CN101900731B

CN101900731B - 一种区别检测猪瘟疫苗免疫与野毒感染抗体的elisa试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN101900731B
Application number: CN 201010245115
Authority: CN
Inventors: 戴志红; 王在时; 关孚时; 蒋卉; 李翠; 赵耘; 秦玉明
Original assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Current assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Priority date: 2010-08-05
Filing date: 2010-08-05
Publication date: 2012-12-26
Anticipated expiration: 2030-08-05
Also published as: CN101900731A

Abstract

本发明涉及一种区别检测猪瘟疫苗免疫与野毒感染抗体的ELISA试剂盒及其制备方法。本发明通过表达、纯化猪瘟病毒非结构蛋白NS3，包被固相载体，再与其他配套试剂组装成间接ELISA试剂盒或阻断ELISA试剂盒。本发明具有能区别检测猪瘟疫苗免疫与野毒感染产生的不同抗体的特点。应用本发明能区别诊断猪瘟疫苗免疫与野毒感染。

Description

一种区别检测猪瘟疫苗免疫与野毒感染抗体的ELISA试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及猪瘟抗体的区别检测方法，属于兽用生物制品技术领域。

背景技术

猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一种高度接触性、致死性的猪传染病，在世界上很多国家和地区均有发生，给畜牧业生产带来了严重的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将猪瘟列为法定通报性疫病，我国将其划为一类动物传染病，并纳入重大动物疫病防控计划。

世界上主要有3种效果较好的猪瘟活疫苗可以用于猪瘟防制，即日本的GPE株、法国的Thiverval株和中国的兔化弱毒株(C株)，其中C株应用最为广范并且为世界上许多国家猪瘟的控制做出了重要贡献。目前，包括我国在内的很多国家和地区仍以猪瘟活疫苗免疫作为防制猪瘟的主要方法，但现有检测技术无法区别疫苗免疫与自然感染产生的抗体，导致免疫猪群的猪瘟净化非常困难。区别检测技术的缺乏在很大程度上制约了猪瘟活疫苗的实际应用效果和应用范围：一方面，采用免疫政策的国家和地区，猪瘟净化非常困难；另一方面，某些发达国家为了净化猪瘟，采取了非免疫政策，一旦检测到猪瘟抗体存在即扑杀猪群，其成本很高、风险很大。因此，开发疫苗免疫与自然感染抗体区别检测试剂盒就显得十分必要。

CSFV只有一个血清型，因此常规血清学方法无论是检测抗原还是检测抗体均无法区分CSFV疫苗株与野毒株。CSFV在遗传上可以分为3个基因群10个基因亚群，但已有研究表明，疫苗株与野毒株之间的特征性基因序列差异主要在于疫苗株的3’-UTR存在一个富含T的序列插入，并且由于该序列的插入影响了病毒复制速度而导致了疫苗株毒力减弱。由此可见，CSFV疫苗株与野毒株之间并不存在的明显的或有规律的抗原表位差异，因此很难根据抗原表位差异制备单克隆抗体建立ELISA抗体区别检测试剂盒，国内外很多学者进行过很多此类探索，但至今尚未出现真正的成功应用。因此，CSFV疫苗株与野毒株区别诊断的相关研究逐渐转移到了病毒核酸检测方面，国内外学者利用两者之间特征性的序列差异研究出了大量的RT-PCR和荧光PCR区别检测技术。但CSFV病毒核酸区别检测技术也存在着很大不足：一方面由于CSFV在猪血液中病毒量较低，往往导致血液病毒核酸检出率较低；扁桃体病毒含量虽高，但需要专门器械并且采集困难；另一方面RT-PCR和荧光PCR检测需专门的设备、环境和人员，检测成本较高，很难大面积推广应用；并且实验结果也易受交叉污染、核酸提取效率、RNA反转录效率等多个因素影响，准确性很难保证。为此，仍有必要开辟其他途径研究更方便快捷的区别检测方法。

CSFV基因组RNA约为1.2kb，编码N^pro、C、E^rns(E0)、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B等12种蛋白，其中C、E^rns(E0)、E1、E2为结构蛋白，其余均为非结构蛋白。在CSFV基因编码的12种蛋白中，只有E^rns(E0)、E2和NS3能诱导机体产生特异性抗体。研究表明，CSFV疫苗株(C株)和野毒株在猪体内的复制水平存在较大差异：CSFV疫苗株接种后，病毒复制仅局限于淋巴样组织，并只能存在2～3周；而CSFV野毒株感染3d后即可从扁桃体检测到病毒增殖，7d后可在血液和大多数组织中存在，直至动物死亡。由此可以推断，CSFV疫苗株和野毒株在猪体内的非结构蛋白表达水平也必然存在差别(因为非结构蛋白仅在病毒复制过程中产生)，其刺激机体产生的抗体水平也理应存在相应差异。因此，可以通过检测CSFV非结构蛋白抗体水平的差异来区分疫苗免疫与自然感染。而NS3正是CSFV高度保守的非结构蛋白，并且能稳定诱导抗体产生，因此可以作为区分疫苗免疫与自然感染的血清学标记。

据此，可以通过研制CSFV非结构蛋白NS3抗体检测试剂盒，检测CSFV疫苗株与野毒株产生的NS3抗体差异，达到区别检测的目的。

发明内容

本发明的目的是克服已有CSFV抗体检测技术的不足，提供一种可以区别检测猪瘟疫苗免疫抗体与猪瘟野毒抗体的ELISA试剂盒。利用本发明可以区别诊断猪瘟疫苗免疫与野毒感染，可以极大地提高已有猪瘟活疫苗的应用效果和应用范围，可以在世界范围内广泛免疫已有的、经国内外实践检验非常优秀的猪瘟活疫苗，又不影响免疫猪群的猪瘟净化，既能使发展中国家加快猪瘟净化进程，又能使发达国家猪瘟流行风险和猪瘟控制成本大大降低。

本发明的技术方案是建立在：通过检测血清中猪瘟病毒非结构蛋白NS3抗体水平高低达到区别检测的目的：NS3抗体水平高于一定程度时判定为猪瘟野毒感染；低于一定程度时判定为既无猪瘟野毒感染也未免疫疫苗(或免疫疫苗很长时间)；NS3抗体水平介于两者之间时判定为疫苗免疫(或处于野毒感染初期)。

本发明包括以下技术方案：

一、NS3表达、纯化

将猪瘟病毒非结构蛋白基因NS3使用序列1、序列2和序列3、序列4扩增，并分别在原核和真核表达系统中表达，再将所表达的蛋白纯化而获得，两种表达和纯化的产物其效力一样。

1.NS3原核表达、纯化

(1)病毒RNA提取：RNA提取试剂盒提取猪瘟兔化弱毒的RNA；

(2)引物设计与合成：根据GenBank已发表的NS3基因序列设计一对引物，并在引物两端添加酶切位点；

(3)NS3基因片段扩增、回收：以提取的RNA为模板，用步骤(2)的引物做RT-PCR扩增；用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段；

(4)目的基因与表达载体连接：将表达载体与目的片段混合后，加入连接酶连接；

(5)连接产物转化感受态细胞：将连接产物在无菌条件下加入到感受态细胞中，混匀，转移至LB培养液培养，取少量涂布于选择性培养基上培养12～16h，挑取正确菌落接种培养液继续培养；

(6)重组表达载体的鉴定：提取质粒，进行双酶切鉴定，将酶切片段与预期相符的阳性克隆送至生物公司测序，以确定插入位置、方向、大小、读码框及核苷酸序列的正确性；

(7)NS3基因表达：将含有正确表达载体的大肠杆菌接种于培养液中诱导表达；

(8)表达蛋白的鉴定：用SDS-PAGE和Western blot分析表达产物是否正确；

(9)重组蛋白的大量诱导表达：将含有正确表达载体的大肠杆菌接种于大量培养液中诱导表达，培养结束后离心收集菌液，超声波裂解菌液，加入溶菌酶，获得抽提液即含有大量表达产物；

(10)NS3纯化：用镍柱纯化法，按照商品化试剂盒说明书进行。

2.NS3真核表达、纯化

(1)病毒RNA提取：RNA提取试剂盒提取猪瘟兔化弱毒的RNA；

(3)NS3基因片段扩增、回收：以提取的RNA为模板，用设计的引物做RT-PCR扩增；用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段；

(4)目的基因与转座载体连接：将转座质粒酶切回收后与NS3基因片段混合后，加入连接酶连接；

(6)重组转座载体的鉴定：提取质粒，进行双酶切鉴定，将酶切片段与预期相符的阳性克隆送至生物公司测序，以确定插入位置、方向的正确性；

(7)重组转座载体的转座：将鉴定为阳性的重组转座质粒转化至感受态细胞中，在选择性培养基上培养12～16h，挑取正确菌落接种培养液继续培养；

(8)重组真核表达质粒的PCR鉴定：提取重组真核表达质粒，以其为模板用步骤(2)的引物进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳检测，应出现与NS3基因大小相符的目标条带；

(9)重组真核表达质粒转染昆虫细胞：将提取纯化的重组真核表达质粒与脂质体孵育后加入准备好的昆虫细胞上，吸附培养后，加入培养基继续培养，直至细胞出现病变，即获得重组病毒；

(10)重组蛋白的表达：将重组病毒接种昆虫细胞，收集培养物上清即可获得重组蛋白；

(11)表达蛋白的鉴定：用SDS-PAGE和Western blot分析表达产物是否正确；

(12)重组蛋白的大量表达：将鉴定正确的重组病毒大量培养，收集培养液，即含有大量表达产物。

(13)NS3纯化：先透析，再通过CSFV抗体-CNBr Sepharose 4B亲和层析柱层析，最后洗脱结合的特异蛋白，即获得纯化的NS3蛋白。

二、NS3抗体检测阴、阳性对照血清制备

1.猪瘟疫苗免疫NS3抗体检测阳性对照血清

将健康非免疫猪免疫猪瘟兔化弱毒疫苗(2头份)后每周采血分离血清，共采集10次，合并混匀后作为猪瘟疫苗免疫NS3抗体检测阳性对照血清。

2.猪瘟野毒感染NS3抗体检测阳性对照血清

将健康非免疫猪接种低毒力(CVCC AV63)猪瘟病毒(2×10⁴TCID₅₀)和中等毒力(CVCCAV64)猪瘟病毒(2×10⁴TCID₅₀)(均由国家兽医微生物菌种中心提供)后每周采血分离血清，共采集10次，合并混匀后作为猪瘟野毒感染NS3抗体检测阳性对照血清。

3.猪瘟疫苗免疫和野毒感染NS3抗体检测阴性对照血清

将健康非免疫猪采血分离血清作为猪瘟疫苗免疫和野毒感染NS3抗体检测阴性对照血清。

三、试剂配制

1.洗涤液：含有体积百分含量为0.05％的Tween-20的PBS缓冲液(PBS缓冲液为含5.54g/L Na₂HPO₄·12H₂O，0.39g/L NaH₂PO₄·2H₂O，8.5g/L NaCl，pH 7.2的溶液)；

2.终止液：1mol/L盐酸溶液；

3.底物显色液：显色液A：含有1mg/ml OPD pH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，显色液B：过氧化氢；临用前将显色液A与显色液B按体积比为5000∶9的比例，混合充分后使用；

4.封闭液：含质量百分含量1％BSA的PBS溶液。

四、试剂盒制备

(一)间接ELISA法

1.NS3包被：将纯化的NS3蛋白与包被缓冲液(0.1M，pH 9.6碳酸氢钠缓冲液)配成合适浓度，包被酶标板过夜。

2.酶标二抗制备：将按常规方法制备、纯化的猪IgG、IgM反复免疫家兔(或其他动物)，采血分离血清，经按常规方法纯化后获得兔(或其他动物)抗猪IgG、IgM的第二抗体(简称“二抗”)，再将二抗标记辣根过氧化物酶，获得酶标二抗。

3.试剂盒组装：将NS3蛋白包被的酶标板、酶标二抗、NS3抗体检测阴阳性对照血清及封闭液、洗涤液、底物显色液、终止液等，组装成试剂盒；

4.使用方法：在酶标板每孔中加入50μl封闭液，孵育30min，弃去封闭液；在6孔中分别加入NS3抗体检测阴阳性对照血清(每种对照重复2孔)，在剩余检测孔中加入50μl待检血清(重复2孔)，孵育30min后，用洗涤液洗涤3次；加入酶标二抗，孵育30min后，用洗涤液洗涤3次；加入显色液，孵育10min后，用终止液终止；在10min内用酶联读数仪以450nm波长测定每孔吸光度(OD值)；判定结果。

5.判定标准：猪瘟疫苗免疫和野毒感染NS3抗体检测阴性对照血清检测OD≤0.1，且0.2≤猪瘟疫苗免疫NS3抗体检测阳性对照血清检测OD≤0.3，且猪瘟野毒感染NS3抗体检测阳性对照血清检测OD≥0.4，则试验成立，数据有效；

6.结果分析：

——若检测孔OD≤0.1，则判定被检样品猪瘟疫苗免疫抗体和野毒感染抗体均为阴性；

——若0.2≤检测孔OD≤0.3，则判定被检样品猪瘟疫苗免疫抗体阳性；

——若检测孔OD≥0.4，则判定被检样品猪瘟野毒感染抗体阳性；

——其他情况均为可疑，需间隔2周重新采样检测。

(二)阻断ELISA法

1.NS3包被：将纯化的NS3蛋白与包被缓冲液(0.1M，pH9.6碳酸氢钠缓冲液)配成合适浓度，包被酶标板过夜。

2.酶标抗体的制备：将表达、纯化的非结构蛋白NS3免疫家兔或其他动物，采血分离血清，纯化IgG，获得NS3多克隆抗体(简称“多抗”)，再标记辣根过氧化物酶，获得NS3酶标多抗；

或将表达、纯化的非结构蛋白NS3免疫小鼠，采集脾脏淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，制备单克隆抗体，再纯化IgG，获得抗结构蛋白和非结构蛋白的单克隆抗体(简称“单抗”)，再标记辣根过氧化物酶，获得NS3酶标单抗。

NS3酶标多抗和NS3酶标单抗其功效相同。

3.试剂盒组装：将NS3蛋白包被的酶标板、NS3酶标多抗或NS3酶标单抗、NS3抗体检测阴阳性对照血清及封闭液、洗涤液、底物显色液、终止液等，组装成试剂盒。

4.使用方法：在酶标板每孔中加入50μl封闭液，孵育30min，弃去封闭液；在6孔中分别加入NS3抗体检测阴阳性对照血清(每种对照重复2孔)，在剩余检测孔中加入50μl待检血清(重复2孔)，孵育90min后，用洗涤液洗涤3次；加入NS3酶标多抗或NS3酶标单抗，孵育30min后，用洗涤液洗涤3次；加入显色液，孵育10min后，用终止液终止；在10min内用酶联读数仪以450nm波长测定每孔吸光度(OD值)；计算阻断率，判定结果。

5.判定标准：猪瘟疫苗免疫和野毒感染NS3抗体检测阴性对照血清检测阻断率≤0.2，且0.3≤猪瘟疫苗免疫NS3抗体检测阳性对照血清检测阻断率≤0.5，且猪瘟野毒感染NS3抗体检测阳性对照血清检测阻断率≥0.6，则试验成立，数据有效；

6.结果判断：

——若检测孔阻断率≤0.2，则判定被检样品猪瘟疫苗免疫抗体和野毒感染抗体均为阴性；

——若0.2≤检测孔阻断率≤0.5，则判定被检样品猪瘟疫苗免疫抗体阳性；

——若检测孔OD≥0.6，则判定被检样品猪瘟野毒感染抗体阳性；

——其他情况均为可疑，需间隔2周重新采样检测。

本发明的积极意义

本发明通过本发明通过表达、纯化CSFV非结构蛋白NS3，包被固相载体，再与其他配套试剂一起组装成间接ELISA试剂盒或阻断ELISA试剂盒，可以区别检测猪瘟疫苗免疫抗体与野毒感染抗体。与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)相对于已有的猪瘟抗体检测技术，本发明可以区别检测猪瘟疫苗免疫抗体与野毒感染抗体；

(2)利用本发明，可以实现免疫猪瘟疫苗不干扰猪瘟疫情监测，因此有了本技术，可以广泛推行猪瘟疫苗免疫，有利于猪瘟防控和净化。

附图说明

图1NS3基因RT-PCR产物电泳图图中所示：M-DL2000；1-接毒细胞RT-PCR产物(箭头指目标条带)；2-未接毒细胞RT-PCR产物。

图2原核表达载体pET-NS3-C的双酶切鉴定图中所示：M-DL2000；1-pET-NS3-C双酶切产物(箭头指目标条带)。

图3重组蛋白原核表达产物的SDS-PAGE检测图中所示：M-蛋白低分子量marker；1-未诱导的细菌裂解产物；2-诱导的细菌裂解产物(箭头指目标条带)。

图4重组蛋白原核表达产物的Western blot分析图中所示：M-蛋白低分子量marker；1-未诱导的细菌裂解产物；2.诱导的细菌裂解产物(箭头指目标条带)。

图5NS3基因RT-PCR产物电泳图图中所示：M-DL2000；1-接毒细胞RT-PCR产物(箭头指目标条带)；2-未接毒细胞RT-PCR产物。

图6重组转座载体pFastBacHT A-NS3-C的双酶切鉴定图中所示：M-DL2000；1-pFastBacHT A-NS3-C双酶切产物(箭头指目标条带)。

图7重组蛋白真核表达产物的SDS-PAGE检测图中所示：M-蛋白低分子量marker；1-普通Sf5培养液；2-接种重组病毒的Sf5培养液(箭头指目标条带)。

图8重组蛋白的Western blot分析图中所示：M-蛋白低分子量marker；1-未诱导的细菌裂解产物；2.诱导的细菌裂解产物(箭头指目标条带)。

实施例

实施例1 NS3的原核表达与纯化

1.病毒RNA提取：用TRIzol Reagent试剂盒(购自Invitrogen公司)提取猪瘟兔化弱毒细胞培养液的总RNA；

2.引物设计与合成：根据GenBank已发表的NS3基因序列设计一对引物，并在引物两端分别添加Sac I和Xho I酶切位点，可扩增开放阅读框5142～7191bp间2049bp的基因片段。引物(序列1和序列2)序列分别为：

P1：5’GAG CTC GGG CCT GCC GTT TGC AA-3’；

P2：5’CTC GAG CTA GAC CAA CTA CCT GTT TTA GTG CTC TG-3’；

下划线部分为引入的酶切位点，引物由Invitrogen公司合成。

3.NS3基因片段扩增、回收

(1)RT-PCR扩增：以提取的RNA为模板，用步骤2中的引物做RT-PCR扩增。RT反应体系为：总RNA提取液10μL、P2引物(20pmol/μL)1μL、5×RT buffer 4μL、dNTP(10mmol/L)2μL、RNA酶抑制剂(20U/μL)2μL、SSIII反转录酶(200U/μL)1μL。PCR反应体系为：cDNA 2μL、P1引物(20pmol/μL)1μL、P2引物(20pmol/μL)1μL、10×buffer 5μL、dNTP(10mmol/L)4μL、Taq DNA酶(5U/μL)1μL、ddH₂O 36μL。0.8％琼脂糖凝胶电泳显示，成功扩增出了约2kb的特异条带，与预期大小相符(图1)。

(2)DNA目的回收：将PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切下目的条带，按照DNA片段凝胶回收试剂盒(购自Invitrogen公司)说明书进行回收。

4.目的基因与表达载体连接：将回收产物和原核表达载体pET-28a用Sac I和Xho I酶切回收、纯化，以T4DNA连接酶16℃连接过夜。

5.连接产物转化感受态细胞：将连接产物在无菌条件下加入到感受态细胞中，混匀，冰浴30min，42℃水浴90s，转移至LB培养液(不含氨苄青霉素)37℃振荡(250r/min)培养45min。将培养物离心，弃上清，取少量涂布于含氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB琼脂平板上37℃培养12～16h，挑取4～5个白色菌落分别培养，等待鉴定。

6.重组表达载体的鉴定：提取质粒，用Sac I和HindIII双酶切，结果得了约为600bp的DNA片段，与预期的大小576bp一致(图2)。将酶切片段与预期相符的阳性克隆送至Invitrogen公司测序，结果插入的位置、方向、大小、读码框及核苷酸序列均正确，将该重组质粒命名为pET-NS3-C。

7.NS3基因表达：将含有pET-NS3-C重组质粒的大肠杆菌接种于含IPTG的2×YT(Amp+)培养液中培养，即可表达NS3蛋白；

8.表达蛋白的鉴定

(1)SDS-PAGE鉴定：将诱导表达的菌液用超声波裂后，加入溶菌酶，进行SDS-PAGE电泳；电泳结束后，经染色和脱色后发现，大约在43ku位置，诱导表达的重组菌比未经诱重组菌明显多出1条表达条带(图3)，其分子质量与融合蛋白理论值大小相符，说明表达成功。

(2)Western blot分析：取SDS-PAGE电泳后的凝胶，直接用BIO-LAB转印装置将其转印于NC膜上(200mA，3h)，转印结束后，按常规方法进行Western blot反应。用猪瘟阳性血清(1∶50)作为一抗，用猪瘟阴性血清作阴性对照；用辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG(1∶100)作为二抗；最后用DAB显色。结果表明经诱导的重组质粒转化菌，在约43ku处出现1条明显的特异条带，而阴性对照无此特异性反应(图4)，说明该重组蛋白可被猪瘟阳性血清中的NS3抗体识别，具有良好的特异性和反应原性。

9.重组蛋白的大量诱导表达：将含有正确表达载体的大肠杆菌接种于大量含IPTG的2×YT(Amp+)培养液中诱导表达，培养结束后离心收集菌液，超声波裂解菌液，加入溶菌酶，获得抽提液即含有大量表达产物；

10.NS3纯化：用商品化镍柱(购于Sigma公司)纯化，按照说明书进行。

实施例2 NS3的真核表达与纯化

2.引物设计与合成：根据GenBank已发表的NS3基因序列设计一对引物，并在引物两端分别添加EcoR I和Xho I酶切位点，可扩增开放阅读框5142～7191bp间2049bp的基因片段。引物(序列3和序列4)序列分别为：

P3：5’-GAA TTC GGG CCT GCC GTT TGC AAG-3’；

P4：5’-CTC GAG CTA GAC CAA CTA CCT GTT TTA GTG CTC-3’；

下划线部分为引入的酶切位点，引物由Invitrogen公司合成。

3.NS3基因片段扩增、回收

(1)RT-PCR扩增：以提取的RNA为模板，用步骤2中的引物做RT-PCR扩增。RT反应体系为：总RNA提取液10μL、P2引物(20pmol/μL)1μL、5×RT buffer 4μL、dNTP(10mmol/L)2μL、RNA酶抑制剂(20U/μL)2μL、SSIII反转录酶(200U/μL)1μL。PCR反应体系为：cDNA2μL、P1引物(20pmol/μL)1μL、P2引物(20pmol/μL)1μL、10×buffer 5μL、dNTP(10mmol/L)4μL、Taq DNA酶(5U/μL)1μL、ddH₂O 36μL。0.8％琼脂糖凝胶电泳显示，成功扩增出了约2kb的特异条带，与预期大小相符(图5)。

4.目的基因与转座载体连接：将转座质粒pFastBacHT A和NS3基因扩增片段用EcoRI和Xho I酶切后分别回收、纯化，以T4DNA连接酶16℃连接过夜。

5.连接产物转化感受态细胞：将连接产物回收、纯化后在无菌条件下加入到感受态细胞DH5α中，混匀，冰浴30min，42℃水浴90s，转移至LB培养液(不含氨苄青霉素)37℃振荡(250r/min)培养60min。将培养物离心，弃上清，取少量涂布于含氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB琼脂平板上37℃培养16～18h，挑取4～5个白色菌落分别培养，等待鉴定。

6.重组转座载体的鉴定：提取质粒，用EcoR I和HindIII双酶切，结果得了约为600bp的DNA片段，与预期的大小576bp一致(图6)。将酶切片段与预期相符的阳性克隆送至Invitrogen公司测序，结果插入的位置、方向、大小、读码框及核苷酸序列均正确，将该重组质粒命名为pFastBacHT A-NS3-C。

7.重组转座载体的转座：将鉴定为阳性的重组转座质粒pFastBacHT A-NS3-C转化至感受态细胞DH10Bae中，冰浴30min，42℃水浴60s，转移至SOC培养液37℃振荡(225r/min)培养4h。将培养物离心，弃上清，取少量涂布于含氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB琼脂平板上37℃培养36～48h，挑取4～5个白色菌落分别培养12h，等待鉴定。

8.重组真核表达质粒的PCR鉴定：提取重组真核表达质粒Bacmid-NS3-C，以其为模板用步骤2中的引物进行PCR扩增。PCR反应体系为：重组真核表达质粒2μL、P1引物(20pmol/μL)1μL、P2引物(20pmol/μL)1μL、10×buffer 5μL、dNTP(10mmol/L)4μL、Taq DNA酶(5U/μL)1μL、ddH₂O 36μL。0.8％琼脂糖凝胶电泳显示，成功扩增出了约2kb的特异条带，与预期大小相符(同图5)。

9.重组真核表达质粒Bacmid-NS3-C转染昆虫细胞：将提取纯化的重组真核表达质粒Bacmid-NS3-C与脂质体轻轻混匀，室温孵育30min后，加入无血清HyQ-CCM3培养基(购于Gibco公司)，再加入长有昆虫细胞Sf5的6孔细胞培养板上(预先用无血清HyQ-CCM3培养基洗涤3次)，27℃吸附培养5h，吸弃DNA-脂质体复合物，加入HyQ-CCM3培养基生长液于27℃继续培养，直至细胞出现病变，即获得重组病毒；

10.重组蛋白的表达：将重组病毒接种昆虫细胞Sf5，27℃培养7d，收集培养物上清即含重组蛋白NS3；

11.表达蛋白的鉴定

(1)SDS-PAGE鉴定：将诱导表达的菌液用超声波裂后，加入溶菌酶，进行SDS-PAGE电泳；电泳结束后，经染色和脱色后发现，大约在43ku位置，诱导表达的重组菌比未经诱重组菌明显多出1条表达条带(图7)，其分子质量与融合蛋白理论值大小相符，说明表达成功。

(2)Western blot分析：取SDS-PAGE电泳后的凝胶，直接用BIO-LAB转印装置将其转印于NC膜上(200mA，3h)，转印结束后，按常规方法进行Western blot反应。用猪瘟阳性血清(1∶50)作为一抗，用猪瘟阴性血清作阴性对照；用辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG(1∶100)作为二抗；最后用DAB显色。结果表明经诱导的重组质粒转化菌，在约43ku处出现1条明显的特异条带，而阴性对照无此特异性反应(图8)，说明该重组蛋白可被猪瘟阳性血清中的NS3抗体识别，具有良好的特异性和反应原性。

(12)重组蛋白的大量表达：将鉴定正确的重组病毒接种Sf5细胞大量培养，收集培养液，即含有大量表达产物。

(13)NS3纯化：收集细胞培养物上清，先用透析袋透析，再在4℃以1ml/min的流速通过CSFV抗体-CNBr Sepharose 4B亲和层析柱层析(用中国兽医药品监察所提供的CSFV阳性血清与商品化的Sepharose 4B亲和层析柱制备而成，按照说明书进行)，用50～100倍柱体积的0.01M PBS(pH 7.2)洗去杂蛋白，再用0.01M PBS(pH 4.5)洗柱一次，最后用洗脱液(0.01M PB，pH 3.0)洗脱结合的特异蛋白，将洗脱液用透析袋透析，即获得纯化的NS3蛋白。

实施例3 NS3抗体检测阴、阳性对照血清制备及试剂配制

1.NS3抗体检测阴、阳性对照血清制备

(1)猪瘟疫苗免疫NS3抗体检测阳性对照血清：将健康非免疫猪免疫猪瘟兔化弱毒疫苗后每周采血分离血清，共采集10次，合并混匀后作为猪瘟疫苗免疫NS3抗体检测阳性对照血清。

(2)猪瘟野毒感染NS3抗体检测阳性对照血清：将健康非免疫猪接种低毒力和中等毒力猪瘟病毒后每周采血分离血清，共采集10次，合并混匀后作为猪瘟野毒感染NS3抗体检测阳性对照血清。

(3)猪瘟疫苗免疫和野毒感染NS3抗体检测阴性对照血清：将健康非免疫猪采血分离血清作为猪瘟疫苗免疫和野毒感染NS3抗体检测阴性对照血清。

2.试剂配制

(1)洗涤液：含有体积百分含量为0.05％的Tween-20的PBS缓冲液(PBS缓冲液为含5.54g/L Na₂HPO₄·12H₂O，0.39g/L NaH₂PO₄·2H₂O，8.5g/L NaCl，pH 7.2的溶液)；

(2)终止液：1mol/L盐酸溶液；

(3)底物显色液：显色液A：含有1mg/ml OPD pH 5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，显色液B：过氧化氢；临用前将显色液A与显色液B按体积比为5000∶9的比例，混合充分后使用；

(4)封闭液：含质量百分含量1％BSA的PBS溶液。

实施例4 间接ELISA法试剂盒制备

1.NS3包被

将纯化的NS3蛋白与包被缓冲液(0.1M，pH9.6碳酸氢钠缓冲液)配成1μg/ml，在4℃包被酶标板过夜。

2.酶标二抗制备

将纯化的猪IgG、IgM反复免疫家兔，采血分离血清，纯化兔IgG，获得抗猪IgG、IgM的第二抗体(简称“二抗”)，再将二抗标记辣根过氧化物酶，获得酶标二抗。

3.试剂盒组装

将NS3蛋白包被的酶标板、酶标二抗、NS3抗体检测阴阳性对照血清及封闭液、洗涤液、底物显色液、终止液等，组装成试剂盒。

4.使用方法

在酶标板每孔中加入50μl封闭液，孵育30min，弃去封闭液；在6孔中分别加入NS3抗体检测阴阳性对照血清(每种对照重复2孔)各50μl，在剩余检测孔中加入50μl待检血清(重复2孔)，孵育30min后，用洗涤液洗涤3次；加入酶标二抗，孵育30min后，用洗涤液洗涤3次；加入显色液，孵育10min后，用终止液终止；在10min内用酶联读数仪以450nm波长测定每孔吸光度(OD值)；判定结果。

5.判定标准

猪瘟疫苗免疫和野毒感染NS3抗体检测阴性对照血清检测OD≤0.1，且0.2≤猪瘟疫苗免疫NS3抗体检测阳性对照血清检测OD≤0.3，且猪瘟野毒感染NS3抗体检测阳性对照血清检测OD≥0.4，则试验成立，数据有效；

6.结果分析

——其他情况均为可疑，需间隔2周重新采样检测。

实施例5 阻断ELISA法试剂盒制备

1.NS3包被

2.酶标抗体的制备

将表达、纯化的非结构蛋白NS3免疫兔，采血分离血清，纯化IgG，获得NS3多克隆抗体(简称“多抗”)，再标记辣根过氧化物酶，获得NS3酶标多抗。

3.试剂盒组装

将NS3蛋白包被的酶标板、酶标多抗、NS3抗体检测阴阳性对照血清及封闭液、洗涤液、底物显色液、终止液等，组装成试剂盒。

4.使用方法

在酶标板每孔中加入50μl封闭液，孵育30min，弃去封闭液；在6孔中分别加入NS3抗体检测阴阳性对照血清(每种对照重复2孔)各50μl，在剩余检测孔中加入50μl待检血清(重复2孔)，孵育90min后，用洗涤液洗涤3次；加入NS3酶标多抗，孵育30min后，用洗涤液洗涤3次；加入显色液，孵育10min后，用终止液终止；在10min内用酶联读数仪以450nm波长测定每孔吸光度(OD值)；计算阻断率，判定结果。

5.判定标准

猪瘟疫苗免疫和野毒感染NS3抗体检测阴性对照血清检测阻断率≤0.2，且0.3≤猪瘟疫苗免疫NS3抗体检测阳性对照血清检测阻断率≤0.5，且猪瘟野毒感染NS3抗体检测阳性对照血清检测阻断率≥0.6，则试验成立，数据有效；

6.结果判断

——其他情况均为可疑，需间隔2周重新采样检测。

实施例6

可以用小鼠，羊，豚鼠或其他非猪动物代替实施4中步骤2的兔，制备酶标二抗。

实施例7

可以用小鼠，羊，豚鼠或其他非猪动物代替实施5中步骤2的兔，制备酶标多抗。

实施例8

可以用NS3单克隆抗体(简称“单抗”)替代实施例5、7中步骤2的NS3多克隆抗体(简称“多抗”)。其制备如下：

1.NS3抗体间接ELISA检测试剂盒的建立

按照实施例4、6描述的方法进行。

2.NS3蛋白杂交瘤细胞的建立

(1)饲养细胞制备：采用小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞。选择Balb/c雌性小鼠，断颈椎处死，用75％酒精体表消毒，将DMEM培养液注入小鼠腹腔反复抽吸，吸出腹腔内液体(内含巨噬细胞)，低速离心，弃上清，以HAT培养液将细胞浓度调整为为2×10⁵/mL，接种至96孔培养板内培养18～24h，细胞呈多形性，贴壁紧密，折光性好时可用。

(2)骨髓瘤细胞准备：将骨髓瘤细胞SP2/0(购于中科院动物所)扩大培养至生长旺盛。

(3)脾淋巴细胞准备：将经NS3反复加强免疫的Balb/c小鼠，断颈椎处死，用75％酒精体表消毒，无菌采集脾脏，仔细去除结缔组织，用PBS轻轻洗涤数次，将脾脏置于200目细胞筛网上研磨，并同时用DMEM培养液冲洗，直至脾脏内细胞充分洗出。将收集的脾细胞用DMEM培养液洗涤2～3次备用。

(4)细胞融合：将脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0以5∶1的比例混合于融合管中，充分混匀，低速离心，弃上清，轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀，40℃水浴预热，吸取少量预热至37℃的PEG4000在1min内均匀滴加入至细胞悬液中，边加边轻轻搅拌，静置1～2min，加入10mL预热至37℃的DMEM培养液，静置5min，低速离心，弃上清，加入60mL HAT培养基，轻轻混匀，分装至生长有饲养细胞的96孔细胞培养板中，置37℃5％CO2培养箱内培养。

3.用NS3抗体阳性杂交瘤细胞的克隆、筛选

融合后第6天，用HAT培养基换出1/2培养基；第9天，用HT培养基换出1/2HAT培养基。待融合细胞生长至孔面积1/10以上时吸出上清，用检测步骤1建立的NS3抗体间接ELISA检测试剂盒检测。将所有阳性孔用有限稀释法进行1次多克隆，再分别进行3～5次单克隆，最后挑选出阳性反应最强的单克隆扩大培养建细胞株，命名为HS3-C。

4.杂交瘤细胞的染色体分析和稳定性检测

将杂交瘤细胞株体外培养1个月，每隔1周取细胞培养上清液检测抗体效价。再将细胞株冻存1个月后复苏，培养后取上清液检测抗体效价，检查细胞株分泌抗体的稳定性。结果所有抗体检测均为阳性，表明杂交瘤细胞株能稳定性良好。

Claims

1.一种区别检测猪瘟兔化弱毒疫苗免疫NS3抗体与猪瘟野毒感染NS3抗体的ELISA试剂盒，其特征在于该试剂盒由猪瘟病毒非结构蛋白NS3包被的酶标板、酶标抗体、NS3抗体检测阴阳性对照血清及封闭液、洗涤液、显色液、终止液组成；

所述NS3抗体检测阴阳性对照血清分别是猪瘟兔化弱毒疫苗免疫NS3抗体检测阳性对照血清、猪瘟野毒感染NS3抗体检测阳性对照血清、猪瘟兔化弱毒疫苗免疫和野毒感染NS3抗体检测阴性对照血清。

2.一种区别检测猪瘟兔化弱毒疫苗免疫NS3抗体与猪瘟野毒感染NS3抗体的ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于制备方法包括：

（1）猪瘟病毒非结构蛋白NS3表达、纯化和将表达、纯化的NS3蛋白与包被缓冲液配成合适浓度，包被酶标板；

（2）酶标抗体制备包括：

1）将按常规方法制备、纯化的猪IgG、IgM反复免疫家兔或其他动物，采血分离血清，经按常规方法纯化后获得兔或其他动物抗猪IgG、IgM的二抗，再将二抗标记辣根过氧化物酶，获得酶标二抗用于间接ELISA检测法；

2）将表达、纯化的非结构蛋白NS3免疫家兔或其他动物，采血分离血清，按常规方法纯化IgG，获得NS3多抗，再标记辣根过氧化物酶，获得NS3酶标多抗用于阻断ELISA检测法；

3）将表达、纯化的非结构蛋白NS3免疫小鼠，采集脾脏淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，制备单克隆抗体，再按常规方法纯化IgG，获得抗非结构蛋白NS3的单抗，再标记辣根过氧化物酶，获得NS3酶标单抗用于阻断ELISA检测法；

（3）NS3抗体检测阴阳性对照血清的制备包括：

1）将健康非免疫猪免疫猪瘟兔化弱毒疫苗2头份后每周采血分离血清，共采集10次，合并混匀后作为猪瘟兔化弱毒疫苗免疫NS3抗体检测阳性对照血清；

2）将健康非免疫猪接种国家兽医微生物菌种中心提供的低毒力CVCC AV63猪瘟病毒和中等毒力CVCC AV64猪瘟病毒后每周采血分离血清，共采集10次，合并混匀后作为猪瘟野毒感染NS3抗体检测阳性对照血清；

3）将健康非免疫猪采血分离血清作为猪瘟兔化弱毒疫苗免疫和野毒感染NS3抗体检测阴性对照血清；

（4）配制试剂按配方配制封闭液、洗涤液、底物显色液、终止液；

（5）试剂盒组装将NS3蛋白包被的酶标板、酶标抗体、NS3抗体检测阴阳性对照血清及封闭液、洗涤液、底物显色液、终止液等，组装成试剂盒。

3.如权利要求2所述的一种区别检测猪瘟兔化弱毒疫苗免疫NS3抗体与猪瘟野毒感染NS3抗体的ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于包被酶标板所用的猪瘟病毒非结构蛋白NS3是将猪瘟病毒非结构蛋白基因NS3使用序列1所示的引物P1和序列2所示的引物P2扩增，在原核表达系统中表达；使用序列3所示的引物P3和序列4所示的引物P4扩增，在真核表达系统中表达，再将所表达的蛋白纯化而获得，两种表达和纯化的产物其效力一样。