CN110305853A - 携带1型BVDV-Erns基因的高繁殖力猪瘟弱毒标记疫苗的构建方法 - Google Patents

携带1型BVDV-Erns基因的高繁殖力猪瘟弱毒标记疫苗的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，旨在提供一种携带1型BVDV‑Erns基因的高繁殖力猪瘟弱毒标记疫苗的构建方法。本发明利用分子克隆以及反向遗传方法，将CSFV‑C株基因组的Erns和E2基因的VR1区分别用BVDV1的Erns基因及CSFV流行株QZ14的VR1区进行置换，并向C株基因组7个特定位点引入突变，得到重组病毒rC‑Marker1。该重组病毒带有外源标记(BVDV Erns)、CSFV流行毒株E2基因的VR1区以及特定的突变位点，为开发适合体外细胞培养体系的猪瘟标记疫苗奠定基础。应用该技术构建的重组嵌合猪瘟病毒弱毒标记疫苗株，能够快速判断猪瘟病毒阳性血清是由于野毒感染还是接种疫苗引起，接种该弱毒标记疫苗株诱导的血清抗体对猪瘟病毒2型流行毒株有较好的中和能力，可以降低疫苗生产成本。

Description

携带1型BVDV-Erns基因的高繁殖力猪瘟弱毒标记疫苗的构建 方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种携带1型BVDV-Erns基因的高繁殖力猪瘟弱毒标记疫苗的构建方法。
背景技术
猪瘟是我国规定的17个一类动物疫病之一，对养猪业造成很大威胁。猪瘟是一种高度接触传染性、致死性传染病。急性猪瘟病程短，表现为高热稽留、全身毛细血管泛发性出血及脾梗死。慢性猪瘟表现为仔猪发育缓慢，母猪生殖障碍、流产、死胎、产弱子等。剖检可见淋巴结出血、脾梗死等。该病仍在包括我国在内的亚洲国家、东欧及南美地区流行。猪瘟由猪瘟病毒(CSFV)引起，CSFV是单股正链RNA病毒，其基因组由二十面体的衣壳蛋白及外层的囊膜包裹。囊膜上分布有三种囊膜糖蛋白，分别为Erns、E1和E2。其中Erns和E2可诱导产生保护性抗体。
上世纪50年代，我国学者通过将猪瘟强毒株在兔体内传代，成功筛选出一株弱毒疫苗，即猪瘟兔化弱毒C株。该疫苗株对未断奶猪、断奶仔猪及妊娠母猪均无致病力，免疫猪后可抵御致死性强毒的攻击，并且可提供早期免疫保护。C株被国内外公认为是防控猪瘟安全有效的疫苗。但由于C株是在兔体内连续传代而来，其细胞嗜性已发生一定变化，导致其在体外培养的猪细胞系中适应性差，制约了C株细胞苗的生产效率和效益。浙江大学研究小组在前期试验中发现，向C株基因组中引入8个特定的突变位点，可显著提高C株在体外培养猪细胞系中的适应能力。
免疫C株是我国控制猪瘟的基本策略。C株普遍免疫提高了猪群的抗体水平，有效控制了猪瘟的蔓延。但在免疫压力下，猪瘟病毒在我国的流行逐渐由基因1型的急性猪瘟转变为以基因2型为主的温和型猪瘟。C株对基因2型流行毒株有一定的中和能力，但相比经典的1型毒株，其中和能力已明显减弱。因此，许多猪场即使在免疫C株后，依然存在猪群隐性带毒或出现非典型猪瘟，这也是猪瘟难以被净化的一个重要原因。E2蛋白是猪瘟病毒的主要保护性抗原，浙江大学研究小组在前期试验中发现，E2蛋白存在三个抗原表位高变区(Hypervariable Antigenic Region)，分别位于aa702-731(VR1)、aa774-799(VR2)和aa841-864(VR3)。其中，将C株的VR1置换为2型流行毒株的VR1后，重组病毒诱导的抗体对2型流行毒株的中和能力显著提升。
猪瘟病毒虽然存在不同基因型，但只有一个血清型。在用ELISA方法进行血清学诊断时，无法辨别猪瘟抗体阳性的血清是由野毒感染还是疫苗接种引起，这给猪瘟的准确诊断和净化造成了极大困扰。因此，开发出可进行鉴别诊断的猪瘟标记疫苗以及相应的配套检测体系对猪瘟防控和净化具有重要意义。
牛病毒性腹泻病毒(BVDV)与CSFV同属黄病毒科瘟病毒属，其囊膜糖蛋白在结构和功能上有相似之处，可以通过毒株之间囊膜糖蛋白的嵌合实现标记的目的。欧盟多个实验室联合开发出了以BVDV CP7株为骨架，嵌合猪瘟病毒Alfort-187株E2基因的重组标记疫苗CP7-E2alf，并建立了相应的配套检测体系。但是，该病毒的骨架为BVDV，接种后产生的早期免疫保护效果可能不如C株。另外，该重组病毒嵌合的是欧洲强毒株Alfort-187的E2蛋白，该毒株尚未在中国出现，引入后可能会有一定的生物安全隐患。因此，开发出适合我国猪瘟防控的标记弱毒疫苗势在必行。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种携带基因1型牛病毒性腹泻病毒(BVDV1)Erns基因的高繁殖能力猪瘟病毒弱毒标记疫苗的构建方法。
为解决技术问题，本发明的解决方案是：
提供一种携带1型BVDV-Erns基因的高繁殖力猪瘟弱毒标记疫苗的构建方法，包括以下步骤：
(1)将GenBank登录号为KC695814.1的人工合成的BVDV1型毒株VEDEVAC Erns基因序列克隆于pUC57，得到重组质粒pUC57-B1Erns；以该重组质粒为模板，PCR扩增其Erns基因片段；
(2)通过一步定向克隆法，将步骤(1)获得的BVDV1VEDEVAC株Erns基因片段克隆至CSFV-C株感染性克隆质粒pA-FL22，置换CSFV的Erns基因片段，得到携带BVDV1型Erns基因的重组CSFV感染性克隆pCSFV-C-B1Erns；
(3)以CSFV基因2型流行毒株QZ14基因组cDNA为模板，PCR扩增其E2基因的VR1区7-126nt片段；
(4)通过一步定向克隆法，将步骤(3)所获QZ14株的VR1片段克隆至步骤(2)所获的pCSFV-C-B1Erns中，以置换C株E2基因的VR1片段，得到携带BVDV1型Erns基因和CSFV流行毒株VR1片段的重组CSFV感染性克隆pCSFV-C-B1Erns-VR1；
(5)用带有突变位点的引物，结合一步定向克隆法，将C株基因组上特定的7个突变位点引入重组感染性克隆中，得到携带BVDV1型Erns基因和CSFV流行毒株VR1片段以及7个特定突变位点的重组CSFV感染性克隆pCSFV-Cm7-B1Erns-VR1；所述7个突变位点为T3310G、C3433T、G3531T、A4085G、C8286A、A10332G和A11836C，对应的氨基酸变化为：M979R、A1020V、V1053L、I1237M、L2638I、S3320G和K3821T；
(6)将步骤(5)得到的感染性克隆pCSFV-Cm7-B1Erns-VR1酶切线性化，体外转录得到重组嵌合CSFV病毒Cm7-B1Erns-VR1的基因组RNA；
(7)将步骤(6)得到的基因组RNA电转入猪肾细胞PK-15中，通过连续传代的方式获得携带BVDV1型Erns基因和CSFV流行毒株VR1片段以及7个特定突变位点的重组病毒Cm7-B1Erns-VR1(以下简称为rC-Marker1)。
本发明中，步骤(1)中所用的引物序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示；步骤(2)中所用的引物序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示；步骤(3)中所用CSFV流行毒株E2的VR1序列如SEQ ID NO.5所示，所用的引物序列如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.7所示；步骤(4)中所用的引物序列如SEQ ID NO.8～SEQ ID NO.9所示；步骤(5)中所用的引物序列如SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.23所示。
本发明中，还包括对步骤(7)最终所获重组病毒进行生长特性评价：将重组病毒和亲本C株以相同MOI接种PK-15细胞后，计算不同时间点的病毒滴度，评价重组病毒的细胞适应性和增殖能力。
本发明中，还包括对步骤(7)最终所获重组病毒进行遗传稳定性评价：将重组病毒接种PK-15细胞后，连续传30代；收集第1、10、20和30代病毒，对其结构蛋白区及引入的突变位点进行测序，评价病毒的遗传稳定性。
本发明中，还包括对步骤(7)最终所获重组病毒进行安全性评价：将重组病毒接种断奶后且母源抗体消失的仔猪，观察接种后的猪只是否出现体温升高和猪瘟典型症状；对试验猪安乐死后进行剖检，观察各脏器是否出现病变以综合判断重组病毒的安全性。
本发明中，还包括对步骤(7)最终所获重组病毒进行免疫原性检测：将重组病毒接种断奶且母源抗体消失的仔猪，通过检测不同时间点猪血清中E2蛋白抗体水平来判断重组病毒的免疫原性；通过检测重组病毒和亲本C株免疫血清中BVDV1-Erns抗体水平差异，分析重组病毒是否适合于后续建立配套的鉴别检测体系。
本发明中，还包括利用步骤(7)所获重组病毒进行免疫断奶仔猪获得的抗血清，用于对CSFV基因2型流行毒株QZ14中和效价的测定；并通过与C株免疫血清对流行毒株QZ14中和效价的比较，来初步判断该重组病毒免疫能否增强对CSFV 2型毒株的保护能力。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)针对猪瘟疫苗生产和防控中的关键问题：没有CSFV标记疫苗毒株，无法建立能够区分猪瘟弱毒苗诱导的抗体和野毒感染诱导的抗体的方法；现有疫苗免疫的抗血清对CSFV基因2型流行毒株的中和能力较弱；CSFV疫苗C株的细胞适应性较差，病毒滴度较低。本发明提供的重组猪瘟弱毒标记疫苗携带分子标记、在猪细胞系中复制能力强、对CSFV基因2型流行毒株中和能力好。
(2)本发明利用分子克隆以及反向遗传方法，将CSFV-C株基因组的Erns和E2基因的VR1区分别用BVDV1的Erns基因及CSFV流行株QZ14的VR1区进行置换，并向C株基因组7个特定位点引入突变，得到重组病毒rC-Marker1。该重组病毒带有外源标记(BVDV Erns)、CSFV流行毒株E2基因的VR1区以及特定的突变位点，为开发适合体外细胞培养体系的猪瘟标记疫苗奠定基础。
(3)本发明构建的重组病毒rC-Marker1具有以下特性：(1)良好的细胞适应性，其生长能力与亲本C株相比显著提高，可以降低疫苗的生产成本；(2)在体外细胞培养体系中遗传稳定性良好，在PK-15细胞中连续传30代后，其结构蛋白序列未出现突变，引入的突变位点也未出现回复突变；(3)将rC-Marker1接种猪后，受试动物未出现体温升高和任何猪瘟典型症状；(4)接种该病毒产生的全病毒血清对CSFV 2型毒株的中和能力优于C株免疫血清；(5)收获的抗血清与BVDV Erns的反应性显著好于C株免疫血清，表明该重组病毒具有血清学鉴别诊断的潜力。
(4)应用该技术构建的重组嵌合猪瘟病毒弱毒标记疫苗株，能够通过血清学方法快速判断猪瘟病毒阳性血清是由于野毒感染还是接种疫苗引起，接种该弱毒标记疫苗株诱导的血清抗体对猪瘟病毒2型流行毒株有较好的中和能力，该弱毒标记疫苗株在体外培养细胞中的生长优于亲本C株，可以降低疫苗生产成本。
附图说明
图1.以CSFV-C株为骨架，嵌合基因1型BVDV的Erns基因，猪瘟病毒QZ14株E2基因的VR1区以及携带特定7个突变位点的重组病毒Cm7-B1Erns-VR1(简称rC-Marker1)基因组结构示意图。阴影部分代表嵌合的基因区段，星号代表引入的突变位点。
图2.将重组病毒rC-Marker1的RNA电转入PK-15细胞后，细胞连续传代，通过免疫荧光试验检测重组病毒中E2蛋白的表达情况。A、B和C分别代表电转后第1、第5和第7代病毒。D表示将第7代病毒上清感染PK-15细胞48h后，E2蛋白的表达情况。
图3.重组病毒rC-Marker1和亲本C株以相同MOI接种PK-15细胞后，在不同时间点收样，测定病毒的滴度，计算并制作病毒生长曲线。
图4.重组病毒rC-Marker1和亲本C株以相同剂量接种断奶仔猪后，受试动物体温的变化。
图5.接种重组病毒rC-Marker1的断奶仔猪，主要嗜感器官无肉眼可见的病理变化。
图6.重组病毒rC-Marker1和亲本C株在接种断奶仔猪后，在接种后不同时间点收获的血清与C株E2蛋白的反应性。
图7.重组病毒rC-Marker1和亲本C株在接种断奶仔猪后，在接种后不同时间点收获的血清与BVDV Erns蛋白的反应性。
图8.重组病毒rC-Marker1和亲本C株的免疫血清对CSFV流行毒株QZ14的中和效价差异比较。
具体实施方式
本发明涉及多种生物材料的使用，如无特别说明，均来自现有公知技术或属于市售商品。例如，人工合成的BVDV1型毒株VEDEVAC Erns基因序列的GenBank登录号为KC695814.1，CSFV-C株感染性克隆质粒pA-FL22的构建方法见中国发明专利“携带分子标记的猪瘟病毒C株感染性cDNA载体的构建方法”，专利号ZL200910155475.7。
下面参考附图，对本发明进行详细描述。
实施例1：CSFV-C株基因组Erns基因置换为BVDV基因1型毒株VEDEVAC的Erns基因
根据BVDV1-VEDEVAC株Erns基因序列(GenBank登录号：KC695814.1)，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成，得到含有BVDV1-VEDEVAC株Erns基因序列的质粒pUC57-B1Erns。以质粒pUC57-B1Erns为模板，B1E0-fwd/B1E0-rev为引物进行PCR扩增，得到含有BVDV1-VEDEVAC株Erns基因序列的片段A。以CSFV-C株感染性克隆质粒pA-FL22为模板，pA-B1E0-fwd/pA-B1E0-rev为引物，PCR扩增pA-FL22中除Erns基因片段以外的所有序列(片段B)。扩增片段A和片段B的两对引物中，A片段的上游引物与B片段的下游引物以及A片段的下游引物与B片段的上游引物分别包含20bp的互补序列(表1中下划线所示即为互补序列)。
将片段A和片段B利用一步定向克隆(Vazyme)的方法进行连接，得到重组质粒pCSFV-C-B1Erns，该质粒中原CSFV-C株的Erns基因被置换为BVDV基因1型VEDEVAC株的Erns基因。
表1：置换BVDV1-VEDEVAC株Erns及CSFV QZ14E2蛋白VR1区所需引物
实施例2：CSFV-C株E2基因VR1区置换为CSFV流行毒株QZ14的E2基因VR1片段
根据CSFV流行毒株QZ14株VR1基因序列(VR1为E2基因第7-126位核苷酸序列，如表1所示)，设计特异性引物VR1-fwd和VR1-rev；根据重组质粒pCSFV-C-B1Erns基因序列，设计扩增除CSFV-C株VR1基因外的所有其他序列的特异性引物pA-VR1-fwd和pA-VR1-rev(引物如表1所示)。抽提CSFV流行毒株QZ14株基因组RNA，反转录为cDNA，PCR扩增获得QZ14株E2基因的VR1片段(片段C)。以重组质粒pCSFV-C-B1Erns为模板，PCR扩增除CSFV-C株E2基因VR1区以外的所有基因组片段(片段D)。扩增片段C和片段D的两对引物中，C片段的上游引物与D片段的下游引物以及C片段的下游引物与D片段的上游引物分别包含20bp的互补序列(表1中下划线所示即为互补序列)。
将片段C和片段D利用一步定向克隆的方法进行连接，得到重组质粒pCSFV-C-B1Erns-VR1，该质粒中原CSFV-C株E2基因的VR1片段被置换为CSFV 2型流行毒株QZ14的E2基因VR1片段。
实施例3：CSFV-C株基因组上特定的7个位点突变
以重组感染性克隆pCSFV-C-B1Erns-VR1为模板，通过7对携带突变位点的引物(如表2所示)，利用一步定向克隆的方法，将重组质粒中嵌合CSFV基因组的第3310位、3433位、3531位、4085位、8286位、10332位和11836位的核苷酸进行突变，得到含有7个特定突变位点的感染性克隆pCSFV-Cm7-B1Erns-VR1(图1)。突变结果为T3310G、C3433T、G3531T、A4085G、C8286A、A10332G和A11836C。相对应的氨基酸变化为：M979R、A1020V、V1053L、I1237M、L2638I、S3320G和K3821T。
表2：向C株基因组引入7个突变位点所需引物
实施例4：重组病毒rC-Marker1的拯救及鉴定
将携带pCSFV-Cm7-B1Erns-VR1重组质粒的大肠杆菌过夜培养液(37℃)500μL加入200mL LB培养基中，同时加入200μL浓度为100mg/mL的Ampicillin，28℃扩大培养16h。收集菌液后用中量质粒纯化试剂盒抽提质粒(Promega)，测定浓度后用限制性内切酶XhoI(Takara)于37℃酶切过夜进行线性化。线性化质粒经纯化后，利用体外转录试剂盒(Ambion)得到重组病毒基因组RNA。
电转前将PK-15细胞用胰酶消化，用无血清培养基Opti-MEM(Thermo)洗涤细胞2次，取2×106个细胞与2μg上述RNA混匀，加入2-mm电转杯(Bio-rad)中，用电转仪(GenePulser Xcell,Bio-rad)进行电转。电转参数为150V，25μF，电阻无穷。电转后用完全培养基将细胞重悬后加入T25培养瓶中，37℃和5％CO2条件下培养72h。细胞经胰酶消化后以1:3的比例继续连续传代培养，并在传代过程中用特异性抗CSFV-E2单克隆抗体进行免疫荧光(IFA)鉴定。结果显示，电转RNA后的PK-15细胞可检测到荧光，荧光信号随着传代而增多，且呈典型戒指环状的核周围染色(图2，A、B和C)。
在检验是否产生具有感染性的子代病毒时，将带毒传代的细胞反复冻融，离心后收集上清。取上清接种70％融合度的PK-15细胞，培养72h后进行IFA检测，结果显示仍然可以检测到荧光信号(图2，D)。表明体外转录的RNA在细胞内能复制并合成病毒蛋白，最终产生具有感染性的子代病毒粒子，命名为Cmut7-B1Erns-VR1(简称rC-Marker1)。
实施例5：重组病毒rC-Marker1遗传稳定性检测
将rC-Marker1接种PK-15细胞后，连续传30代，每代2-3天。期间收集每一代病毒上清，于-80℃保存。将第1、10、20和第30代病毒提取RNA，反转为cDNA后，将重组病毒的结构蛋白基因及引入的突变位点进行测序。测序结果显示第1、10、20和第30代毒的结构蛋白基因未出现突变，引入的突变位点也未出现回复突变，表明此重组病毒遗传稳定性良好。
实施例6：重组病毒rC-Marker1生长曲线测定
在24孔板中接种PK-15细胞，105个细胞/孔，待长至70％融合度时，分别接种亲本C株和重组病毒rC-Marker1(MOI＝0.01)，每个病毒设置三个重复孔。于感染后的24h、36h、48h、60h、72h和96h收集总培养物，测定不同时间点子代病毒TCID50，绘制病毒生长曲线。
结果显示在感染后72h，重组病毒的滴度可达到106.25TCID50/mL，而亲本C株的滴度约为105TCID50/mL，表明重组病毒rC-Marker1的生长能力显著强于亲本C株(图3)。
实施例7：重组病毒rC-Marker1的免疫原性及安全性初步评价。
18头7周龄断奶仔猪随机分为3组，每组6头，各组单独隔离饲养。适应一周后，A组每头猪颈部肌肉注射DMEM培养基，B组每头猪颈部肌肉注射105TCID50猪瘟兔化弱毒C株，C组每头猪颈部肌肉注射105TCID50重组病毒rC-Marker1。期间进行临床症状观察并记录体温。每头猪于免疫前(D0)，免疫后第7天、14天、21天、28天和第35天前腔静脉采血。收集抗凝血用于病毒血症检测，收集血清用于抗体水平检测及中和试验。采集鼻拭子及肛拭子，评估重组病毒向环境散毒情况。在第35天试验猪安乐死后进行剖检，该过程中观察各主要脏器是否出现猪瘟相关的病变。
结果：在试验期间各组猪并未出现体温异常升高(图4)及任何猪瘟病毒引起的典型症状。病毒血症检测结果显示，接种C株及重组疫苗的猪均未出现明显病毒血症。鼻拭子及肛拭子中均未检出猪瘟病毒核酸，表明该重组病毒没有向环境散毒的风险。接种后第35天的剖检结果显示，各免疫器官及病毒嗜性组织均未观察到病理变化，表明该重组病毒对断奶仔猪无致病力(图5)。利用间接ELISA，将血清分别与纯化的CSFV E2蛋白和基因1型BVDV Erns蛋白反应。结果显示，重组病毒诱导的E2抗体水平与C株相当(图6)，表明该重组病毒保持了亲本株良好的免疫原性。此外，针对BVDV 1型Erns蛋白，重组病毒诱导的抗体水平显著高于C株(图7)，表明该重组病毒rC-Marker1具有血清学鉴别诊断的潜力，是良好的猪瘟病毒标记疫苗候选株。
实施例8：重组病毒rC-Marker1血清对CSFV流行毒株的中和能力评价
在96孔板中接种PK-15细胞，104个细胞/孔。分别将重组病毒rC-Marker1和亲本C株的血清进行4倍梯度稀释，与含200TCID50的CSFV基因2型毒株QZ14病毒液等体积混匀，每个稀释度6个重复孔；37℃孵育1h后，加入铺好细胞的96孔板中，37℃孵育2h。之后去除血清病毒混合液，Hank’s液洗两次细胞，加入100μL完全培养基。72h后弃去培养基上清，利用特异性抗CSFV-E2单克隆抗体进行IFA检测，记录阳性孔数，计算血清中和效价(neutralization titer 50％，NT50)。
结果显示，重组病毒rC-Marker1对CSFV流行毒株QZ14的中和效价显著高于亲本C株，表明该重组病毒可提高针对CSFV基因2型流行毒株的中和能力(图8)。
需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有多种变化形式。本领域的技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变化形式，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 携带1型BVDV-Erns基因的高繁殖力猪瘟弱毒标记疫苗的构建方法
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtaccaacc agttgaagcc gaaaacataa cacagtggaa cct 43
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acattacagt aaggcgatag agcgtatgct ccaaaccacg 40
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ctatcgcctt actgtaatgt aacaagcaag 30
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
ggcttcaact ggttggtaca acataattg 29
<210> 5
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
tcctgtaagg aagactacag gtatgcgata tcatcaacca acgagatagg gccgctaggg 60
gctgaaggtc tcaccaccac ttggagagag tatagtcatg gtttgcagct ggatgacggg 120
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
tagtaactgg ggcacaaggc cggctgtcct gtaaggaa 38
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
acgcaactgg ccttgacggt cccgtcatcc agctgcaa 38
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
accgtcaagg ccagttgcgt 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
gccttgtgcc ccagttacta gt 22
<210> 10
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
ggtcctgtaa ggaaaacctc ctgtacattc aactacacaa aaac 44
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
ggaggttttc cttacaggac cagcactaga gacaatct 38
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
gacctggatg tgactgaccg ccactcagat tac 33
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
gcggtcagtc acatccaggt caaaccagta ctgatact 38
<210> 14
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
agtgacctac ttagttttaa cagaacaact cgccgctg 38
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
gttaaaacta agtaggtcac tatcagccac agg 33
<210> 16
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
tgaagggaat gggtgagttg gatttacaca ctccg 35
<210> 17
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
ccaactcacc cattcccttc agcaccctta ttaaaaagat acc 43
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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tgtataccac atttatggag ttttttataa ggggtgggag g 41
<210> 19
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
actccataaa tgtggtatac aagtctaaga gggttgc 37
<210> 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
caagacaata ggctcagtaa tgacagctac tggtatc 37
<210> 21
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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attactgagc ctattgtctt gttatacaca ttgtgtctgt gtcc 44
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 22
ataggtgtta cagagggcaa ctggctagtc aatg 34
<210> 23
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 23
gttgccctct gtaacaccta tattgacaca gtcttgtagt agtc 44

Claims (7)

1.一种携带1型BVDV-Erns基因的高繁殖力猪瘟弱毒标记疫苗的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将GenBank登录号为KC695814.1的人工合成的BVDV1型毒株VEDEVAC Erns基因序列克隆于pUC57，得到重组质粒pUC57-B1Erns；以该重组质粒为模板，PCR扩增其Erns基因片段；
(2)通过一步定向克隆法，将步骤(1)获得的BVDV1 VEDEVAC株Erns基因片段克隆至CSFV-C株感染性克隆质粒pA-FL22，置换CSFV的Erns基因片段，得到携带BVDV1型Erns基因的重组CSFV感染性克隆pCSFV-C-B1Erns；
(3)以CSFV基因2型流行毒株QZ14基因组cDNA为模板，PCR扩增其E2基因的VR1区7-126nt片段；
(4)通过一步定向克隆法，将步骤(3)所获QZ14株的VR1片段克隆至步骤(2)所获的pCSFV-C-B1Erns中，以置换C株E2基因的VR1片段，得到携带BVDV1型Erns基因和CSFV流行毒株VR1片段的重组CSFV感染性克隆pCSFV-C-B1Erns-VR1；
(5)用带有突变位点的引物，结合一步定向克隆法，将C株基因组上特定的7个突变位点引入重组感染性克隆中，得到携带BVDV1型Erns基因和CSFV流行毒株VR1片段以及7个特定突变位点的重组CSFV感染性克隆pCSFV-Cm7-B1Erns-VR1；所述7个突变位点为T3310G、C3433T、G3531T、A4085G、C8286A、A10332G和A11836C，对应的氨基酸变化为：M979R、A1020V、V1053L、I1237M、L2638I、S3320G和K3821T；
(6)将步骤(5)得到的感染性克隆pCSFV-Cm7-B1Erns-VR1酶切线性化，体外转录得到重组嵌合CSFV病毒Cm7-B1Erns-VR1的基因组RNA；
(7)将步骤(6)得到的基因组RNA电转入猪肾细胞PK-15中，通过连续传代的方式获得携带BVDV1型Erns基因和CSFV流行毒株VR1片段以及7个特定突变位点的重组病毒Cm7-B1Erns-VR1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所用的引物序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示；步骤(2)中所用的引物序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示；步骤(3)中所用CSFV流行毒株E2的VR1序列如SEQ ID NO.5所示，所用的引物序列如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.7所示；步骤(4)中所用的引物序列如SEQ ID NO.8～SEQ ID NO.9所示；步骤(5)中所用的引物序列如SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.23所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括对步骤(7)最终所获重组病毒进行生长特性评价：将重组病毒和亲本C株以相同MOI接种PK-15细胞后，计算不同时间点的病毒滴度，评价重组病毒的细胞适应性和增殖能力。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括对步骤(7)最终所获重组病毒进行遗传稳定性评价：将重组病毒接种PK-15细胞后，连续传30代；收集第1、10、20和30代病毒，对其结构蛋白区及引入的突变位点进行测序，评价病毒的遗传稳定性。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括对步骤(7)最终所获重组病毒进行安全性评价：将重组病毒接种断奶后且母源抗体消失的仔猪，观察接种后的猪只是否出现体温升高和猪瘟典型症状；对试验猪安乐死后进行剖检，观察各脏器是否出现病变以综合判断重组病毒的安全性。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括对步骤(7)最终所获重组病毒进行免疫原性检测：将重组病毒接种断奶且母源抗体消失的仔猪，通过检测不同时间点猪血清中E2蛋白抗体水平来判断重组病毒的免疫原性；通过检测重组病毒和亲本C株免疫血清中BVDV1-Erns抗体水平差异，分析重组病毒是否适合于后续建立配套的鉴别检测体系。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括利用步骤(7)所获重组病毒进行免疫断奶仔猪获得的抗血清，用于对CSFV基因2型流行毒株QZ14中和效价的测定；并通过与C株免疫血清对流行毒株QZ14中和效价的比较，来初步判断该重组病毒免疫能否增强对CSFV2型毒株的保护能力。
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