CN104211785B - 鸭坦布苏病毒e蛋白第三结构域重组蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白，该重组蛋白具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，编码该重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了诊断鸭坦布苏病毒病的试剂盒和抗鸭坦布苏病毒病疫苗。本发明的鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白，不仅可以作为诊断抗原检测鸭坦布苏病毒病抗体，而且还可以作为鸭坦布苏病毒病的亚单位疫苗接种动物诱导产生中和抗体，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白及其应用。
背景技术
鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu Virus,DTMUV）引起的一种以蛋鸭产蛋下降为主要特征的传染病。2010年，鸭坦布苏病毒病在我国南方部分地区首次发生，之后蔓延到全国大部分鸭养殖地区。其主要临床上表现为高热、食欲废绝、产蛋下降甚至停止，死亡率可达5%～10%。该病传播迅速且发病范围广，给我国蛋鸭和种鸭养殖造成了极大经济损失。
鸭坦布苏病毒（DTMUV）属于黄病毒科、黄病毒属，其基因组为不分节段的单股正链RNA，核苷酸长度约为11kb，含有单一的开放阅读框，编码结构蛋白（C、PrM和E）和非结构蛋白（NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5）。对于黄病毒的研究表明，E蛋白是黄病毒主要表面结构蛋白，包含许多与宿主嗜性、宿主细胞膜融合及宿主细胞表面受体结合相关的抗原表位。根据其功能不同，E蛋白分为三个结构域（I，II和III），而成免疫球蛋白样的第三结构域（EDIII）位于病毒最外层，在介导病毒与宿主受体结合中具有重要的作用，同时也是诱导中和抗体的优势表位区域。鸭坦布苏病毒与其他黄病毒一样，具有相似的E蛋白结构。在黄病毒的研究中，对EDIII的表达和功能研究，对于病毒与宿主细胞的相互作用、以及临床诊断和亚单位疫苗研究具有重要意义。鸭坦布苏病毒病是一种新发传染病，目前，对于该病的诊断缺乏有效的诊断抗原，而且，对于该病的预防也无疫苗可用。
以大肠杆菌为宿主的原核表达系统，由于其繁殖快，成本低等优点而被广泛使用。然而密码子对于宿主具有偏嗜性，不同宿主密码子的使用频率不同，经常会影响异源基因在宿主中的表达。另外，对于目的蛋白的表达，表达载体的选择也很重要，选择合适的表达载体使目的蛋白获得高效、可溶性的表达，对于目的蛋白后续的研究和应用具有重要意义。
发明内容
本发明要解决目前针对鸭坦布苏病毒病缺乏有效的诊断抗原和疫苗的技术问题，提供一种鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白，该重组蛋白是根据大肠杆菌偏好性密码子对鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域的核苷酸序列进行优化后获得的可溶性重组蛋白，该可溶性重组蛋白不仅可以作为诊断抗原检测鸭坦布苏病毒病抗体，而且还可以作为鸭坦布苏病毒病的亚单位疫苗接种动物诱导产生中和抗体。
此外，还需要提供一种上述鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白的应用。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
在本发明的一个方面，提供了一种鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白，该重组蛋白具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，编码该重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的另一方面，还提供了一种重组载体，包含：编码鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域蛋白的基因序列，所述鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。优选的，所述编码鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域蛋白的基因序列是按照大肠杆菌偏好性密码子进行优化后的核苷酸序列，该优化序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，所述重组载体的空载体为pCold-TF原核表达载体，使目的蛋白与可溶性的载体蛋白融合表达，能获得可溶性的重组蛋白。
在本发明的另一方面，还提供了一种由上述重组载体经表达而制得的鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白。
在本发明的另一方面，还提供了一种诊断鸭坦布苏病毒病的试剂盒，包含上述鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白。
优选的，所述试剂盒还包含ELISA酶标板、酶标二抗、酶底物液，其中酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鸭二抗。
在本发明的另一方面，还提供了一种抗鸭坦布苏病毒病疫苗，包含上述鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白。
在本发明的另一方面，还提供了一种疫苗组合物，包含：与佐剂或药用载体混合上述抗鸭坦布苏病毒病疫苗。
在本发明的另一方面，还提供了一种上述鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白在制备诊断鸭坦布苏病毒病的产品中的应用。
在本发明的另一方面，还提供了一种上述鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白在制备预防或治疗鸭坦布苏病毒病的疫苗中的应用。
本发明的鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白，是按照大肠杆菌偏好性密码子对鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域的核苷酸序列进行优化后获得的高表达重组蛋白EDIII，而且，由于选用pCold-TF载体，使目的蛋白与可溶性的载体蛋白融合表达，获得的重组蛋白EDIII是可溶性的。Western Blot和间接ELISA实验证实，本发明鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白能与鸭坦布苏病毒特异性血清发生反应，可作为鸭坦布苏病毒病的诊断抗原来检测鸭坦布苏病毒病抗体。纯化的本发明鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白免疫BLAB/c小鼠和鸭子可诱导产生中和抗体，说明本发明鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白还可以作为鸭坦布苏病毒病亚单位疫苗的候选。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例1的鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域核苷酸密码子优化前的序列（EDIII）和优化后的序列(optiEDIII)对比图；
图2是本发明实施例1构建的重组质粒用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切鉴定结果图；
图3是本发明实施例1表达的重组蛋白和纯化后的重组蛋白SDS-PAGE分析图；
图4是本发明实施例1用鸭坦布苏病毒血清(A)和His单抗(B)检测重组蛋白的Western Blot结果图；
图5是本发明实施例2用重组蛋白EDIII作为间接ELISA的包被抗原检测鸭坦布苏病毒抗体结果图；
图6是本发明实施例3用间接ELISA检测重组蛋白EDIII免疫小鼠血清结果柱状图；
图7是本发明实施例3用间接免疫荧光试验检测重组蛋白EDIII免疫小鼠血清结果图。
具体实施方式
下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编，马学军,舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。
为了获得有效的针对鸭坦布苏病毒病的诊断抗原和疫苗，本发明按照大肠杆菌偏好性密码子对鸭坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅲ核苷酸序列进行了优化，即把目的基因中大肠杆菌稀有的密码子改变为大肠杆菌喜好的密码子，优化序列经合成后再利用大肠杆菌表达系统高效表达了E蛋白的第三结构域，重组表达的蛋白呈可溶性。Western Blot和间接ELISA实验证实重组蛋白能与鸭坦布苏病毒特异性血清发生反应，可作为鸭坦布苏病毒病的诊断抗原来检测鸭坦布苏病毒病抗体。纯化的鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白免疫BLAB/c小鼠和鸭子可诱导产生中和抗体，可作为鸭坦布苏病毒病亚单位疫苗的候选。
实施例1鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域在大肠杆菌中的表达、鉴定分析与纯化
1.病毒株、质粒和实验动物
DTMUV奉贤分离株（FX2010）为本研究室分离、鉴定及保存；pCold-TF载体为TaKaRa公司产品；DF-1细胞为本实验室保存；DTMUV的鸭阳性血清和DTMUVE蛋白的单克隆抗体（Mab）1F5由本研究室制备并保存；6周龄雌性BLAB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物公司。
2.主要试剂
限制性内切酶、蛋白Marker和DNA Marker购自TaKaRa公司；质粒小提试剂盒和DNA胶回收试剂盒购自德国AXYGEN公司；Ni-NTA Agarose购自上海悦克生物技术有限公司；TMB显色液购自武汉博士德公司；荧光标记羊抗鼠IgG（FITC-IgG）、HRP标记的羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；HRP标记的羊抗鸭IgG为KPL公司产品；WestPico Chemiluminescent Substrate为Thermo公司产品。
3.密码子优化
编码DTMUV EDIII的核苷酸序列含有多个大肠杆菌稀有密码子，这可能会影响蛋白在原核系统中的高效表达。为了提高蛋白的表达量，本发明在不改变DTMUV EDIII氨基酸序列（SEQ ID NO.1）前提下，对编码E蛋白第三结构域（EDIII）核苷酸序列进行优化，把大肠杆菌稀有密码子改变为大肠杆菌偏好性密码子，改变优化后的DTMUV EDIII的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，同时在该基因序列的上游引入BamH I酶切位点，下游引入Hind Ⅲ酶切位点。优化后的基因序列由英骏生物技术有限公司合成，命名为optiEDⅢ。优化前后的序列对比如图1所示。
4.原核表达载体构建
将含有优化基因optiEDⅢ的质粒用限制性内切酶BamH I和Hind III进行消化，与经相同酶消化的pCold-TF载体连接，连接好的产物转化至BL21（DE3）感受态细胞，挑取单菌落扩增培养，提取质粒后用BamH I和Hind III双酶切进行鉴定。将筛选到的阳性质粒进行测序以验证序列的正确性，阳性质粒命名为pCold-TF-optiEDIII。结果显示，构建的质粒用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切鉴定，电泳后，可以见到约350bp左右和约5700bp的片段，与预期大小相一致（图2），图2中，M：DNA Marker2000；1-2：pCold-TF-optiEDIII；3-4：pCold-TF。重组质粒pCold-TF-optiEDIII经测序，结果和原序列完全一致。
5.重组蛋白的诱导表达
将阳性质粒pCold-TF-optiEDIII转化至BL21（DE3）感受态细胞，挑取单菌落接种于含Amp的LB培养液中，37℃振荡培养，待菌液OD值达到0.6-0.8时，加入1mmol IPTG，静置30min，15℃低温诱导24h。将培养物4℃10000rpm离心10min，用1mlPBS悬起管底菌液，置冰上裂解超声，4℃10000rpm离心10min，取上清，用于SDS-PAGE和Western Blot分析。
6.SDS-PAGE和Western Blot鉴定表达产物
用10%的分离胶，将表达产物以每孔15μl的上样量进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，凝胶经考马斯亮蓝R-250染色。另一部分凝胶转印至PVDF膜，采用5%脱脂乳封闭2h，以抗DTMUV鸭阳性血清（1:100）和His单抗（1:1000）37℃孵育2h，PBST洗5次，用羊抗鸭HRP-IgG（1:5000）或羊抗鼠HRP-IgG（1:10000）为二抗，37℃孵育1h。最后采用ECL显色和压片曝光，分析表达产物。SDS-PAGE结果显示，在约70kd处出现明显条带，与预期大小一致，表明目的蛋白为可溶性表达（见图3，图3中，M：蛋白分子质量标准；1：在大肠杆菌中表达的EDIII上清样品；2：纯化的重组蛋白）。Western Blot分析结果显示，目的蛋白与鸭坦布苏病毒阳性血清反应，也与His单抗发生反应，在约70kd处出现明显条带（见图4，图4中，M：蛋白分子质量标准；1，3：重组蛋白EDIII；2：载体蛋白Trigger Factor），而对照的载体蛋白无特异性条带，表明表达的目的蛋白具有良好的反应原性。
7.重组蛋白的纯化
将阳性克隆单菌落接种于含Amp的LB培养液中，37℃振荡培养至适当浓度，再按1%接种至200ml LB培养液中培养，待菌液OD值达到0.6时，加入1mmol IPTG，静置30min后，15℃低温诱导24h。培养物4℃10000rpm离心10min，用10mlPBS悬起管底菌液，置冰上裂解超声，4℃10000rpm离心10min，取上清。将收集的上清液4℃用Ni-NTA Agarose柱进行纯化，用含不同浓度咪唑的洗脱液洗去杂蛋白，最后用400mmol咪唑洗脱目的蛋白。纯化后的蛋白用SDS-PAGE分析，并且用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白含量。SDS-PAGE结果显示，目的蛋白得到纯化（图3）。
实施例2用纯化的重组蛋白作为检测抗原建立间接ELISA检测鸭坦布苏病毒病抗体
用包被液稀释纯化的重组蛋白EDIII（作为检测抗原）和载体蛋白（作为对照抗原），终浓度为0.5ug/100ul，作为间接ELISA的检测抗原，检测5份鸭坦布苏病毒阳性血清，1份鸭坦布苏病毒阴性血清以及鸭瘟病毒阳性血清，鸭肝炎病毒阳性血清，H9N2禽流感病毒阳性血清各1份，检测重组蛋白EDIII作为检测抗原检测鸭坦布苏病毒病抗体的可行性和特异性。间接ELISA实验操作程序如下：
1.包被：用包被缓冲液（pH9.6碳酸盐缓冲液）稀释纯化的重组蛋白EDIII（0.5ug/100ul）和载体蛋白（0.5ug/100ul）按每孔100μl加入到酶标板中，4℃过夜。用PBST(0.5‰tween20)洗涤（200ul/孔）3次，每次2分钟。
2.封闭：每孔加5%的脱脂乳封闭液200μl，37℃封闭1h，用PBST(0.5‰tween20)洗涤（200ul/孔）4次，每次5分钟。
3.加入血清样品：用PBS做稀释液，将鸭坦布苏病毒阳性血清、鸭坦布苏病毒阴性血清、鸭瘟病毒阳性血清、鸭肝炎病毒阳性血清和H9N2禽流感病毒阳性血清按1:200稀释，加入酶标板（100ul/孔），37℃孵育1h，用PBST(0.5‰tween20)洗涤（200ul/孔）4次，每次5分钟。
4.加入酶标二抗：用PBS做稀释液，将HRP标记的羊抗鸭二抗稀释至1:2000，加入酶标板（100ul/孔），37℃孵育1h，用PBST(0.5‰tween20)洗涤（200ul/孔）4次，每次5分钟。
5.底物显色与终止：每孔加100μl TMB显色液，避光室温显色5min，然后每孔加入50ul2mol/l的浓硫酸终止液。
6.检测OD值：酶标仪测定OD450值。
结果显示，重组蛋白EDIII可以与鸭坦布苏病毒阳性血清发生特异性反应，而与鸭瘟病毒阳性血清、鸭肝炎病毒阳性血清、H9N2禽流感病毒阳性血清和鸭坦布苏病毒阴性血清不发生反应。该结果说明，本发明的重组蛋白EDIII可以作为诊断抗原检测鸭坦布苏病毒病抗体（图5）。图5中，1-5：鸭坦布苏病毒病阳性血清；6：鸭瘟病毒阳性血清；7：鸭肝炎病毒阳性血清；8：H9N2禽流感病毒阳性血清；9：鸭坦布苏病毒病阴性血清。
实施例3用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠
1.BALB/c小鼠免疫
将BALB/c小鼠随机分成三组，每组5只。将50μɡ融合蛋白和50μɡpCold-TF空载体蛋白与等体积的弗式佐剂乳化后，每三周腹腔注射免疫一次，共免疫3次，最后一次免疫后10天采血，分离血清用于抗体检测，另设空白组，作为对照。
2.间接ELISA检测血清抗体
间接ELISA检测按参考文献（姬希文，闫丽萍，颜丕熙，等.鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2011，33（8）：630-634.）进行，将小鼠免疫血清1:100倍稀释后加入到包被好的全病毒ELISA板中，同时设载体蛋白免疫血清（5份血清等体积混合）和小鼠阴性血清对照，37℃孵育1h，PBST洗三次，每次5min；加入1:5000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1h，PBST洗三次；用TMB显色液避光显色10min，用2mol/l浓H2SO4终止后，测定OD450。用载体蛋白免疫小鼠血清和小鼠阴性血清作为对照。ELISA检测结果显示，重组蛋白EDIII免疫小鼠抗体水平明显高于载体蛋白免疫组和空白对照组（图6）。图6中，1-5：EDIII免疫小鼠血清；6：载体蛋白TriggerFactor免疫小鼠血清；7：小鼠阴性血清。
3.间接免疫荧光试验检测血清抗体
长满单层DF-1细胞的24孔细胞培养板，每孔接种1000TCID50的DTMUV（FX2010株）病毒，培养24h后，用4%多聚甲醛固定，用1%BSA封闭0.5h，加入小鼠免疫血清，同时设载体蛋白免疫血清（5份血清等体积混合）和小鼠阴性血清对照，室温孵育1.5h，以1:200倍稀释的羊抗鼠FITC-IgG37℃孵育1h，PBS洗4次，在荧光显微镜下观察。间接免疫荧光试验检测结果显示，重组蛋白EDIII免疫小鼠血清可与病毒发生特异性反应，病毒感染细胞呈现绿色荧光。而载体蛋白免疫小鼠血清和小鼠阴性血清都无特异性荧光（图7）。上述结果表明，重组蛋白EDIII能刺激机体产生良好的免疫应答，具有良好的免疫原性。图7中，A：EDIII免疫小鼠血清；B：载体蛋白TriggerFactor免疫小鼠血清；C：小鼠阴性血清。
4.中和抗体检测
将5份小鼠免疫血清等体积混合后，56℃灭活30min，用含2%的FBS细胞维持液作为稀释液，将血清作2倍梯度稀释，与等体积的100TCID50病毒液混合，37℃孵育1.5h，将50μL混合液加入DF-1细胞长成单层的24孔细胞培养板，每个样品接2孔，37℃孵育1.5h。培养24h，弃维持液，用4%多聚甲醛固定15min，用0.5%Triton-100通透15min，加入1:400稀释的抗鸭坦布苏病毒单抗1F5，37℃孵育1h后，用PBS洗三次，每次5min；最后用1:200倍稀释的荧光标记羊抗鼠FITC-IgG为二抗孵育，在荧光显微镜下观察，用法计算中和抗体效价。结果显示，重组蛋白EDIII免疫小鼠血清中和抗体效价可达到1：12，而载体蛋白免疫小鼠血清和空白组小鼠血清中和效价都小于1：2。
实施例4用纯化的重组蛋白免疫鸭子
1.鸭子免疫
将母鸭随机分成三组，每组5只。将100μɡ融合蛋白和100μɡpCold-TF空载体蛋白与等体积的油佐剂乳化后，每三周肌肉注射免疫一次，共免疫3次，最后一次免疫后10天采血，分离血清用于抗体检测，另设空白组，作为对照。
2.中和抗体检测
将5份鸭子免疫血清等体积混合后，56℃灭活30min，用含2%的FBS细胞维持液作为稀释液，将血清作2倍梯度稀释，与等体积的100TCID50病毒液混合，37℃孵育1.5h，将50μL混合液加入DF-1细胞长成单层的24孔细胞培养板，每个样品接2孔，37℃孵育1.5h。培养24h，弃维持液，用4%多聚甲醛固定15min，用0.5%Triton-100通透15min，加入1:400稀释的抗鸭坦布苏病毒单抗1F5，37℃孵育1h后，用PBS洗三次，每次5min；最后用1:200倍稀释的荧光标记羊抗鼠FITC-IgG为二抗孵育，在荧光显微镜下观察，用法计算中和抗体效价。结果显示，重组蛋白EDIII免疫鸭子血清中和抗体效价可达到1：8，而载体蛋白免疫鸭子血清和空白组鸭子血清中和效价都小于1：2。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白，其特征在于，该重组蛋白具有SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列，编码该重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种重组载体，其特征在于，包含：编码鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域蛋白的基因序列，所述鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述编码鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的空载体为pCold-TF原核表达载体。
5.一种由权利要求2所述重组载体经表达而制得的鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白。
6.一种诊断鸭坦布苏病毒病的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或5所述的鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白。
7.一种抗鸭坦布苏病毒病疫苗，其特征在于，包含权利要求1或5所述的鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白。
8.一种疫苗组合物，其特征在于，包含：与佐剂或药用载体混合的权利要求7所述的抗鸭坦布苏病毒病疫苗。
9.权利要求1或5所述的鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白在制备诊断鸭坦布苏病毒病的产品中的应用。
10.权利要求1或5所述的鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白在制备预防或治疗鸭坦布苏病毒病的疫苗中的应用。
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