司，货号：M331)、高致病性蓝耳病病毒(美国IDEXX生物科技公司，货号：M501)、伪狂犬病病毒gB蛋白(西班牙海博莱公司，货号：CAESC02)的阳性血清，分析所建立ELISA方法的特异性。结果如图14所示，猪高免血清和恢复期血清检测结果分别为阴性和阳性，其他病原阳性血清检测结果均为阴性。证明所建立的ELISA方法具有良好的特异性。

实施例7

本实施例用于说明本发明方法的灵敏性

将随机选择的恢复期血清5份，用稀释液分别按1:500、1:1 000、1:2 000、1:4000、1:8 000、1:16 000、1:32 000、1:64 000稀释，取100μL进行ELISA检测，确定所建立方法的最高稀释倍数。OD_450nm值随着稀释倍数的增加而减小(图15)，当恢复期血清1:2 000倍稀释时，检测结果为阳性；当恢复期血清1:4 000倍稀释时，4份检测结果为阳性，1份检测结果为阴性；当恢复期血清1:8 000倍稀释时，2份检测结果为阳性，3份检测结果为阴性；当恢复期血清1:16 000倍稀释时，检测结果为阴性。即所能检测的血清最大稀释倍数为1:2000。由此可见，本发明确定的方法的检测灵敏性较高。

鉴定猪肺炎支原体然感染抗体

实施例8

本实施例用于说明猪血清的采集及检测

在猪肺炎支原体阴性猪场采集90-200日龄的商品猪血液40份，在猪肺炎支原体阳性猪场采集90-200日龄的未经猪肺炎支原体疫苗免疫的商品猪血液30份。

采集的血清经IDEXX公司猪肺炎支原体抗体试剂盒检测，保存猪肺炎支原体阴性猪场抗体阴性血清(阴性血清)36份和猪肺炎支原体阳性猪场抗体阳性血清(恢复期血清)20份。

实施例9

1、最佳抗原包被浓度、封闭液和封闭时间的确定

用碳酸盐缓冲液稀释纯化蛋白。浓度分别为0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL，ELISA板的每孔加入100μL，37℃孵育1h后4℃过夜。洗涤液洗涤5次，每次3min，加入200μL含2.5重量％脱脂奶粉的PBS封闭1h。洗涤液洗涤5次，每次3min，3份阴性血清和3份恢复期血清经含2.5重量％脱脂奶粉的PBS 1:500稀释，每孔加入100μL，37℃孵育0.5h。洗涤液洗涤5次，每次3min，HRP标记的兔抗猪IgG用含2.5重量％脱脂奶粉的PBS 1:10 000稀释，每孔加入100μL，37℃孵育1h。洗涤液洗涤5次，每次3min，每孔加入底物液A、B各50μL，混匀，室温避光显色15min后加入50μL终止液，酶标仪测定OD_450nm。以P(3份恢复期血清OD_450nm平均值)/N(3份阴性血清OD_450nm平均值)的最大值确定最佳抗原包被浓度为0.25μg/mL(如图16)。

酶标板经最佳抗原包被浓度包被后用洗涤液洗涤5次，每次3min。分别加入200μL封闭液(封闭液分别为PBST、含1重量％BSA的PBS、含2.5重量％脱脂奶粉的PBS、含10体积％FBS的PBS、含1重量％明胶的PBS、含1重量％卵清蛋白的PBS)37℃分别封闭0.5h、1h、2h，然后洗涤液洗涤5次，每次3min。洗涤液洗涤5次，每次3min，3份阴性血清和3份恢复期血清经含2.5重量％脱脂奶粉的PBS 1:500稀释，每孔加入100μL，37℃孵育0.5h。洗涤液洗涤5次，每次3min，HRP标记的兔抗猪IgG用含2.5重量％脱脂奶粉的PBS 1:10000稀释，每孔加入100μL，37℃孵育1h。洗涤液洗涤5次，每次3min，每孔加入底物液A、B各50μL，混匀，室温避光显色15min后加入50μL终止液，酶标仪测定OD_450nm。以P/N的最大值确定最佳封闭液为2.5重量％脱脂奶粉(如图17)的PBS，最佳封闭时间为1h(如图18)。

2、一抗最佳稀释度和孵育时间的确定

取阴性血清3份(一抗)和恢复期血清3份(一抗)，分别用抗体稀释液(含2.5重量％脱脂奶粉的PBS)按1:50、1:200、1:500、1:1 000、1:2 000、1:4 000、1:8 000比例稀释后，在步骤一中确定的最佳条件的ELISA板每孔加入100μL，37℃孵育0.5h、1h、2h，洗涤液洗涤5次，每次3min。HRP标记的兔抗猪IgG用含2.5重量％脱脂奶粉的PBS 1:10000稀释，每孔加入100μL，37℃孵育1h。洗涤液洗涤5次，每次3min，每孔加入底物液A、B各50μL，混匀，室温避光显色15min后加入50μL终止液，酶标仪测定OD_450nm。以P/N的最大值确定最佳一抗稀释比例为1:500(如图19)和最佳一抗孵育时间为0.5h(如图20)。

3、二抗最佳稀释度和孵育时间的确定

HRP标记的兔抗猪IgG用抗体稀释液1:10 000、1:20 000、1:40 000、1:80 000比例稀释后，步骤二中确定的最佳条件的ELISA板每孔加入100μL，37℃孵育0.5h、1h、2h，洗涤液洗涤5次，每次3min。每孔加入底物液A、B各50μL，混匀，室温避光显色15min后加入50μL终止液，酶标仪测定OD_450nm。以P/N的最大值确定最佳二抗稀释比例为1:10 000(如图21)和最佳二抗孵育时间为1h(如图22)。

4、最佳显色时间的确定

步骤三中确定的最佳条件的ELISA板每孔加入底物液A、B各50μL，混匀，室温避光显色5min、10min、15min后加入50μL终止液，酶标仪测定OD_450nm，确定最佳显色时间为15min(如图23)。

实施例4

本实施例用于说明阳性判定标准的确定

对36份阴性血清按实施例3确定的最适条件进行ELISA检测，每份血清重复三孔。36份阴性血清的OD_450nm值的平均值(X)和标准差(SD)分别为0.168和0.043。因此确定恢复期血清的临界值为X+3SD，即0.296，也即OD_450nm在0.296以上为阳性，也即，判断为自然感染抗体，低于0.296为阴性，也即判断为阴性血清。

实施例5

本实施例用于说明本发明方法的重复性

阴性血清和恢复期血清各随机选择2份。用3个不同批次制备的重组抗原包被酶标板，在同一条件下按照确定的最佳ELISA的程序进行检测，测定并记录OD_450nm值，结果进行统计学分析，计算变异系数(变异系数＝标准差/平均值×100％)结果显示，批间重复性试验的变异系数在3.46％～5.93％之间。同一批次每个血清做5个重复，结果显示，批内重复性试验的变异系数在3.27％～7.26％之间。说明，批间和批内重复试验的变异系数均小于8％，具有良好的重复性。

实施例6

本实施例用于说明本发明方法的特异性

以随机选择的猪阴性血清和恢复期血清各两份为对照，用已建立的ELISA方法检测猪的猪鼻支原体(江苏省农业科学院提供)、猪圆环病毒2型(北京金诺百泰生物技术有限公司，货号：IPCVB18059)、胸膜肺炎放线杆菌(武汉科前生物股份有限公司)、猪链球菌2型(武汉科前生物股份有限公司)、猪瘟病毒(美国IDEXX生物科技公司，货号：M331)、高致病性蓝耳病病毒(美国IDEXX生物科技公司，货号：M501)、伪狂犬病病毒gB蛋白(西班牙海博莱公司，货号：CAESC02)的阳性血清，分析所建立ELISA方法的特异性。结果如图24所示，猪阴性血清和恢复期血清检测结果分别为阴性和阳性，其他病原阳性血清检测结果均为阴性。证明所建立的ELISA方法具有良好的特异性。

实施例7

本实施例用于说明本发明方法的灵敏性

将随机选择的恢复期血清5份，用稀释液分别按1:100、1:500、1:1 000、1:2 000、1:4 000、1:8 000、1:16 000、1:32 000稀释，取100μL进行ELISA检测，确定所建立方法的最高稀释倍数。OD_450nm值随着稀释倍数的增加而减小(图25)，当恢复期血清1:2 000倍稀释时，检测结果为阳性；当恢复期血清1:4 000倍稀释时，1份检测结果为阳性，4份检测结果为阴性；当恢复期血清1:8 000倍稀释时，检测结果为阴性。即所能检测的血清最大稀释倍数为1:2 000。由此可见，本发明确定的方法的检测灵敏性较高。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 西南大学

<120> 蛋白抗原及其编码基因和它们在鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗抗体和自然感染抗体中的应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 279

<212> PRT

<213> 蛋白抗原氨基酸(Protein antigen amino acid)

<400> 1

Met Lys Lys Met Val Lys Tyr Phe Leu Val Leu Ser Ser Ile Ser Pro

1 5 10 15

Phe Leu Val Leu Ser Cys Thr Tyr Lys Ile Glu Ser Ser Lys Thr Lys

20 25 30

Lys Lys Ile Leu Pro Glu Ile Arg Ser Glu Glu Thr Pro Glu Lys Ser

35 40 45

Glu Asp Lys Leu Asp Pro Thr Lys Glu Ser Lys Val Ser Pro Val Glu

50 55 60

Glu Asn Thr Gln Lys Glu Asn Ser Gln Lys Asn Asp Val Val Asn Ser

65 70 75 80

Gln Asn Lys Thr Glu Lys Thr Glu Lys Thr Gln Gly Thr Glu Asn Gln

85 90 95

Thr Thr Asp Asn Asn Phe Trp Ser Glu Ser Thr Ser Asp Leu Ser Asp

100 105 110

Gln Thr Asn Phe Asp Phe Ala Lys Val Asn Gln Asn Ser Ile Lys Ile

115 120 125

Asn Ile Asn Gly Leu Thr Gln Ala Ser Glu Ser Asp Phe Ser Lys Asn

130 135 140

Glu Val Lys Asn Ile Ala Lys Thr Pro Thr Tyr Tyr Lys Tyr Gln Leu

145 150 155 160

Lys Asn Trp Glu Asn Val Ile Lys Lys Glu Asn Glu Thr Thr Phe Leu

165 170 175

Gly Gln Lys Asn Asp Asn Leu Asn Ile Phe Leu Ile Lys Gln Met Asn

180 185 190

Asn Asn Leu Val Asp Asn Val Asn Ala Lys Ala Asn Tyr Tyr Ser Tyr

195 200 205

Phe Asn Pro Asn Arg Leu Gly Asn Tyr Tyr Ile Leu Pro Tyr Phe Gly

210 215 220

Phe Lys Ser Asp Ser Leu Glu Glu Lys Arg Tyr Ala Asn Ile Phe Thr

225 230 235 240

Arg Asn Ile Arg Phe Ala Pro Gly Thr Ala Val Phe Leu Asn Ala Asn

245 250 255

Ser Gly Lys Ala Ala Phe Leu Thr Asn Arg His Val Leu Tyr Pro Tyr

260 265 270

His Asn Gly Gly Pro Phe Trp

275

<210> 2

<211> 837

<212> DNA

<213> 抗原蛋白核酸(Antigenic protein nucleic acid)

<400> 2

atgaaaaaaa tggtaaaata ttttctagtt ttaagttcta taagtccttt tttagttcta 60

agttgtactt ataaaattga atctagcaaa actaagaaaa aaatattacc ggaaataaga 120

agtgaagaaa ctcccgaaaa aagtgaagat aaattagatc caacaaaaga atcaaaagta 180

agtccagttg aagaaaatac ccaaaaagaa aatagccaaa aaaatgatgt agtaaatagc 240

caaaataaaa cagaaaaaac ggaaaaaaca caaggaacgg aaaatcaaac cacagataac 300

aatttttggt ctgaatctac aagtgattta tcagaccaaa ctaattttga ttttgcaaag 360

gtaaatcaaa attcaataaa aattaatatt aatggactaa cacaagccag cgaaagcgat 420

tttagcaaaa atgaggtaaa aaatattgct aaaacgccaa cttattataa atatcagctt 480

aaaaattggg aaaatgttat aaaaaaagaa aatgaaacta cttttttagg tcagaaaaat 540

gataatttaa atatttttct aataaaacaa atgaataata atttagtcga taatgttaat 600

gcaaaagcaa attattattc ctattttaac ccaaatagac taggaaatta ttatattcta 660

ccttactttg gatttaaatc agatagtctt gaagaaaaaa gatatgcaaa tatttttact 720

cgaaacattc ggtttgcccc tggaactgca gtttttttaa acgctaattc cggaaaagcc 780

gcttttttaa ctaacagaca cgttttatat ccttaccata acggtggccc attttgg 837

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> Poly-Arg

<400> 3

Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> Poly-His

<400> 4

His His His His His His

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> Flag

<400> 5

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> Strep-tagⅡ

<400> 6

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> C-myc

<400> 7

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 上游引物(Upstream primer)

<400> 8

cgcggatcca tgaaaaaaat ggtaaaatat tttctag 37

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 下游引物(Downstream primer)

<400> 9

ccgctcgagc caaaatgggc caccgtt 27

Claims

1.一种蛋白抗原，其特征在于，所述蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种能够编码权利要求1所述的蛋白抗原的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求2或3所述的基因。

5.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株含有权利要求4所述的重组载体。

6.权利要求1所述的蛋白抗原、权利要求2或3所述的基因、权利要求4所述的重组载体或权利要求5所述的重组菌株在鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗抗体和自然感染抗体中的应用。

7.一种用于鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗抗体和自然感染抗体的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包括权利要求1所述的蛋白抗原，所述试剂盒中还包括：含有猪肺炎支原体灭活疫苗抗体的高免血清、含有自然感染抗体的恢复期血清、洗涤液、二抗、显色液和终止液。

8.一种用于鉴别猪肺炎支原体自然感染抗体的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包括权利要求1所述的蛋白抗原，所述试剂盒中还包括：含有猪肺炎支原体阴性血清、含有自然感染抗体的恢复期血清、洗涤液、二抗、显色液和终止液。

9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其中，所述蛋白抗原包被在ELISA板上；优选的，将所述蛋白抗原包被在ELISA板上的方法包括：

将蛋白抗原以0.1-8μg/mL的包被浓度加入ELISA板的孔中，34-40℃孵育0.5-1.5h进行包被，然后加入封闭液封闭0.3-2h；

其中，所述封闭液为含有0.5-10重量％脱脂奶粉的PBS缓冲液。

10.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其中，所述洗涤液为含0.04-0.06重量％的Tween-20和0.008-0.012重量％硫柳汞的PBS缓冲液；和/或

所述二抗为HRP标记的兔抗猪IgG；和/或

所述显色液包括显色液A和显色液B；其中，所述显色液A中，相对于100mL的显色液A，含有2-3g的醋酸钠，0.3-0.35g的柠檬酸，以30％双氧水浓度计的0.04-0.08mL的双氧水；所述显色液B中，相对于100mL的显色液B，含有0.02-0.06g的EDTA·2Na，0.15-0.25g的柠檬酸，8-12mL的甘油，0.035-0.045g的TMB·2HCl；和/或

所述终止液为1.5-2.5mol/L的硫酸溶液。