CN105331636A - 一种稳定表达猪瘟病毒e2蛋白的重组细胞系及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系及其应用，该重组细胞系是采用慢病毒载体携带目的基因构建重组质粒后转染HEK-293T细胞，产生的高滴度病毒颗粒再感染HEK-293T细胞从而构建得到的，表达稳定，在多次传代后仍保持很好的蛋白表达水平。由该重组细胞系制备的疫苗免疫猪能诱导动物机体产生高效价猪瘟病毒中和抗体，可抵抗猪瘟病毒强毒攻击。

Description

一种稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系及其应用

技术领域

本发明涉及重组哺乳动物表达细胞系，具体涉及一种稳定表达猪瘟病毒E2蛋白重组细胞系。本发明还公开了制备所述重组细胞系的方法和该重组细胞系在制备猪瘟亚单位疫苗中的应用。属于生物医药基因工程与免疫学领域。

背景技术

猪瘟(Classicalswinefever，CSF)是由猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus，CSFV)引起的猪的一种急性高度致死性疾病，国际兽疫局(OIE)将其定为必须通报的疫病，我国将其列为一类动物疫病。猪瘟每年给我国造成的经济损失近100亿，对我国养猪业的危害极其严重。

目前对该病的有效预防和控制的主要措施是进行免疫。中国科学家研究成功的猪瘟弱毒疫苗(C株)对世界范围内猪瘟防控发挥了卓著贡献。该疫苗目前仍被我国及世界上多个国家使用。猪瘟弱毒疫苗分为乳兔苗，免脾淋苗，原代细胞苗及传代细胞苗等。乳兔苗和脾淋苗又称为组织苗，是采用健康家兔生产制备的。组织苗的生产需要大量动物，且工艺复杂，成本高；原代细胞苗及传代细胞苗的生产也受到诸多因素困扰，如细胞培养用血清中BVDV及抗体会干扰病毒生长，病毒生产滴度低、产量不稳定等。而且母源抗体干扰弱毒疫苗的免疫效果，这也是导致猪瘟疫苗免疫失败的因素之一。

CSFV为有囊膜病毒，病毒粒子大小约为40-60nm。病毒基因组为单股正链RNA，长约12.3kb，含一个大的开放性阅读框(ORF)，编码一个大的多聚蛋白含3898个氨基酸残基，分子量约为438kDa。多聚蛋白在翻译的同时和翻译后经病毒和宿主细胞的蛋白酶加工成12种成熟的病毒蛋白，包括结构蛋白和非结构蛋白，其中结构蛋白有C、E0、E1和E2蛋白。E2蛋白为CSFV的一种重要的囊膜糖蛋白，又称为gp55，是病毒主要的抗原蛋白。E2蛋白诱导产生病毒的中和抗体，是猪瘟病毒主要的免疫保护性抗原，也是研究猪瘟基因工程疫苗的重要靶蛋白。

鉴于现有猪瘟疫苗的种种缺陷与不足，以及随着现代基因工程技术与细胞生物工程技术的发展，许多科研人员试图以现代分子生物学手段研制出可以克服现有疫苗缺陷的新型猪瘟疫苗。这些新型的猪瘟疫苗有病毒活载体疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗、大肠杆菌表和昆虫杆状病毒表达的E2蛋白亚单位疫苗。

目前得到应用的有欧洲科研人员研制的以昆虫杆状病毒表达的E2蛋白亚单位疫苗，该疫苗免疫不受母源抗体影响，而且可以与病毒感染进行抗体检测鉴别诊断，如[Hulst,etal.Cytotechnology,20(1-3):271-277]用20μg昆虫细胞表达的E2双相油包水乳剂免疫猪，能抵抗100LD50CSFVBrescia毒株强毒的攻击，该疫苗已于上世纪九十年代在欧洲批准上市，在欧洲国家的猪瘟根除计划中发挥了重要作用。但是，该疫苗是通过昆虫杆状病毒表达系统表达的，相对原核表达系统而言，该表达系统表达蛋白后可以在一定程度上进行翻译后加工与修饰，但与病毒天然抗原蛋白结构仍有一定差异，蛋白表达后折叠与修饰不如哺乳动物细胞表达系统，而且该系统生产制备抗原时，细胞经病毒感染后细胞会裂解与死亡，对下游纯化等生产工艺增加难度。

慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷Ⅰ型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种能够稳定表达猪瘟病毒E2蛋白，且克服了表达猪瘟病毒E2蛋白对细胞毒性作用的重组细胞系。

本发明的另一个目的是提供上述重组细胞系在制备预防猪瘟病毒疫苗药物中的应用。

本发明的另一个目的是提供由上述重组细胞系和佐剂制备的猪瘟亚单位疫苗。

本发明的另一个目的是提供上述猪瘟亚单位疫苗的制备方法。

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

一种稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系，该重组细胞系是由如下方案制备而得：

步骤1：

构建慢病毒重组载体，该慢病毒重组载体包括其中插入编码猪瘟病毒E2蛋白的基因的序列和组氨酸标签序列，所述编码猪瘟病毒E2蛋白的基因的序列如SEQIDNO.1所示；

步骤2：

将所述慢病毒重组载体与慢病毒包装辅助质粒共转染人胚胎肾细胞HEK-293T，进行病毒包装和生产，收集病毒液；

步骤3：

用上述病毒液感染人胚胎肾细胞HEK-293T后培养，将培养的细胞进行稀释克隆，收集克隆细胞培养上清液与细胞，检测并比较猪瘟病毒E2蛋白表达量，获得稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系。

上述编码猪瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

本发明采用SDS-PAGE电泳检测重组细胞系的蛋白表达水平，结果标明筛选出的重组细胞系在多次传代后仍保持很好的蛋白表达水平，证明本发明构建的重组细胞系能稳定表达目的基因—猪瘟病毒E2蛋白。

本发明还提供上述重组细胞系在制备预防猪瘟病毒疫苗药物中的应用。

本发明还提供一种猪瘟亚单位疫苗，该疫苗是由有效剂量的本发明所述重组细胞系和佐剂组成。

本发明还提供一种猪瘟亚单位疫苗的制备方法，具体包括如下步骤：

步骤1：

将本发明所述的重组细胞系正常传代后长至融合度达到90％以上时，换无血清培养基继续培养7d；收集培养上清经2000rpm离心10min，吸取上清液，该上清液即为疫苗抗原液；

步骤2：

将步骤1制备的疫苗抗原液与佐剂按1：1～1：3重量比进行混合并充分乳化后，则制备得到所需猪瘟亚单位疫苗。

上述猪瘟亚单位疫苗为双相油佐剂疫苗，所述佐剂为矿物油佐剂。

本发明制备的稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系，具有容易培养、增殖快速、可无限扩大、性质稳定和蛋白表达量高的特点，其表达蛋白与佐剂制备成疫苗后免疫猪能诱导动物机体产生高效价猪瘟病毒中和抗体，可抵抗猪瘟病毒强毒攻击。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、现有技术中采用质粒转染细胞后克隆筛选最终获得的细胞系，其重组基因表达不稳定，不易获得高水平细胞株；而本发明采用慢病毒载体携带目的基因构建重组质粒后转染HEK-293T细胞，产生的高滴度病毒颗粒再感染HEK-293T细胞从而构建得到的重组细胞系，表达稳定，在多次传代后仍保持很好的蛋白表达水平；

2、本发明所选用的表达系统为HEK-293T细胞，得到的重组细胞系HEK-293T-E2具有与亲本细胞相似的生物特性，有利于抗原蛋白的规模生产；表达蛋白在表达细胞内能得到接近病毒蛋白的天然构象与修饰加工，抗原性好；重组细胞可以用转瓶高密度发酵培养，易于大量生产；

3、本发明构建的慢病毒重组载体中，除了包含插入编码猪瘟病毒E2蛋白的基因的序列外，还含有组氨酸标签序列，有利于后期纯化；

4、本发明的重组表达细胞系可以利用无血清培养基或低血清培养基进行培养表达，可以降低疫苗生产成本；

5、将本发明的表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞培养物制备疫苗可以诱导动物机体产生针对CSFV的高效价抗体，阻止病毒感染动物机体；

6、本发明抗原表达量高，利用普通细胞培养瓶皿培养，产量可达200毫克每升；

7、利用本发明的重组表达细胞系细胞培养物制备的油佐剂疫苗能诱导动物机体产生高效价抗体，抗体持续时间长，能对免疫动物提供长久的有效的免疫保护；

8、利用本发明重组细胞系表达抗原制备的疫苗免疫动物不产生猪瘟病毒E0蛋白抗体以及非结构蛋白抗体，可以利用检测猪瘟病毒E0蛋白抗体或非结构蛋白抗体来对疫苗免疫与病毒感染动物进行鉴别；

9、本发明所制备的猪瘟疫苗不含病毒核酸，不能复制，无致病性，具有极高的生物安全性，疫苗免疫不受母源抗体或已经存在抗体干扰与影响。

附图说明

图1为慢病毒重组载体pLV-CMV-E2构建示意图；

图2为慢病毒重组载体pLV-CMV-E2的菌落PCR电泳图；

图中，M为DL2000Marker，1-6为分别为1-6号克隆的菌落PCR结果，7为阴性对照，8为阳性对照；

图3为慢病毒重组载体pLV-CMV-E2的NheI酶切电泳图；

图中，1-2为pLV-CMV-eGFP的酶切结果，3为pMD19T-E2的酶切结果，4-6为慢病毒重组载体pLV-CMV-E2的酶切结果；

图4为不同克隆细胞表达E2蛋白的SDS-PAGE电泳图；

图中，1-8分别为不同克隆细胞培养上清液的SDS-PAGE电泳图；

图5为重组细胞系HEK-293T-E2的不同代次细胞表达E2蛋白的SDS-PAGE电泳图；

图中，1-5分别为1、5、10、15、30代细胞培养上清的SDS-PAGE结果；

图6为重组细胞系HEK-293T-E2的不同代次细胞基因的RT-PCR电泳图；

图中，1-5分别为1、5、10、15、30代细胞基因RT-PCR结果，6为阳性对照，7为阴性对照，M为MarkerDL2000(条带从上至下，分别为2000，1000，750，500，250bp)；

图7为免疫猪血清猪瘟病毒ELISA抗体检测；

图中，第一组为一次免疫组，每头经肌肉注射接种2ml猪瘟亚单位疫苗；第二组为加强免疫租，注射猪瘟亚单位疫苗2ml，第一次免疫三周后进行加强免疫一次；第三组为攻毒对照组，不用疫苗，仅注射PBS作为对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。

实施例所涉及的材料及其来源如下所示：

HEK-293T细胞由广州伯尼兹生物科技公司保存；

stab3感受态细胞购自广州复能基因有限公司；

质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、病毒核酸提取试剂盒、胰酶、SalI﹑XhoI﹑BamHI﹑NheI、T4DNA连接酶、兔源His多克隆抗体、HRP标记山羊抗猪IgG和羊抗兔IgG均为商品化试剂。

实施例1.稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系的构建及检测

1、编码猪瘟病毒E2蛋白的基因序列设计及制备

1.1编码猪瘟病毒E2蛋白的基因序列设计

猪瘟病毒E2蛋白(CSFVE2)的氨基酸序列参考CSFVShimen株(石门株)的蛋白序列(GenBank:AAC68902.2)，参考蛋白序列推出核酸序列后将该蛋白序列C端跨膜序列去除并加入his标签核苷酸序列，并在设计该基因时，在起始密码子前加有Kozak序列与NheI酶切位点与保护性碱基，在E2蛋白基因编码末端加有终止子与NheI酶切位点与保护性碱基；得到的E2蛋白的核酸序列如SEQIDNO.1所示，SEQIDNO.2为SEQIDNO.1翻译后的氨基酸序列。

1.2编码猪瘟病毒E2蛋白的基因序列制备

猪瘟病毒E2蛋白基因以及该基因特异性扩增引物(F-1和R-1)均由中美太和生物技术有限公司合成。

编码猪瘟病毒E2蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，基因特异性引物F-1的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，基因特异性引物R-1的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。

2、慢病毒重组载体的构建及检测

慢病毒表达质粒pLV-CMV-EGFP的获得：将FUGW质粒用PacⅠ酶切后补平再用BamHⅠ酶切回收载体大片段；将pCDNA3.0质粒先用BglⅡ酶切后补平再用BamHⅠ酶切后回收CMV启动子，再用Rocheligationkit将上述回收的载体大片段和CMV启动子连接后得到慢病毒表达质粒pLV-CMV-EGFP。

将上述慢病毒表达质粒pLV-CMV-EGFP用NheI酶切处理回收大片段，然后与经NheI酶切回收的CSFV-E2基因在T4DNA连接酶作用下连接，转化stab3感受态细胞后涂布含氨苄的LB平板，过夜培养后挑取单菌落扩增培养并提取质粒，用菌落PCR及NheI酶切对其进行鉴定，鉴定的阳性质粒即为本实施例所需慢病毒重组载体，将其命名为pLV-CMV-E2。

上述FUGW质粒、pCDNA3.0质粒和Rocheligationkit均为市售。

上述含氨苄的LB平板，其培养基配方为100毫升量：胰化蛋白胨1g、酵母提取物0.5g、氯化钠1g、琼脂1.5g，加蒸馏水溶解，高压灭菌20分钟，待液体冷却到55℃加入氨苄，摇匀后立刻倒板；所述氨苄浓度为100mg/mL，加入量为每100mL培养基加入100ul氨苄。

本实施例慢病毒重组载体的构建示意图如图1所示，提取的重组质粒经NheI酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分析，发现有两条带，酶切产物电泳带型与预期结果一致，同时菌落PCR检测结果也与预期一致；菌落PCR鉴定结果如图2所示，NheI酶切结果如图3所示。

3、慢病毒包装及滴度检测

3.1、细胞铺板

细胞铺板采用本领域技术人员的常规操作，具体步骤如下所示：

倒掉HEK-293T细胞培养瓶中的培养上清，用1-3mlPBS洗涤一遍，吸净；加入1ml0.25％的胰酶，室温作用1-2min；待细胞都变圆，加入2-3mlDMEM完全培养基把细胞吹打下来，收集到离心管中，1000rpm离心5min，弃上清；用DMEM完全培养基将细胞沉淀充分重悬，使细胞形成单细胞悬液；

向100mm细胞培养皿加入10mlDMEM完全培养基，用细胞计数板进行细胞计数，每个皿约加入6×10⁶细胞，37℃、5％CO₂培养箱内培养过夜。

DMEM完全培养基的配方为：含10％FBS、100U/ml的青霉素和0.1mg/ml链霉素的DMEM完全培养基(Corningcellgro,USA,lotnumber10-013-CVR-500ml)。

细胞状态对于病毒包装至关重要，细胞生长良好的状态有利于病毒包装，因此需要保证良好的细胞状态。

3.2慢病毒包装及感染

所述慢病毒包装就是将之前制备的慢病毒重组载体pLV-CMV-E2与慢病毒包装辅助质粒共转染人胚胎肾细胞HEK-293T，转染方法采用PEI(聚乙烯亚胺)方法，具体步骤如下所示。

3.2.1转染体系

所述PEI转染法为本领域技术人员的常规操作，其转染体系分为A液和B液，具体如下所示：

A液

PEI储存液24μl；

1×HBS补至1ml；

B液

上述PEI储存液的配方是：称取1.25mgPEI粉末溶解于50ml×HBS(pH7.4)中，0.2μm滤膜过滤，储存于4℃备用。

上述1×HBS的配方为：将8.76gNaCl溶解于900ml超纯水，加入20ml1M的HEPES，调pH值到7.4，定容至1L，0.2μm滤膜过滤后储存于4℃备用。

上述慢病毒包装系统质粒gag/pol、Rev、VSVG购自Invitrogen公司(货号：K4975-00)，这些包装质粒提供了病毒基因组mRNA包装成完整毒粒所必需的结构蛋白、聚合酶和包膜蛋白。

3.2.2转染

细胞铺板后第二天，待细胞融合度达到70％-90％时，将转染体系的A液加入到B液，充分混匀，室温静置20min后，轻轻滴加到100mm皿的细胞培养上清中，轻晃培养皿混匀，放37℃，5％CO₂孵箱中培养48h后收集上清液，然后再向细胞培养皿中加入10mlDMEM完全培养基，继续培养48h后收集上清液，合并两次上清液，然后3000rpm离心5min后去除细胞碎片，则得到所需病毒液。

将该病毒液取100μl用于检测病毒滴度，其余的分装后放于-80℃冰箱保存或用于后续的细胞感染。

3.3病毒滴度检测

病毒滴度检测采用RT-QPCR测定病毒滴度，其操作方法采用本领域技术人员的常规操作和所用试剂盒说明步骤即可，检测结果显示病毒滴度为1×10⁸copies/ml，说明病毒包装成功，能感染细胞并将基因插入到细胞基因组中。

3.4、细胞感染

将上述得到的病毒液感染HEK293-T细胞，具体步骤如下所示：

(1)将生长状态良好的HEK293-T细胞消化计数后用DMEM完全培养基稀释至1×10⁵/mL，加入24孔板，500μL/孔，准备2个复孔，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时；

(2)在DMEM完全培养基中加入polybrene(聚凝胺)，制备含polybrene的培养基(培养基中Polybrene的终浓度为6-8μg/mL)；

将上述3.2.2制备的病毒液10μl加入到上述含polybrene的培养基中，使终体积为300μl并轻吹混匀，制备得到含病毒培养基；

将步骤1培养24小时后的HEK293-T细胞的旧培养基倒掉，每个孔内加入300μl含病毒培养基，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养；

培养24小时后，将孔里的培养基倒掉，换上500μlDMEM完全培养基，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养；

4、基因稳定表达细胞系的建立

培养到第3-5天后，将长满培养孔的细胞用胰酶消化后，用有限稀释法传代于96孔板中继续培养，15天后在倒置显微镜下观察每孔细胞的克隆数目；

挑选含有1个细胞集落(即1个细胞团块)的孔，将克隆细胞在24孔板中培养3d后，收集上清液，10倍浓缩后加入电泳上样缓冲液制离心后吸取上清进行SDS-PAGE电泳，16mA90min后用碧云天考马斯亮蓝快速染色液(p0017)进行染色两小时后，脱色过夜用扫描仪扫描。

SDS-PAGE电泳结果如图4所示。

结果表明我们筛选得到的8个克隆都能表达目的蛋白E2，但表达量有差异，我们选取表达量最高的5号细胞克隆继续扩大培养后保存，并将其命名为HEK-293T-E2，并且对其进行稳定性检测。

5、本发明重组细胞系的稳定性检测

5.1克隆细胞不同代次细胞的SDS-PAGE电泳鉴定

将上述筛选得到的细胞系HEK-293T-E2正常传代并收集不同代次细胞的上清液进行SDS-PAGE电泳，结果表明不同代次的细胞均能稳定表达目的蛋白E2；SDS-PAGE电泳结果如图5所示。

5.2克隆细胞不同代次细胞的RT-PCR鉴定

利用RT-PCR对将上述细胞系HEK-293T-E2正常传代的不同代次细胞进行目的基因的扩增，具体步骤如下所示：

用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，取10μL进行反转录，加入OligodT1μL，RNase抑制剂1μL，M-MLV5×Buffer5μL，M-MLV转录酶1μL，dNTP(10mM)2.5μL，补加双蒸水至25μL，混合，42℃加热60min，95℃5min终止反应。然后利用opti-CSFV-E基因特异性引物，PCR扩增目的基因。

RT-RCR结果如图6所示，结果标明，筛选出的重组细胞系的不同代次的细胞均能扩增出与理论大小一致的目的条带，标明目的基因已稳定融合于细胞基因组中，且遗传稳定。

从上述检测结果可以看出，本实施例确实获得能够稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系，将其命名为HEK-293T-E2。

实施例2.猪瘟亚单位疫苗对猪的免疫效力实验

本实施例的猪瘟亚单位疫苗是由实施例1所构建筛选的重组细胞系HEK-293T-E2和佐剂组成，具体实验步骤如下所示。

1、疫苗的制备

将实施例1所构建筛选的重组细胞系HEK-293T-E2正常传代后长至融合度达到90％以上时，换无血清培养基继续培养7d；收集培养上清经2000rpm离心10min，吸取上清液；

将上述培养上清液与矿物油佐剂佐剂按重量比1：1混合并充分乳化制备成本实施例的猪瘟亚单位疫苗。

上述无血清培养基为本领域技术人员的常用试剂，采用市售产品即可。

2、试验分组和免疫操作

将15头CSFV抗体检测为阴性的60日龄仔猪随机分为3组，每组5头，具体如下所示：

(1)第一组为一次免疫组，疫苗采用上述制备的猪瘟亚单位疫苗；每头经肌肉注射接种2ml猪瘟亚单位疫苗

(2)第二组为加强免疫组，疫苗采用上述制备的猪瘟亚单位疫苗；每头经肌肉注射接种2ml猪瘟亚单位疫苗后3周，再用同样剂量加强免疫一次；

(3)第三组为攻毒对照组，不用疫苗，仅注射PBS作为对照。

3、抗体检测

第一组(一次免疫组)的免疫猪免疫后的第7、14、21和28天采血；

第二组(加强免疫组)的免疫猪在首次免疫后的第7、14、21、28和35天采血；

第三组(攻毒对照组)的猪按照第三组的采样时间定期采血。

采集的血清用ELISA试剂盒进行抗体检测。

4、攻毒

第一组(一次免疫组)的免疫猪在免疫后第28天按【中国兽药典】方法用猪瘟病毒标准强毒石门株进行攻击，攻毒后每日观察试验猪的精神状态，食欲与体温等指标。

第二组(加强免疫组)的免疫猪在加强免疫后的第14天按【中国兽药典】方法用猪瘟病毒标准强毒株进行攻击，攻毒后每日观察试验猪的精神状态，食欲与体温等指标。

5、免疫结果

5.1血清学结果

ELISA抗体检测结果如图7所示。

用本实施例制备的猪瘟亚单位疫苗免疫14天后，所有的免疫猪ELISA抗体均为阳性，免疫第21天-35天的抗体水平进一步升高。

第二组(加强免疫组)比第一组(一次免疫组)的抗体水平较高。

5.2攻毒试验结果

攻毒后，所有免疫猪未出现任何猪瘟临床症状，剖检时淋巴结、脏器均无任何肉眼可见病理变化；而第三组(攻毒对照组)的对照组猪在攻毒后48小时体温均开始升高，精神沉郁，食欲减退或废绝，5头猪分别于攻毒后9-15天内死亡，死亡猪剖检均呈现典型的猪瘟症状。

由上述血清学和免疫攻毒试验结果表明，本发明的猪瘟亚单位疫苗免疫猪后能诱导产生较高水平的保护性抗体，且对强毒攻击可提供100％的保护。

SEQUENCELISTING

<110>广州伯尼兹生物科技有限公司

<120>一种稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系及其应用

<130>

<160>4

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>1114

<212>DNA

<213>编码猪瘟病毒E2基因

<400>1

gatcctctagagattctagctagcccaccatggtattaagaggacaggtcgtgcaaggtg60

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<210>2

<211>356

<212>PRT

<213>编码猪瘟病毒E2氨基酸序列

<400>2

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151015

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202530

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505560

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65707580

AsnValValSerArgArgTyrLeuAlaSerLeuHisLysGlyAlaLeu

859095

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100105110

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115120125

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165170175

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180185190

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210215220

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225230235240

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245250255

IleValAspSerThrAspCysAsnArgAspGlyValValIleSerAla

260265270

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275280285

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ValSerSerAlaGlyProValArgLysThrSerCysThrPheAsnTyr

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355

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>引物F-1

<400>3

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<210>4

<211>36

<212>DNA

<213>引物R-1

<400>4

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Claims (6)

1.一种表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系，该重组细胞系是由如下方案制备而得：

步骤1：

构建慢病毒重组载体，该慢病毒重组载体包括其中插入编码猪瘟病毒E2蛋白的基因序列和组氨酸标签序列，所述编码猪瘟病毒E2蛋白的基因的序列如SEQIDNO.1所示；

步骤2：

将所述慢病毒重组载体与慢病毒包装辅助质粒共转染人胚胎肾细胞HEK-293T，进行病毒包装和生产，收集病毒液；

步骤3：

用上述病毒液感染人胚胎肾细胞HEK-293T后培养，将培养的细胞进行稀释克隆，收集克隆细胞培养上清液与细胞，检测并比较猪瘟病毒E2蛋白表达量，获得稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系。

2.根据权利要求1所述稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系，其特征在于所述编码猪瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

3.权利要求1所述稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系在制备预防猪瘟病毒疫苗药物中的应用。

4.一种猪瘟亚单位疫苗，该疫苗是由有效剂量的权利要求1所述重组细胞系和佐剂组成。

5.根据权利要求4所述的猪瘟亚单位疫苗，其特征在于所述佐剂为矿物油佐剂。

6.权利要求4或5所述猪瘟亚单位疫苗的制备方法，其特征在于该制备方法具体包括如下步骤：

步骤1：

将权利要求1所述重组细胞系正常传代后长至融合度达到90%以上时，换无血清培养基继续培养7d；收集培养上清经2000rpm离心10min，吸取上清液，该上清液即为疫苗抗原液；

步骤2：

将步骤1制备的疫苗抗原液与佐剂按1：1~1：3重量比进行混合并充分乳化后，则制备得到所需猪瘟亚单位疫苗。