CN102977194A - 一种鸭坦布苏病毒e蛋白基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鸭坦布苏病毒E蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1。本发明获得的鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗经肌肉接种20日龄鸭坦布苏病毒阴性麻鸭，接种14日后取血测DTMUV抗体，免疫组DTMUV抗体全部为阳性，有效率达到100%，而对照组未检测到抗体。结果显示制备的重组蛋白免疫原性良好，其进一步制备的鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗可以引起麻鸭的免疫应答。
Description
技术领域
本发明属于家禽基因工程疫苗技术领域，具体涉及一种鸭坦布苏病毒E蛋白基因及其应用。
背景技术
鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）是一种可引起鸭产蛋下降、生长迟缓和死亡的新发病毒。该病死亡率在5%-10%之间，是自2010年起至今危害养鸭业最严重的疾病之一。根据国家水禽产业技术体系2010年11月份的调查，该病造成的经济损失已超过50亿。目前，没有有效的措施来预防该病的发生。因此，研制一种安全有效的“鸭坦布苏病毒病”疫苗对我国养鸭业的发展具有重要意义。
研究发现，鸭坦布苏病毒编码结构蛋白(C、PrM 和E) 和非结构蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B 和NS5)。其中，E 蛋白在病毒受体结合、侵入和融合方面起到了关键的作用，是病毒的主要结构蛋白，具有较好的免疫原性，是检测该病毒特异性抗体的理想靶抗原，也成为了宿主抗感染免疫的重要保护性抗原。通过基因工程制备的E 蛋白亚单位疫苗，成本较低且蛋白质量稳定，并且可以激发机体的免疫应答。因此，筛选当前鸭坦布苏病毒流行毒株的E蛋白基因进行疫苗研发，无疑具有重要的现实意义和市场开发价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸭坦布苏病毒E蛋白基因及其应用，即一种新的鸭坦布苏病毒E蛋白基因，及其作为疫苗的应用。
本发明一个方面提供一种鸭坦布苏病毒E蛋白，所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
本发明另一个方面涉及编码上述蛋白的核苷酸，其序列为SEQ ID NO：2。
本发明再一个方面涉及鸭坦布苏病毒E蛋白在制备鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗中的应用。
本发明获得的鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗经肌肉接种20日龄鸭坦布苏病毒阴性麻鸭，接种14日后取血测DTMUV抗体，免疫组DTMUV抗体全部为阳性，有效率达到100%，而对照组未检测到抗体。结果显示制备的重组蛋白免疫原性良好，其进一步制备的鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗可以引起麻鸭的免疫应答。
具体实施方式
本发明从DTMUV的病料中分离得到了新的鸭坦布苏病毒E基因，基因表达获得重组蛋白具有很好的抗原性，可以防御新型的鸭坦布苏病毒，从而促成了本发明。
下面结合具体实施方式来进一步描述本发明，但本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的技术方案的情况下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明保护范围内。
一、鸭坦布苏病毒E基因的扩增
将临床分离的DTMUV的病料处理后接种SPF鸡胚盲传三代后，PCR扩增鸭坦布苏病毒E基因全长，引物序列如下：
E-F: 5′ AGAATTCATGTTCAGCTGTCTGGGGA′3 （EcoR I）
E-R: 5′ACTCGAGTTAATTGACATTTACTGCCAGG ′3 （Xho I）
PCR反应体系如下：5× PrimeSTARETM Buffer 10 μL；dNTPMixture (2.5 mM) 4 μL ；PrimeSTARETMHS DNA Polymerase 0.5 μL；模板0.5 μL；引物1 μL/1 μL；ddH2O 33μL。
按以下参数在PCR仪上进行反应：98 ℃预变性30 s，然后以98 ℃10 s、 55 ℃ 15 s、72 ℃ 1 min进行25个循环。
扩增产物进行测序后将E蛋白基因序列（SEQ ID NO：2）在NCBI上Blast比对，同源性最高为97%，表明扩增的样品为新的病毒株。其翻译的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
同时，对同一DTMUV的病料感染的不同SPF鸡胚，按照上述记载的条件进行扩增，扩增出的基因测序结果都一致，证明没有在扩增过程中产生碱基的错误。
将E蛋白基因的核苷酸（SEQ ID NO：2）5′端和3′端分别加上EcoR I和Xho I酶切位点，送基因公司进行全基因合成。
二、基因工程蛋白表达载体的构建与工程菌的获得
一、构建pET-28a(+)-E表达载体
1. PCR扩增E片段：
（1）设计引物
根据E基因序列利用Primer 5.0软件设计基因扩增引物，引物上下游分别引入限制性核酸内切酶EcoR I和Xho I作用位点（下划线），设计引物如下：
E-F: 5′ AGAATTCATGTTCAGCTGTCTGGGGA′ 3 （EcoR I）
E-R: 5′ACTCGAGTTAATTGACATTTACTGCCAGG ’ ′3 （Xho I）
上游引物设计在序列前加了ATG，并加了EcoR I酶切位点和一个保护碱基A；下游引物中加了终止密码子，填加Xho I酶切位点和一个保护碱基A；使用了pET-28a(+)载体上的N端的6个His氨基酸标签。
根据基因公司合成的E基因序列（SEQ ID NO：2）为模板扩增目的基因。
PCR反应体系如下：5× PrimeSTARETM Buffer 10 μL；dNTPMixture (2.5 mM) 4 μL ；PrimeSTARETMHS DNA Polymerase 0.5 μL；模板0.5 μL；引物1 μL/1 μL；ddH2O 33μL。
按以下参数在PCR仪上进行反应：98 ℃预变性30 s，然后以98 ℃10 s、 55 ℃ 15 s、72 ℃ 1 min进行25个循环。反应完毕后取5 μL反应产物，1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果。
（2）PCR产物回收
灌制可上样50 μL的1 %琼脂糖凝胶，将PCR扩增产物分别加入电泳上样孔中，指示剂迁移至适当位置时停止电泳，在365 nm紫外光下切下含目的片段的凝胶，移入1.5 mL EP管中，称取重量后，参照天根生物技术公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（DP209）说明书进行。
2、E基因片段连接到pET-28a(+)载体上并转化DH5α感受态细胞
（1）E基因与pET-28a(+)载体质粒分别利用EcoR I和Xho I酶进行双酶切。酶切体系如下：
EcoR I 2μL ，Xho I 2μL，10×H Buffer 5μL，DNA模板10μL，加水至50μL。
（2）酶切后目的片段的回收：双酶切产物通过1%琼脂糖回收胶，将上述酶切反应体系中各加入5 μL 10×Loading buffer，80 V电泳待指示剂迁移至距凝胶前沿1.5 cm时停止电泳，分别切割符合理论值的目的片段的琼脂糖凝胶，使用天根生物技术公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（DP209）回收所需片段。
（3）连接反应：根据载体片段与插入片段摩尔数比为1: 2～10的原则，设计连接体系如下：pET-28a(+)酶切后片段 1 μL ；酶切后E基因 5 μL；T4 DNA ligase 1 μL；10× ligation buffer 1 μL；dd H2O 2 μL，16℃连接过夜。
（4）连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞：取E.coli DH5α感受态菌液各100 μL，加入连接反应产物10 μL，用手指轻轻弹几下后放冰水浴30 min。42 ℃水浴热刺激90 s，迅速放置冰水浴1~2 min，每管各加300 μL LB培养液（无抗性），37 ℃摇床培养45min。混匀上述菌液，取适量菌液（200 μL）均匀涂布于含Kan+ 抗性的LB平板，待菌液完全被培养基吸收后倒置平皿，37 ℃孵箱培养过夜。
（5）阳性转化子的筛选与鉴定
Kan+ LB平板有菌落生长，挑取分隔良好的菌落分别接种于LB液体培养基（Kan+抗性）中，37 ℃摇床培养过夜。吸取1 μL菌液，作为菌液PCR模板鉴定阳性克隆。
阳性克隆的测序由华大基因公司完成，将测序后的序列与合成E基因序列进行核酸序列的Blast分析，建完成质粒命名为pET-28a(+)-E。
3、 pET-28a(+)-E质粒转化E.coli BL21(DE3) 感受态细胞
（1）pET-28a(+)-E质粒的提取，采用质粒抽提试剂盒（Takara公司），参照说明书操作。
（2）pET-28a(+)-E质粒转化BL21(DE3) 感受态细胞中（步骤同转化DH5α感受态细胞）。
（3）挑5个单菌落在Kan+ LB液体培养基中培养，通过全菌PCR鉴定阳性克隆。挑一株阳性克隆命名为BL21-pET-28a(+)-E菌株。
三、工程菌BL21-pET-28a(+)-E表达目的蛋白E-His
1、IPTG诱导BL21-pET-28a(+)-E菌株表达
重组工程菌BL21-pET-28a(+)-E经IPTG诱导后，进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮兰染色观察目的蛋白表达，并通过Western 印迹鉴定为融合His标签的E蛋白。
收集诱导表达的重组菌按照1:9（w/v）的比例混匀于PBS缓冲液中，于超声波细胞破碎仪冰浴超声破菌至菌液不再粘稠，将裂解液进行差速离心：700g离心20min，弃沉淀，上清离心12000g离心20min，分别收集超声上清和沉淀，用同体积的缓冲液重悬沉淀，制备样品进行SDS-PAGE和Western印迹分析。结果表明目的蛋白的表达形式主要是包涵体。
2、目的蛋白的纯化
（1）包涵体的洗涤
沉淀分别以包涵体洗涤液І重悬，4℃搅拌洗涤40min。12000rpm离心20min，弃上清，重复洗涤一次。上述沉淀以包涵体洗涤液Ⅱ重悬，4℃搅拌20min。12000rpm离心20min，弃上清，重复洗涤一次。
（2）包涵体的溶解
上述沉淀与包涵体溶解液以1:9（w/v）的比例重悬，4℃搅拌溶解过夜。12000g离心20min，上清即为重组蛋白包涵体溶液。
（3）目的蛋白的纯化
采用镍离子亲和层析柱，柱床体积（CV）为1 mL。去离子水流冲上样A、B管及亲和层析柱，至基线平稳；分别以缓冲液A1、缓冲液B1流冲上样A、B管道，然后以缓冲液A1平衡亲和层析柱至基线平稳。以超声上清上样，亲和层析缓冲液A1冲洗亲和层析柱，收集穿过峰；待穿过峰消失回复至基线，以亲和层析缓冲液B1梯度洗脱解离，收集洗脱峰，即为纯化后蛋白样品。
（4）蛋白稀释复性
将1mL纯化后的蛋白（含30%甘油），缓慢滴入100mL复性液中（10MmTrisCl，0.5M NaCl，pH8.0；30 %甘油；1 mM GSH；0.1 mM GSSG；0.5 M Arg），4 ℃孵育48 h，4 ℃，12000 g离心30 min，即为复性好的复性蛋白稀释液。
（5）蛋白浓度测定
利用BSA试剂盒测定，根据说明书操作。
结论：构建含有pET-28a(+)-E表达载体的BL21(DE3)工程菌，获得纯化后的融合His标签的E蛋白。
四、多克隆血清的制备
（1）动物选择：新西兰大耳白兔两只。
（2）接种途径：皮下注射。
（3）接种部位：脊背，左右脚足垫，左右腹股沟。
（4）佐剂使用：弗氏完全佐剂（CFA），弗氏不完全佐剂（IFA）为Sigma公司产品。
（5）接种策略：
1）每只大耳白兔抗原免疫用量1.0 mg。取2.5 mg E蛋白加弗氏完全佐剂2.5 mL，顺时针方向研磨直至形成“油包水”样乳剂。
2）固定大耳白兔，75 %乙醇消毒，分别在脊背，左右脚足垫，左右腹股沟皮下注射乳化液，注射量2 mL/只。
3）每隔一周加强免疫一次，其中第二、三次加弗氏不完全佐剂，第四次注射抗原溶液。
4）第五周起于兔耳缘静脉取血，用琼脂糖双扩法检测特异性抗体的效价。
5）抗血清分离：心脏放血，室温下待血清完全分离，离心后分装血清，-70℃冻存备用。
双向免疫扩散结果显示，在抗E蛋白抗血清稀释度为1:32时，出现明显沉淀线，兔抗E蛋白多克隆抗体效价分别为1:32。
结论：E蛋白可以使新西兰大耳白兔产生多克隆血清。
Western 印迹检测血清特异性：
选取BL21(DE3)菌为阴性对照，同时以纯化后的E-His为阳性对照进行SDS-PAGE，电转移至NC膜上，实施例3中制备的兔抗血清以1:5000稀释为一抗，1:5000稀释的HRP标记羊抗兔IgG为二抗，检测兔抗E-His血清的免疫反应性。
结果表明：纯化的E-His蛋白可以与兔抗E-His血清能够发生明显的免疫反应，而BL21(DE3)在相应分子量位置未见反应条带出现，表明具有良好免疫反应性。
五、重组蛋白制备的鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗的动物试验
将制备的鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗经肌肉接种20日龄DTMUV阴性麻鸭30只，另取10只作为对照。接种14日后取血测DTMUV抗体，免疫组DTMUV抗体全部为阳性，有效率达到100%，对照组未检测到抗体；结果显示制备的重组蛋白免疫原性良好。用该重组蛋白进一步制备的鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗可以引起幼鸭的免疫应答，能够有效的预防鸭坦布苏病毒病。
Claims (6)
1.一种鸭坦布苏病毒E蛋白，其特征在于，所述的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
2.一种核苷酸，所述的核苷酸用于编码权利要求1所述的蛋白。
3.如权利要求2所述的核苷酸，其序列为SEQ ID NO：2。
4.权利要求1所述的鸭坦布苏病毒E蛋白在制备基因工程亚单位疫苗中的应用。
5.一种基因工程亚单位疫苗，其特征在于，是用权利要求1所述的鸭坦布苏病毒E蛋白作为抗原制备的。
6.权利要求5所述的疫苗用于防治鸭坦布苏病毒病。
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