CN102660544A

CN102660544A - 一种用于抑制猪瘟病毒复制的RNAi及其制备方法

Info

Publication number: CN102660544A
Application number: CN2012101803272A
Authority: CN
Inventors: 刘湘涛; 陈妍; �田宏; 吴锦艳; 尚佑军; 尹双辉; 王光祥; 靳野; 张克山; 杨顺利; 刘永杰
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2012-06-04
Filing date: 2012-06-04
Publication date: 2012-09-12

Abstract

一种用于抑制猪瘟病毒复制的RNAi及其制备方法，所述包含siRNA序列，shRNA慢病毒表达载体构建，复制缺陷型慢病毒的获得、慢病毒感染PK-15细胞（猪肾细胞）以及抑制猪瘟病毒复制效果的验证方法，该序列具有明显抑制猪瘟病毒在敏感细胞上复制的作用。本发明对猪瘟病毒体内外复制进行RNA干扰的探索，构建靶向猪瘟病毒基因组的特定保守基因区段的慢病毒载体介导的稳定整合的RNA干扰技术，有望构建靶向猪瘟病毒的siRNA的转基因动物。为RNAi应用于猪瘟病毒的基因功能研究以及猪瘟的防治积累了必要的实验数据，为动物的抗病育种提供前期准备。

Description

一种用于抑制猪瘟病毒复制的RNAi及其制备方法

技术领域

本发明涉及抑制猪瘟病毒复制的方法，具体说是由三对shRNA序列组成的一种用于抑制猪瘟病毒复制的RNAi，本发明还包括RNAi的制备方法。

背景技术

猪瘟(Classical swine fever, CSF)是世界范围内严重危害养猪业的传染病之一。为了区别于非洲猪瘟，欧洲人称其为“古典猪瘟(Classical swine fever,CSF)”。其病原是猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)。CSFV是RNA病毒，属黄病毒科(Flaviridae)、瘟病毒属(Pestivirus)的成员，与同属的牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)和绵羊边界病病毒(Border disease virus, BDV)在抗原性和结构上关系密切。CSFV是具有囊膜的正链RNA（核糖核酸）病毒，具有感染性。CSFV基因组共编码4种结构蛋白、8种非结构蛋白。结构蛋白编码区占据病毒基因组5′端的1/3，非结构蛋白编码区除Npro编码序列位于基因组5′端外，其余均位于病毒基因组3′端的2/3。一般认为病毒侵染细胞是通过囊膜蛋白与细胞表面受体相互作用形成Infecosome（感染复合体）后进入宿主细胞。然而对CSFV感染细胞的细节尚不甚明了。而传统的疫苗免疫等措施不能有效地应对猪瘟的暴发和流行，RNAi（核糖核酸干扰）现象的发现及其在抗病毒方面的研究进展，为猪瘟的防制研究开辟了一个新的探索领域。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是通过内、外源双链RNA触发的，由19-23bp小分子干扰RNA片段(siRNA)诱导的同源性mRNA（信使RNA）的降解，从而使该基因表达沉默(gene silence)的过程。它是广泛存在于动、植物中的序列特异性转录后基因沉默，是生物体在进化过程中，抵御病毒感染及因重复序列和突变引起的基因组不稳定性的保护机制，同时也是一种真核生物体内的基因调控机制。分子生物学研究的早期，人们对基因的了解都是通过基因突变而获得的。近年来，反向遗传学技术广泛应用于基因功能的研究，使人们对基因功能的研究取得了飞跃式的发展，但该技术在基因重组方面耗时费力。在如今的后基因组时代，RNAi技术以其独特的优势成为分析基因功能的又一种方法，得到了广泛的认同。近年来，许多学者以人工诱导RNAi的方式进行了病毒复制的干扰研究，取得了良好进展。例如在抗乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、艾滋病毒（HIV）和脊髓灰质炎病毒（Poliovirus）等病毒病的研究中都发现RNA干扰，对于抑制这类病毒的复制效果极好，可能为这类病毒病的治疗创立新的、更有效的途径。但是目前关于RNAi仍有很多问题亟待解决，例如：进行RNAi的时间和靶位点；哺乳类动物中的干扰素反应；RNAi作用的确切机制；脱靶效应等。因此，今后的研究仍然集中在RNAi作用机制的探讨上，以及如何改进运用RNAi的方法来研究基因的功能。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术难以控制猪瘟的不足，构建靶向猪瘟病毒基因组的特定保守基因区段的慢病毒载体介导稳定整合的RNA干扰技术，本发明还提供该技术的制备方法。

为解决上述问题，本发明采用了下述技术方案：

一种用于抑制猪瘟病毒复制的RNAi，包含siRNA序列，通过构建shRNA(short hairpin RNA即短发夹脱氧核糖核酸)慢病毒表达载体，获得复制缺陷型慢病毒，用获得的慢病毒感染PK-15细胞，筛选出具有抑制猪瘟病毒复制的PK-15细胞克隆。

所述序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:6包括：

Npro115: 5’→3’

SEQ ID NO:1：T CACCGCATGCCCAAGACACACCTTACGA

ATAAGGTGTGTCTTGGGCATGC

SEQ ID NO:2：B CACCGCATGCCCAAGACACACCTTACGA

ATAAGGTGTGTCTTGGGCATGC

Npro207: 5’→3’

SEQ ID NO:3：T CACCGCCCACTATTAGGCTAGTATACGA

ATATACTAGCCTAATAGTGGGC

SEQ ID NO:4：B AAAAGCCCACTATTAGGCTAGTATATTCG

TATACTAGCCTAATAGTGGGC

NS5B303: 5’→3’

SEQ ID NO:5：T CACCGGGAGAAATACAACCACAATCCGAA

GATTGTGGTTGTATTTCTCCC

SEQ ID NO:6：B AAAAGGGAGAAATACAACCACAATCTTCG

GATTGTGGTTGTATTTCTCCC

所述shRNA表达载体的构建，包括shRNA 克隆载体的构建和表达载体的构建。

所述复制缺陷型慢病毒的获得，包括shRNA表达质粒与Packaging Mix（包装混合物）共同转染293-FT(人胚肾细胞株）细胞，收获细胞上清，获得复制缺陷型慢病毒。

所述复制缺陷型慢病毒感染PK-15细胞，包括复制缺陷型慢病毒感染PK-15， blasticidin抗性筛选，获得抑制猪瘟病毒复制的PK-15细胞克隆。

所述抑制猪瘟病毒复制效果的验证方法，包括流式细胞术、间接免疫荧光及Real-time RT-PCR、

本发明还提供了RNAi的制备及验证方法，包括以下步骤：

a. 设计并合成shRNA对应的DNA序列—ds oligo。

b. 利用T4 DNA连接酶将ds oligo 克隆进pEN/U6 载体。

c. 转化TOP 10感受态细胞，挑选阳性克隆，测序检验序列的保真性。

d. 将上述pEN/U6-Npro115，pEN/U6-Npro207，pEN/U6-NS5B303 三种质粒分别与pDEST载体进行LR重组，获得表达骨架。

e. 获得的表达骨架与优化好的Packaging Mix共转染293-FT 细胞，产生复制缺陷型慢病毒粒子。

f．将产生的复制缺陷型慢病毒粒子感染PK-15细胞，将ds oligo 整合到宿主细胞的基因组上。

g. blasticidin抗性筛选，建立稳定抑制猪瘟复制的PK-15细胞克隆。

h．分别用Real-time RT-PCR（实时定量-反转录-聚合酶链反应）、间接免疫荧光及流式细胞术验证抑制效果。

CSFV的抗原性呈多样性而且比较复杂，具有不同的血清变种。另外CSFV基因组为单股正链RNA，相当于mRNA，为单顺反子结构。基因组RNA没有单一准确的核酸序列，呈现类群分布，这种特性使得CSFV在变异及适应性方面具有很大的灵活性，即便是面对RNAi，病毒仍能够通过RNA中碱基的删除或突变进行逃逸。所以RNAi技术运用于抗病毒研究首先就要解决病毒高度遗传变异带来的逃逸这一关键问题。解决上述问题的办法之一就是设计的shRNA靶向病毒基因组的高度保守区域。干扰靶序列的保守性越高，抑制CSFV的潜力就越大。

Npro是CSFV的非结构蛋白，也是CSFV基因组大ORF编码的第一个蛋白，Npro蛋白具有蛋白酶自身催化活性，可自动从正在合成的病毒多聚蛋白中裂解下来，又因为其位于CSFV病毒多聚蛋白序列的N端，故得名Npro。另外,CSFV的另外一个非结构蛋白NS5B由728个氨基酸组成，分子量82kDa，N端为Ser3181，C端为Val3898，为呈碱性亲水性蛋白。因氨基酸序列中含有RNA聚合酶的典型活性基序(Gly-Asp-Asp)，是病毒RNA复制酶。通过对上述非结构蛋白的分析发现，Npro和NS5B基因序列高度保守。

鉴于此，本发明针对猪瘟病毒基因组中高度保守的Npro和NS5B区域作为靶序列。

按照shRNA序列选择的一般原则，利用Invitrogen公司的BLOCK-it^TM RNAi Designer在线设计程序初步筛选一些shRNA序列，同时对干扰靶位序列进行了同源性分析。当前较为常用的5种制备siRNAs的方法是体外转录法、直接化学合成法、长片段dsRNAs经RNase III类(如Dicer)降解、PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达、siRNA质粒表达载体或病毒载体在细胞内表达siRNAs五种。前三种涉及到RNA操作，对实验室的要求较高。利用表达载体在细胞内表达siRNA不仅可以避开RNA操作，而且可以长效、稳定的产生RNAi效应。常用siRNA表达载体的启动子属于RNA聚合酶III (pol III)，主要有鼠源的U6启动子、人源的U6启动子和人H1启动子3种。各种siRNA表达载体转录出的产物是可折叠形成的shRNA，然后在细胞中被Dicer酶切割成siRNA，进而启动RNAi介导基因沉默。

使用siRNA表达载体需要合成2条编码shRNA序列的DNA单链，经退火后插入对应载体的pol III启动子下游。本发明使用的pEN/U6是含有人源U6启动子的shRNA表达载体，它是由Pol III启动子、卡那霉素抗性基因和大肠杆菌复制子等组成。利用已经线性化载体的粘性末端的碱基特性，将合成的一对带有4个碱基的突出端的50-mer的寡核苷酸退火并连接到上述pEN/U6载体。这种部分具有回文结构的DNA序列在RNA pol III启动子的作用下可以在哺乳动物细胞内转录出众多的shRNA，从而启动RNA干扰过程。

本发明注重干扰靶区的选择和shRNA的初步筛选，在细胞水平上考察了所选shRNA对靶基因的干扰作用，并借助慢病毒表达系统，筛选表达shRNA的阳性PK-15细胞克隆，在细胞模型水平有助于阐明抑制FMDV复制的关键靶基因、病原感染过程及病原中该靶基因的生物学功能，并为转基因抗病育种打下坚实基础。

附图说明

图1为pENU6/115-shRNA重组质粒测序结果示意图；

图2为pENU6/207-shRNA重组质粒测序结果示意图

图3为pENU6/303-shRNA重组质粒测序结果示意图

图4为pLenti6EX/115-shRNA表达质粒测序结果示意图

图5为pLenti6EX/207-shRNA表达质粒测序结果示意图

图6为pLenti6EX/303-shRNA表达质粒测序结果示意图

图7 为real-time RT-PCR验证shRNA对猪瘟脾脏病毒复制的抑制效果

图8 为间接免疫荧光验证shRNA对猪瘟全血病毒复制的抑制效果

图9为real-time RT-PCR验证shRNA对猪瘟全血病毒复制的抑制效果

图10为流式细胞术验证shRNA对猪瘟病毒复制的抑制效果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步详细叙述

实施例1

1、表达shRNA的ds oligo的生成

借助美国Invitrogen公司网上在线设计软件(BLOCK-iT^TM RNAi Designer），确定针对pEN/U6载体要求的具体shRNA片段115、207及303对应的DNA插入序列，送与宝生物工程(大连)有限公司合成并退火生成ds oligo。插入序列如下：

Npro115: 5’→3’

SEQ ID NO:1：T CACCGCATGCCCAAGACACACCTTACGA

ATAAGGTGTGTCTTGGGCATGC

SEQ ID NO:2：B CACCGCATGCCCAAGACACACCTTACGA

ATAAGGTGTGTCTTGGGCATGC

Npro207: 5’→3’

SEQ ID NO:3：T CACCGCCCACTATTAGGCTAGTATACGA

ATATACTAGCCTAATAGTGGGC

SEQ ID NO:4：B AAAAGCCCACTATTAGGCTAGTATATTCG

TATACTAGCCTAATAGTGGGC

NS5B303: 5’→3’

SEQ ID NO:5：T CACCGGGAGAAATACAACCACAATCCGAA

GATTGTGGTTGTATTTCTCCC

SEQ ID NO:6：B AAAAGGGAGAAATACAACCACAATCTTCG

GATTGTGGTTGTATTTCTCCC

2、ds oligo与pEN/U6载体连接，构建pEN/U6-shRNA

2.1双链寡核苷酸(ds oligo)的生成

(1) 在0.2ml的PCR扩增管中建立下列体系：

(2) 95℃孵育上述反应4min，然后放置室温下退火5～10min。

(3) 短暂离心后，移出1μl反应液稀释至适当浓度备用。剩余的50μM ds oligo储存于-20℃。

2.2 ds oligo短片段与载体的连接

(1) 在室温下，0.2ml的PCR扩增管中依次加入下列试剂建立连接反应体系：

试剂 (reagent)	数量(amount)
		5× Ligation Buffer	4 μl
pEN/U6 (0.5 ng/μl)	2 μl
		ds oligo (5 nM)	1 μl
DNase/RNase-Free Water	12 μl
		T4 DNA Ligase (1 U/μl)	1 μl
总体积(total volume)	20 μl

(2) 上下吹打混匀后在室温下反应5min。

(3) 反应时间可延长至60min，然后放置冰上，进行下面的

转化TOP₁₀感受态细胞。

3、将连接产物转化TOP₁₀大肠杆菌感受态细胞，阳性克隆即为构建的pEN/U6-shRNA，测序检验序列的保真性。测序结果见附图1～3。

4、pEX/U6-shRNA表达质粒的构建

借助LR Enzyme Mix（重组酶混合物）作用，将pEN/U6-shRNA 重组在pLenti6-dest-vector(慢病毒系统的目的载体)上，从而构建pEX/U6-shRNA表达载体质粒。

4.1 LR重组反应

(1) 在0.2ml的PCR扩增管中建立下列反应体系：

(2) 从-20℃的冰箱取出LR Clonase Enzyme Mix在冰上融化1～2 min，简短离心2次后吸取2 μL加入上述反应体系，并上下吹打混匀。

(3) 25℃孵育上述扩增管1.5h，然后加1μL 蛋白酶K，37℃ 保温15min。接下来就可以进行转化感受态细胞。

4.2 重组体转化感受态细胞及阳性质粒鉴定

(1) 将上述中LR重组后的产物(约8 μL)加到50 μL在冰上融化的Stbl3感受态细胞(10min 内)中混匀，冰浴30min，42℃水浴热击60s(切勿振荡)，再冰浴2～3min，加入450μL预热的SOC，拧紧盖子混匀，37℃水平转速225 rpm振荡1h，3500rpm离心2min，吸弃约350μL，剩余的100μL菌液涂布在含对应抗生素的LB平皿上，吸收液体10min后37℃倒置培养14h至单菌落出现。

(2) 随机挑取生长于LB平皿上的数个单菌落，增菌培养后小量提取质粒，经PCR鉴定为阳性的，送于金唯智生物科技(北京)有限公司测序，将测序正确的质粒命名为pLenti6EX/U6-shRNA。测序结果见附图4～6。

5、复制缺陷型慢病毒的获得

pLenti6EX/U6-shRNA与已经优化的ViraPower? Packaging Mix共转染人胚肾细胞293-FT(脂质体转染法)，50h收获无复制能力的慢病毒上清液。4℃条件下3500 rpm离心5 min以去除细胞碎片，收集上清（慢病毒）于-70℃保存备用。必要时可以过滤。

6、慢病毒感染PK-15细胞及阳性细胞克隆的筛选

将正常PK-15细胞接种于6孔板中，待细胞铺满度达到80%～90%时，滴加阳性和对照包装复制缺陷型慢病毒液。48h后吸弃含慢病毒的DMEM，换上含有blasticidin的新鲜DMEM进行连续培养，当出现blasticidin抗性的细胞克隆时，挑取单个阳性细胞克隆和阴性对照单克隆细胞接种于96 孔细胞板，连续筛选四周，直至找到干扰效率最高的阳性克采隆，再扩大培养并进行抑制效率分析。

7、样品1的制备

取田间采集的感染猪瘟的猪脾脏组织，用双抗、石英砂研磨，pH7.6 0.05M PBS(磷酸盐缓冲液)悬浮，4℃浸毒过夜，次日，12000rpm/min、4℃离心30min，上清0.22um滤膜过滤后接种PK-15细胞1～2mL/瓶，静置于37℃温箱内吸附1h（期间轻摇2～3次，使病毒与整个细胞面充分接触）。补加病毒维持液（不含血清DMEM）9～8 mL，以覆盖细胞层为度，同时以维持液代替病毒上清接种正常细胞作为阴性对照。继续置37℃恒温箱内培养，48h后收获病毒，将其置于-70℃，反复冻融，离心，上清（记作F1）接种正常细胞，同上连续传5代，将F5代作为制备好的细胞毒，-70℃保存备用。

8、real-time RT-PCR验证shRNA对猪瘟脾脏病毒复制的抑制效果

为验证表达shRNA的阳性PK-15细胞克隆抑制猪瘟病毒包装能力，给筛选的阳性PK-15细胞克隆接种步骤7中培养的CSFV细胞毒。以对Npro和NS5B基因的扩增检测猪瘟脾脏病毒基因的复制情况，同时以管家基因 β-actin作为内参。分别收集稳定整合干扰序列、对照无关序列的转基因细胞和未转基因的细胞，提取总RNA。经反转录获得cDNA，在完全一致的PCR条件下，将Npro、NS5B基因和β-actin基因同步扩增。然后，用比较阈值法分析不同样品中猪瘟病毒的相对拷贝数(Kenneth J and Thomas D,2001)，计算方法为：①△CT=处理样品Npro、 NS5B基因扩增CT值-处理样品β-actin扩增CT值；②△△CT=未处理样品△CT值-处理样品△CT值；③以2-△△CT计算处理组猪瘟病毒拷贝数相对于对照组的倍数。

9、结果

与pU6-shRNA-CON和未转基因的正常细胞相比， pU6-shRNA-115、pU6-shRNA-207、pU6-shRNA-303病毒基因相对拷贝数低，说明3个干扰组都表现出了很强的抑制病毒感染的能力。详见附图7。

实施例2

1-6步骤同实施例1

7、样品2的制备

采集感染猪瘟病毒的猪全血，12000转/分和4℃离心30分钟，上清0.22um滤膜过滤后接种PK-15细胞，接种方法详见实施例1中7。

8、间接免疫荧光检测shRNA抑制猪瘟全血病毒表达的能力

为验证表达shRNA的阳性PK-15细胞克隆抑制猪瘟病毒包装能力，给筛选的阳性PK-15细胞克隆接种步骤7培养的CFSV细胞毒。培养24h后，弃去培养液，以PBS缓冲液(pH7.6)洗涤细胞2次，每次1.5min，冲洗后加入预冷的80%丙酮，放入-20℃冰箱固定25min，吸弃丙酮，以PBST缓冲液(pH7.6)洗涤单层细胞3次，每次4 min。室温下用含3～5%BSA的PBS封闭液封闭45min。弃掉封闭液，用PBS洗涤细胞3次，每次8 min。每孔加入用PBS 1:500稀释的兔抗CSFV阳性血清1mL，在37℃湿盒中作用1h，弃去阳性血清，用PBST缓冲液洗涤单层细胞3次，每次6～8min。每孔加入1:80稀释的FITC（辣根过氧化物酶）标记的羊抗兔IgG 800μL，再在湿盒中37℃孵育1 h，吸弃荧光二抗，用PBST冲洗细胞3次，每次6～8min，吸干冲洗液后滴加2滴50%甘油溶液，置于荧光显微镜下观察染色结果并照相。

9、结果

阴性对照克隆和未转基因的空白对照在接种病毒24h后，每株细胞克隆的感染率均比有干扰序列的阳性细胞克隆的感染率高，并且差别比较明显。表明设计的shRNA有抑制猪瘟全血病毒的表达。详见附图8。

实施例3

1-7步骤同实施例2

8、real-time RT-PCR验证shRNA对猪瘟全血病毒复制的抑制效果试验，方法同实施例1。

9、结果

与pU6-shRNA-CON和未转基因的正常细胞相比， pU6-shRNA-115、pU6-shRNA-207、pU6-shRNA-303病毒基因相对拷贝数低，说明3个干扰组都表现出了很强的抑制病毒感染的能力。详见附图9。

实施例4

1-6步骤同实施例1。

7、样品3的制备

（1）表达质粒pEGFP+ Npro和pEGFP+ NS5B的构建

为验证表达shRNA的PK-15细胞抑制靶基因的能力，本研究构建了带有GFP及Npro和NS5B基因的真核表达载体。具体构建方法：

将扩增到的Npro和NS5B基因与pEGFP-N1空载体分别用BamH I和XhoI双酶切并回收，然后用T4 DNA连接酶16℃连接3h，转化至感受态E.coli JM109，用50μg/mL卡那霉素抗性LB平板筛选，经PCR及BamH I和XhoI双酶切鉴定后获得阳性重组质粒。将序列和读码框均正确的重组质粒命名为pEGFP+ Npro和pEGFP+ NS5B。

（2）重组质粒pEGFP+ Npro和pEGFP+ NS5B转染PK-15细胞

将PK-15细胞培养于6孔培养板中，24h后，弃去孔内培养基，用不含血清和抗生素的DMEM洗细胞面两次，每孔按1 μg质粒DNA和2 μL 脂质体 2000的比例进行转染，分别设转染空载体和未转染的细胞为阴性对照。4.5h后吸弃转染液，加入新鲜的含10%犊牛血清的DMEM，于37 ℃、5% CO₂ 条件下培养。

8、流式细胞检测shRNA抑制靶基因Npro和NS5B的复制能力

各细胞孔在转染后24小时分别用PBS(PH 7.0～7.4)缓冲液冲洗2次，胰酶消化并收集细胞，PBS(PH 7.0～7.4)重悬后加入流式管准备流式细胞术的检测，用激发波长为488nm的光进行检测，以CellQuest软件获取试验数据并进行分析。所有测定均在相同的仪器参数下进行，每个细胞孔收集10000个细胞。

9、结果

经流式细胞仪分析，转染后24 h后，pEX/U6-115孔平均阳性细胞率为18.9%；pEX/U6-207孔平均阳性细胞率为20.1%；pEX/U6-303孔平均阳性细胞率为19.6%；pEGFP+ Npro孔平均阳性细胞率为 60.2%；和pEGFP+ NS5B孔平均阳性细胞率为64.2%；未转染的空白细胞平均阳性率为3%。由此可知表达shRNA的PK-15细胞具有一定的抑制靶基因复制的能力，详见附图10。

序列表

Organization Applicant

----------------------

Street : 兰州市城关区盐场堡徐家坪1号

City : 兰州

State : 甘肃

Country : 中国

PostalCode : 730046

PhoneNumber : 0931-8343385

FaxNumber : 0931-8340977

EmailAddress : hnxiangtaohotmail.com；jingningcaixiong163.com

<110> OrganizationName : 中国农业科学院兰州兽医研究所

Application Project

-------------------

<120> Title : 一种用于抑制猪瘟病毒复制的RNAi及其制备方法

<130> AppFileReference : RNA Interference Targeting VP1 Inhibits Foot-and-Mouth Disease Virus Replication in BHK-21 Cells and Suckling Mice

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Sequence

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<213> OrganismName : Sus scrofa

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caccgcatgc ccaagacaca ccttacgaat aaggtgtgtc ttgggcatgc 50

<212> Type : DNA

<211> Length : 50

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SequenceDescription :

Sequence

--------

<213> OrganismName : Sus scrofa

<400> PreSequenceString :

caccgcatgc ccaagacaca ccttacgaat aaggtgtgtc ttgggcatgc 50

<212> Type : DNA

<211> Length : 50

SequenceName : SEQ ID NO:2

SequenceDescription :

Sequence

--------

<213> OrganismName : Sus scrofa

<400> PreSequenceString :

caccgcccac tattaggcta gtatacgata tactagccta atagtgggc 49

<212> Type : DNA

<211> Length : 49

SequenceName : SEQ ID NO:3

SequenceDescription :

Sequence

--------

<213> OrganismName : Sus scrofa

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aaaagcccac tattaggcta gtatattcga tatactagcc taatagtggg c 51

<212> Type : DNA

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SequenceDescription :

Sequence

--------

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caccgggaga aatacaacca caatccgaag attgtggttg tatttctccc 50

<212> Type : DNA

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SequenceDescription :

Sequence

--------

<213> OrganismName : Sus scrofa

<400> PreSequenceString :

aaaagggaga aatacaacca caatcttcgg attgtggttg tatttctccc 50

<212> Type : DNA

<211> Length : 50

SequenceName : SEQ ID NO:6

SequenceDescription :

Claims

1.一种用于抑制猪瘟病毒复制的RNAi，其特征在于包含siRNA序列、通过构建shRNA慢病毒表达载体，获得复制缺陷型慢病毒，用所述慢病毒感染PK-15细胞，筛选表达shRNA的PK-15细胞克隆并验证其对CSFV的抑制效果。

2.根据权利要求1所述的一种用于抑制猪瘟病毒复制的RNAi，其特征在于所述具有抑制效果的shRNA序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:6，包括：

Npro115: 5’→3’

SEQ ID NO:1：T CACCGCATGCCCAAGACACACCTTACGA

ATAAGGTGTGTCTTGGGCATGC

SEQ ID NO:2：B CACCGCATGCCCAAGACACACCTTACGA

ATAAGGTGTGTCTTGGGCATGC

Npro207: 5’→3’

SEQ ID NO:3：T CACCGCCCACTATTAGGCTAGTATACGA

TATACTAGCCTAATAGTGGGC

SEQ ID NO:4：B AAAAGCCCACTATTAGGCTAGTATATTCG

ATATACTAGCCTAATAGTGGGC

NS5B303: 5’→3’

SEQ ID NO:5：T CACCGGGAGAAATACAACCACAATCCGAA

GATTGTGGTTGTATTTCTCCC

SEQ ID NO:6：B AAAAGGGAGAAATACAACCACAATCTTCG

GATTGTGGTTGTATTTCTCCC。

3.根据权利要求1所述的一种用于抑制猪瘟病毒复制的RNAi，其特征在于所述shRNA表达载体的构建，包括shRNA 克隆载体的构建和表达载体的构建。

4.根据权利要求1所述的一种用于抑制猪瘟病毒复制的RNAi，其特征在于所述完整假病毒的获得是将shRNA表达质粒与Packaging Mix共同转染293-FT细胞，收获细胞上清，获得具有感染性的慢病毒。

5.根据权利要求1所述的一种用于抑制猪瘟病毒复制的RNAi，其特征在于所述用收获复制缺陷型慢病毒感染PK-15细胞，采用灭瘟素blasticidin抗性筛选，获得表达shRNA的PK-15阳性细胞克隆。

6.一种如权利要求1所述RNAi的制备方法，包括以下步骤：

a. 设计并合成shRNA对应的DNA序列—ds oligo；

b. 利用T4 DNA连接酶将ds oligo 克隆进pEN/U6 载体；

c. 转化TOP 10感受态细胞，挑选阳性克隆，测序检验序列的保真性；

d. 将上述pEN/U6-Npro115，pEN/U6-Npro207，pEN/U6-NS5B303三种质粒分别与pDEST载体进行LR重组，获得表达骨架；

e. 获得的表达骨架与Packaging Mix共转染293-FT 细胞，产生复制缺陷型慢病毒粒子；

f．将产生的复制缺陷型慢病毒粒子感染PK-15细胞；

g. blasticidin抗性筛选，获得表达shRNA的PK-15细胞阳性克隆；

h．分别用Real-time RT-PCR、间接免疫荧光及流式细胞术验证抑制效果。