CN104789597A - 一种家蚕质型多角体病毒的体外构建方法 - Google Patents
一种家蚕质型多角体病毒的体外构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104789597A CN104789597A CN201510209183.2A CN201510209183A CN104789597A CN 104789597 A CN104789597 A CN 104789597A CN 201510209183 A CN201510209183 A CN 201510209183A CN 104789597 A CN104789597 A CN 104789597A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- sac
- polyhedrosis virus
- cuts
- carries out
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种家蚕质型多角体病毒的体外构建方法。具体而言，本发明的方法包括下列步骤：1）获得家蚕质型多角体病毒基因组；2）设计并合成引物；3）获得病毒基因组S1至S10片段的cDNA；4）对cDNA进行PCR扩增；5）将扩增产物进行酶切，然后克隆到质粒载体中，获得重组质粒；6）将重组质粒进行酶切、线性化后，经过体外转录，获得RNA；以及7）将RNA等摩尔混合，使用脂质体进行包裹并转染宿主，进而获得体外构建的家蚕质型多角体病毒。本发明的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法不但对家蚕质型多角体病毒基因组各片段的功能研究有促进作用，也可以为重组质型多角体病毒生物杀虫剂的研发提供技术支持。
Description
技术领域
本发明属于病毒基因工程领域，具体涉及一种家蚕质型多角体病毒的体外构建方法。
背景技术
呼肠孤病毒科（Reoviridae）病毒是一类能感染动物、植物以及真菌的双链RNA（dsRNA）病毒。质型多角体病毒（Cytoplasmic polyhedrosis virus，简称CPVs）是呼肠孤病毒科质型多角体病毒属（Cypovirus）中的成员，其基因组由9至11个双链RNA片段组成。CPVs是农林害虫的重要病原，能感染鳞翅目（Lepidoptera）、膜翅目（Hymenoptera）和鞘翅目（Coleoptera）昆虫，在害虫自然种群控制方面发挥重要的作用，是一种极具开发潜力的生物杀虫剂。
根据CPVs基因组dsRNA在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移模式，CPVs可分为20种不同的类型。家蚕质型多角体病毒（Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus，BmCPV）是CPV1型中的典型种，能感染家蚕中肠细胞，导致家蚕发生质型多角体病，进而引起养蚕歉收。家蚕质型多角体病毒基因组由S1至S10共计10个双链RNA片段组成，各个片段的序列业已明确。
通常，获取家蚕质型多角体病毒的方法是从自然发生的或人工感染的患质型多角体病的家蚕中肠中提纯，但这种方法必须利用家蚕这一宿主。另外，家蚕质型多角体病毒的基因组为分节段的双链RNA病毒，利用常规的遗传操作技术难以对家蚕质型多角体病毒基因组进行改造，进而获得重组病毒，从而导致CPVs基因组各片段的功能研究进展缓慢，也无法获得重组CPVs杀虫剂。
到目前为止，未见体外构建家蚕质型多角体病毒的报道。因此，开发家蚕质型多角体病毒基因组双链RNA片段的遗传操作技术，建立家蚕质型多角体病毒的体外构建方法，不但对于家蚕质型多角体病毒基因组各片段的功能研究具有促进作用，而且也可以为重组CPVs生物杀虫剂的研发提供理论指导和技术支撑。
发明内容
针对上述情况，本发明的目的在于提供一种家蚕质型多角体病毒的体外构建方法以及所使用的引物。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下所述：
一种家蚕质型多角体病毒的体外构建方法，其包括下列步骤：
（1）获得家蚕质型多角体病毒基因组；
（2）根据家蚕质型多角体病毒基因组S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10片段的双链RNA的末端序列，设计并合成10对引物：PS1F/PS1R、PS2F/PS2R、PS3F/PS3R、PS4F/PS4R、PS5F/PS5R、PS6F/PS6R、PS7F/PS7R、PS8F/PS8R、PS9F/PS9R、PS10F/PS10R，其中所述引物的编号情况如下：
引物PS1F对应SEQ ID NO:1，引物PS1R对应SEQ ID NO:2，
引物PS2F对应SEQ ID NO:3，引物PS2R对应SEQ ID NO:4，
引物PS3F对应SEQ ID NO:5，引物PS3R对应SEQ ID NO:6，
引物PS4F对应SEQ ID NO:7，引物PS4R对应SEQ ID NO:8，
引物PS5F对应SEQ ID NO:9，引物PS5R对应SEQ ID NO:10，
引物PS6F对应SEQ ID NO:11，引物PS6R对应SEQ ID NO:12，
引物PS7F对应SEQ ID NO:13，引物PS7R对应SEQ ID NO:14，
引物PS8F对应SEQ ID NO:15，引物PS8R对应SEQ ID NO:16，
引物PS9F对应SEQ ID NO:17，引物PS9R对应SEQ ID NO:18，
引物PS10F对应SEQ ID NO:19，引物PS10R对应SEQ ID NO:20，
各个引物的序列如下所示：
| SEQ ID NO:1： | 5'-TTCGAGCTC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAAAGTGTATGTTTATACC-3'； |
| SEQ ID NO:2： | 5'-TATCCGCGGGGCTAACGGTCGTGTATG-3'； |
| SEQ ID NO:3： | 5'-TTCGAGCTC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAAGAGCAGCACTTGTACG-3'； |
| SEQ ID NO:4： | 5'-TATCCGCGGGGCTAACGGTGAACAGCGTA-3'； |
| SEQ ID NO:5： | 5'-TTCGAGCTC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAAAGACACATGACGAGAAACTAATGTAGTAGGAAAAGATGGAAATAAATAGAGCTGA-3'； |
| SEQ ID NO:6： | 5'-TATCCGCGGGGCTAACGGTCGACACATGTTCATGCTCCACGCATGCCAGCATATAGGCTCCTCATCGTGGATGCATAACG-3'； |
| SEQ ID NO:7： | 5'-TTCGGTACC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAATTTCCACCATGTGGC-3'； |
| SEQ ID NO:8： | 5'-TATCCGCGGGGCTAACGTTTCCCACCGC-3'； |
| SEQ ID NO:9： | 5'-TCGAATTTAAAGCTTGGTACC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAATTTCCCCTTACC-3'； |
| SEQ ID NO:10： | 5'-ATAGGCTTACCTTCGAACCGCGGCTAACCATCTCCCCGTG-3'； |
| SEQ ID NO:11： | 5'-TTCGGTACC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAAGATTCCGTAATATCC-3'； |
| SEQ ID NO:12： | 5'-TATCCGCGGGGCTAACGTTGACTCCGC-3'； |
| SEQ ID NO:13： | 5'-TTCGGTACC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAATTTGGTCATAACAGC-3'； |
| SEQ ID NO:14： | 5'-GGCTCTAGAGGCTAACGTTTGGTCACTCCG-3'； |
| SEQ ID NO:15： | 5'-TTCGGTACC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAAAGTCCAGTACTAG-3'； |
| SEQ ID NO:16： | 5'-TATCCGCGGGGCTAACGGTAGTCCGCCGC-3'； |
| SEQ ID NO:17： | 5'-TTCGGTACC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAAATCCCAGGCGTAAACCG-3'； |
| SEQ ID NO:18： | 5'-TATCCGCGGGGCTAACGACCCGAGTGCCC-3'； |
| SEQ ID NO:19： | 5'-TTCGGTACC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAAAAGTCAGTATCTTACCGGC-3'； |
| SEQ ID NO:20： | 5'-TATCCGCGGGGCTAACGGTCAGTCAGTACCGC-3'； |
（3）获得S1至S10片段的cDNA；
（4）分别以步骤（3）中获得的S1至S10片段的cDNA为模板，对应使用步骤（2）中合成的10对引物进行PCR扩增，获得S1至 S10片段全长cDNA的扩增产物；
（5）将步骤（4）中获得的S1至S10片段全长cDNA的扩增产物分别使用限制性内切酶进行酶切，然后克隆到质粒载体中，获得分别带有S1至S10片段全长cDNA的重组质粒pT-S1、pT-S2、pT-S3、pT-S4、pT-S5、pT-S6、pT-S7、pT-S8、pT-S9、pT-S10，其中所述限制性内切酶的使用情况如下：
S1片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；
S2片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；
S3片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；
S4片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S5片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S6片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S7片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和XbaI进行酶切；
S8片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S9片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S10片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
（6）将步骤（5）中获得的pT-S1至pT-S10重组质粒分别使用限制性内切酶进行酶切、线性化后，作为模板备用，经过体外转录，获得S1至S10片段的RNA，其中所述限制性内切酶的使用情况如下：
重组质粒pT-S1用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S2用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S3用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S4用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S5用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S6用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S7用XbaI进行酶切；
重组质粒pT-S8用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S9用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S10用SacII进行酶切；
（7）将步骤（6）中获得的S1至S10片段的RNA等摩尔混合，使用脂质体进行包裹并转染宿主，待观察到宿主的细胞质内形成大量多角体时，收集细胞并破碎，离心纯化，获得体外构建的家蚕质型多角体病毒。
优选的，在上述技术方案中，步骤（1）中所述家蚕质型多角体病毒基因组的获得可以采用实验室提取或者商业购买的方法来实现。在实验室提取的情况下，可以从家蚕质型多角体病毒粒子中提取病毒基因组，也可以从家蚕质型多角体中提取病毒基因组，优选从家蚕质型多角体中提取病毒基因组。
优选的，在上述技术方案中，步骤（2）中所述引物中的10条上游引物PS1F至PS10F具有如下特征：5’端依次带有以下划线表示的限制性内切酶的酶切位点和以粗斜体表示的T7启动子序列；所述引物中的10条下游引物PS1R至PS10R具有如下特征：5’端带有以下划线表示的限制性内切酶的酶切位点。
优选的，在上述实施方案中，步骤（3）中所述S1至S10片段的cDNA的获得可以采用基于RNA序列的全人工合成或反转录的方法来实现。
优选的，在上述实施方案中，在反转录的情况下，将步骤（1）中获得的家蚕质型多角体病毒基因组于100℃煮沸10分钟，再冰浴2分钟后，作为模板备用，分别使用步骤（2）中合成的引物PS1R、PS2R、PS3R、PS4R、PS5R、PS6R、PS7R、PS8R、PS9R、PS10R进行反转录，对应获得S1至S10片段的cDNA。
优选的，在上述技术方案中，在反转录的情况下，步骤（1）中获得的家蚕质型多角体病毒基因组可以通过琼脂糖凝胶电泳分离并从琼脂糖凝胶中回收S1至S10双链RNA片段后，再经煮沸10分钟，冰浴2分钟后，作为模板备用。
优选的，在上述技术方案中，步骤（5）中所述质粒载体可以选用pIZT-V5/His载体（Invitrogen公司）、pUC系列载体（TAKATA公司）或pBlueScript SK II载体（Novagen公司），优选pIZT-V5/His载体。
优选的，在上述技术方案中，步骤（6）中用于体外转录的模板可以是步骤（5）中获得的重组质粒pT-S1至pT-S10，也可以是以步骤（5）中获得的重组质粒pT-S1至pT-S10为模板，对应使用步骤（2）中合成的10对引物进行PCR扩增后获得的扩增产物。
优选的，在上述技术方案中，步骤（6）中所述体外转录可以通过使用mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit（Ambion公司）来实现。
优选的，在上述技术方案中，步骤（7）中所述脂质体优选使用Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）。
优选的，在上述技术方案中，步骤（7）中所述宿主可以是家蚕或家蚕培养细胞，所述家蚕培养细胞优选使用家蚕BmN培养细胞。
另一方面，本发明请求保护用于上述构建方法的10对引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:20所示。
由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
1、常规获取家蚕质型多角体病毒的方法是从自然发生的或人工感染的患质型多角体病的家蚕中肠中提纯，但这种方法必须利用家蚕这一宿主，本发明则可以通过体外转录的病毒RNA转染培养细胞而获得；
2、常规方法难以通过遗传操作对家蚕质型多角体病毒基因组进行改造，进而获得重组病毒，而采用本发明中所记载的方法可以通过体外遗传操作来实现对家蚕质型多角体病毒基因组的改变，获得人们所需的重组病毒。
附图说明
图1为实施例一中在家蚕培养细胞中形成的家蚕质型多角体病毒的显微镜像图。
图2为实施例一中家蚕质型多角体病毒感染的家蚕培养细胞的western blotting鉴定电泳图，其中泳道1代表普通家蚕培养细胞，泳道2代表体外构建的家蚕质型多角体病毒感染的家蚕培养细胞，泳道3代表野生型家蚕质型多角体病毒感染的家蚕培养细胞。
具体实施方式
下面将结合附图及具体实施例对本发明做出进一步的描述。
实施例一：家蚕质型多角体病毒的体外构建及性能检测。
1、病毒的体外构建：
（1）提取家蚕质型多角体病毒基因组：
收集家蚕质型多角体病病蚕的中肠组织，按照1g中肠组织：10mL双蒸水的比例添加双蒸水（自制，成都超纯科技有限公司，UPT-Ⅲ-5T超纯水机），匀浆后用沙布过滤，滤液通过CF15D2型离心机（日本KuBoTa公司）差速离心，获得纯净的家蚕质型多角体；将纯净的家蚕质型多角体加水悬浮，调节浓度至每mL水中至少含有108个多角体；取多角体悬浮液0.5mL，加入等体积的Tris平衡酚（北京索莱宝科技有限公司），在QL-901型振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）上振荡混匀5min，在12000rpm的转速下于4℃离心10min；取上清液，加入等体积的Tris平衡酚，振荡混匀5min，在12000rpm的转速下于4℃离心10min；取上清液，加入等体积的氯仿（江苏强盛功能化学股份有限公司），振荡混匀5min，在12000rpm的转速下于4℃离心10min；取上清液，加入1/10体积的浓度为3mol/L的醋酸钠水溶液（自制，上海国药集团化学试剂有限公司）和2~2.5倍体积的-20℃预冷的99%乙醇（江苏强盛功能化学股份有限公司），振荡混匀后于-20℃放置30min，在12000rpm的转速下于4℃离心10min，弃去上清液，沉淀用75%乙醇（江苏强盛功能化学股份有限公司）洗涤后，用50μL双蒸水溶解，得到家蚕质型多角体病毒基因组，于-20℃冻存备用。
（2）引物的设计与合成：
根据家蚕质型多角体病毒基因组S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10片段的双链RNA的末端序列（在GenBank中的登录号分别为GU323605、GQ924586、GQ924587、GU323606、GQ294468、GQ294469、GQ150538、GQ150539、GQ924588、GQ924589），设计并合成以下引物：
PS1F（SEQ ID NO:1）：TTCGAGCTC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAAAGTGTATGTTTATACC，下划线表示SacI酶切位点，粗斜体表示T7启动子序列；
PS1R（SEQ ID NO:2）：TATCCGCGGGGCTAACGGTCGTGTATG，下划线表示SacII酶切位点；
PS2F（SEQ ID NO:3）： TTCGAGCTC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAAGAGCAGCACTTGTACG，下划线表示SacI酶切位点，粗斜体表示T7启动子序列；
PS2R（SEQ ID NO:4）：TATCCGCGGGGCTAACGGTGAACAGCGTA，下划线表示SacII酶切位点；
PS3F（SEQ ID NO:5）：TTCGAGCTC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAAAGACACATGACGAGAAACTAATGTAGTAGGAAAAGATGGAAATAAATAGAGCTGA，下划线表示SacI酶切位点，粗斜体表示T7启动子序列；
PS3R（SEQ ID NO:6）：TATCCGCGGGGCTAACGGTCGACACATGTTCATGCTCCACGCATGCCAGCATATAGGCTCCTCATCGTGGATGCATAACG，下划线表示SacII酶切位点；
PS4F（SEQ ID NO:7）：TTCGGTACC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAATTTCCACCATGTGGC，下划线表示KpnI酶切位点，粗斜体表示T7启动子序列；
PS4R（SEQ ID NO:8）：TATCCGCGGGGCTAACGTTTCCCACCGC，下划线表示SacII酶切位点；
PS5F（SEQ ID NO:9）：TCGAATTTAAAGCTTGGTACC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAATTTCCCCTTACC，下划线表示KpnI酶切位点，粗斜体表示T7启动子序列；
PS5R（SEQ ID NO:10）：ATAGGCTTACCTTCGAACCGCGGCTAACCATCTCCCCGTG，下划线表示SacII酶切位点；
PS6F（SEQ ID NO:11）：TTCGGTACC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAAGATTCCGTAATATCC，下划线表示KpnI酶切位点，粗斜体表示T7启动子序列；
PS6R（SEQ ID NO:12）：TATCCGCGGGGCTAACGTTGACTCCGC，下划线表示SacII酶切位点；
PS7F（SEQ ID NO:13）：TTCGGTACC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAATTTGGTCATAACAGC，下划线表示KpnI酶切位点，粗斜体表示T7启动子序列；
PS7R（SEQ ID NO:14）：GGCTCTAGAGGCTAACGTTTGGTCACTCCG，下划线表示XbaI酶切位点；
PS8F（SEQ ID NO:15）：TTCGGTACC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAAAGTCCAGTACTAG，下划线表示KpnI酶切位点，粗斜体表示T7启动子序列；
PS8R（SEQ ID NO:16）：TATCCGCGGGGCTAACGGTAGTCCGCCGC，下划线表示SacII酶切位点；
PS9F（SEQ ID NO:17）：TTCGGTACC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAAATCCCAGGCGTAAACCG，下划线表示KpnI酶切位点，粗斜体表示T7启动子序列；
PS9R（SEQ ID NO:18）：TATCCGCGGGGCTAACGACCCGAGTGCCC，下划线表示SacII酶切位点；
PS10F（SEQ ID NO:19）：TTCGGTACC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAAAAGTCAGTATCTTACCGGC，下划线表示KpnI酶切位点，粗斜体表示T7启动子序列；
PS10R（SEQ ID NO:20）：TATCCGCGGGGCTAACGGTCAGTCAGTACCGC，下划线表示SacII酶切位点。
上述引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
（3）反转录获得S1至S10片段的cDNA：
取20μL步骤（1）中的家蚕质型多角体病毒基因组，于100℃煮沸10min，然后冰浴2min，取1μL作为模板，分别利用步骤（2）中的引物PS1R、PS2R、PS3R、PS4R、PS5R、PS6R、PS7R、PS8R、PS9R、PS10R，采用反转录试剂盒（Transcriptor Reverse Transcriptase，瑞士罗氏公司）按照产品说明书进行反转录，获得S1至S10片段的cDNA。反转录体系如下：家蚕质型多角体病毒基因组RNA 1μL、各片段下游引物1μL、RNase-free H2O 11μL，先65℃ 10min，冰上放置5min，依次加入5×Reaction Buffer 4μL、RT Enzyme 0.5μL、10×dNTP 2μL，55℃ 30min后85℃ 5min。
（4）PCR扩增S1至S10片段全长cDNA：
分别以1μL的步骤（3）中的S1至S10片段的cDNA作为模板，对应使用步骤（2）中合成的引物对进行PCR扩增，即S1片段的cDNA用引物对PS1F/PS1R扩增，以此类推。PCR扩增条件如下：94℃预变性4min，94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸1~5min，72℃再延伸10min，反应为35个循环。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测后，采用DNA凝胶回收试剂盒按照产品说明书回收扩增产物。
（5）重组质粒的构建：
取步骤（4）中获得的PCR扩增产物，分别使用限制性内切酶进行酶切，其中：
S1片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；
S2片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；
S3片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；
S4片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S5片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S6片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S7片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和XbaI进行酶切；
S8片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S9片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S10片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切。
使用上述限制性内切酶对S1至S10片段全长cDNA的扩增产物进行酶切，酶切体系为：片段全长cDNA 8μL、kpnI Buffer 2μL，kpnI 1μL、SacII或XbaI 1μL、无菌水8μL，酶切条件为：37℃ 3h。将上述酶切产物与使用kpnI和SacII或kpnI和XbaI进行酶切后的pIZT-V5/His载体（Invitrogen公司产品）连接，然后将连接产物转化至大肠杆菌。取阳性克隆，送上海生工生物工程股份有限公司测序验证后，获得序列正确的重组质粒pT-S1、pT-S2、pT-S3、pT-S4、pT-S5、pT-S6、pT-S7、pT-S8、pT-S9、pT-S10。
（6）体外转录：
取步骤（5）中的重组质粒pT-S1至pT-S10，使用限制性内切酶进行酶切、线性化，其中所述限制性内切酶的使用情况如下：
重组质粒pT-S1用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S2用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S3用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S4用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S5用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S6用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S7用XbaI进行酶切；
重组质粒pT-S8用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S9用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S10用SacII进行酶切。
将各个酶切产物分别用Tris平衡酚（北京索莱宝科技有限公司）、氯仿（江苏强盛功能化学股份有限公司）抽提后，再用乙醇（江苏强盛功能化学股份有限公司）沉淀DNA，沉淀的DNA用20μL双蒸水溶解。分别以上述酶切产物为模板，用mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit（Ambion公司）按照产品说明书进行体外转录，方法如下：按RNase-free H2O 8μL、2×NTP/CAP 4μL、10×Rxn. Buffer 2μL、模板4μL、Enzyme Mix 2μL依次加样；上下颠倒混匀，点甩离心，37℃ 1-2h；70℃灭活酶，点甩离心。体外转录产物用无RNase的DNA酶消化，以便去除DNA模板，用乙醇沉淀体外转录的RNA，并用紫外分光光度计（美国Picodrop公司，Pico200）测定RNA的浓度。
（7）获得体外构建的家蚕质型多角体病毒：
将步骤（6）中的S1至S10片段的RNA等摩尔混合，取含有10μg总RNA的混合物，用10μL脂质体Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）包裹并转染至家蚕BmN培养细胞，于27℃培养1周后，可观察到细胞质内形成的大量多角体；收集细胞并破碎，离心纯化，获得体外构建的家蚕质型多角体病毒，其在显微镜下的图像如图1所示，其中箭头所指的对象代表家蚕质型多角体病毒。
2、病毒的性能检测：
将体外构建的家蚕质型多角体病毒转接至正常的家蚕培养细胞，收集发病细胞后，通过胶浓度为10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分离，采用一抗为BmCPV病毒粒子抗血清，二抗为HRP-标记的兔抗鼠IgG进行Western blotting检测（如图2所示），可检测到不同分子量的病毒结构蛋白，说明体外构建的家蚕质型多角体病毒具有复制表达能力。
实施例二：家蚕质型多角体病毒的体外构建。
1、提取家蚕质型多角体病毒基因组：同实施例一中的步骤（1）。
2、引物的设计与合成：同实施例一中的步骤（2）。
3、反转录获得S1至S10片段的cDNA：同实施例一中的步骤（3）。
4、PCR扩增S1至S10片段全长cDNA：同实施例一中的步骤（4）。
5、体外转录：分别取步骤4中的PCR扩增S1至S10片段全长cDNA 为模板，用mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit（Ambion公司）按照产品说明书进行体外转录，体外转录产物用无RNase的DNA酶消化，以便去除DNA模板，用乙醇沉淀体外转录的RNA，并用紫外分光光度计测定RNA的浓度。
6、获得体外构建的家蚕质型多角体病毒：同实施例一中的步骤（7）。
实施例三：家蚕质型多角体病毒的体外构建。
（1）提取家蚕质型多角体病毒基因组：同实施例一中的步骤（1）。
（2）引物的设计与合成：同实施例一中的步骤（2）。
（3）反转录获得S1至S10片段的cDNA：同实施例一中的步骤（3）。
（4）PCR扩增S1至S10片段全长cDNA：同实施例一中的步骤（4）。
（5）重组质粒的构建：同实施例一中的步骤（5）。
（6）体外转录：以步骤（5）中获得的重组质粒pT-S1至pT-S10为模板，对应使用步骤（2）中合成的10对引物进行PCR扩增，即重组质粒pT-S1用引物对PS1F/PS1R扩增，以此类推。分别以各个扩增产物为体外转录模板，用mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit（Ambion公司）按照产品说明书进行体外转录，体外转录产物用无RNase的DNA酶消化，以便去除DNA模板，用乙醇沉淀体外转录的RNA，紫外分光光度计测定RNA的浓度，获得S1至S10片段的RNA。
7、获得体外构建的家蚕质型多角体病毒：同实施例一中的步骤（7）。
Claims (10)
1.一种家蚕质型多角体病毒的体外构建方法，其包括下列步骤：
1）获得家蚕质型多角体病毒基因组；
2）根据家蚕质型多角体病毒基因组S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10片段的双链RNA的末端序列，设计并合成10对引物：PS1F/PS1R、PS2F/PS2R、PS3F/PS3R、PS4F/PS4R、PS5F/PS5R、PS6F/PS6R、PS7F/PS7R、PS8F/PS8R、PS9F/PS9R、PS10F/PS10R，其中所述引物的编号情况如下：
引物PS1F对应SEQ ID NO:1，引物PS1R对应SEQ ID NO:2，
引物PS2F对应SEQ ID NO:3，引物PS2R对应SEQ ID NO:4，
引物PS3F对应SEQ ID NO:5，引物PS3R对应SEQ ID NO:6，
引物PS4F对应SEQ ID NO:7，引物PS4R对应SEQ ID NO:8，
引物PS5F对应SEQ ID NO:9，引物PS5R对应SEQ ID NO:10，
引物PS6F对应SEQ ID NO:11，引物PS6R对应SEQ ID NO:12，
引物PS7F对应SEQ ID NO:13，引物PS7R对应SEQ ID NO:14，
引物PS8F对应SEQ ID NO:15，引物PS8R对应SEQ ID NO:16，
引物PS9F对应SEQ ID NO:17，引物PS9R对应SEQ ID NO:18，
引物PS10F对应SEQ ID NO:19，引物PS10R对应SEQ ID NO:20，
所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:20所示；
3）获得S1至S10片段的cDNA；
4）分别以步骤3）中获得的S1至S10片段的cDNA为模板，对应使用步骤2）中合成的10对引物进行PCR扩增，获得S1至S10片段全长cDNA的扩增产物；
5）将步骤4）中获得的S1至S10片段全长cDNA的扩增产物分别使用限制性内切酶进行酶切，然后克隆到质粒载体中，获得分别带有S1至S10片段全长cDNA的重组质粒pT-S1、pT-S2、pT-S3、pT-S4、pT-S5、pT-S6、pT-S7、pT-S8、pT-S9、pT-S10，其中所述限制性内切酶的使用情况如下：
S1片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；
S2片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；
S3片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；
S4片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S5片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S6片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S7片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和XbaI进行酶切；
S8片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S9片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S10片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
6）将步骤5）中获得的pT-S1至pT-S10重组质粒分别使用限制性内切酶进行酶切、线性化后，作为模板备用，经过体外转录，获得S1至S10片段的RNA，其中所述限制性内切酶的使用情况如下：
重组质粒pT-S1用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S2用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S3用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S4用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S5用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S6用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S7用XbaI进行酶切；
重组质粒pT-S8用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S9用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S10用SacII进行酶切；
7）将步骤6）中获得的S1至S10片段的RNA等摩尔混合，使用脂质体进行包裹并转染宿主，待观察到宿主的细胞质内形成大量多角体时，收集细胞并破碎，离心纯化，获得体外构建的家蚕质型多角体病毒。
2.根据权利要求1所述的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法，其特征在于，步骤1）中所述家蚕质型多角体病毒基因组的获得采用实验室提取或者商业购买的方法来实现。
3.根据权利要求2所述的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法，其特征在于，在实验室提取的情况下，从家蚕质型多角体病毒粒子或家蚕质型多角体中提取病毒基因组，优选从家蚕质型多角体中提取病毒基因组。
4.根据权利要求1所述的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法，其特征在于，步骤3）中所述S1至S10片段的cDNA的获得采用基于RNA序列的全人工合成或反转录的方法来实现。
5.根据权利要求4所述的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法，其特征在于，在反转录的情况下，将步骤1）中获得的家蚕质型多角体病毒基因组于100℃煮沸10分钟，再冰浴2分钟后，作为模板备用，分别使用步骤2）中合成的引物PS1R、PS2R、PS3R、PS4R、PS5R、PS6R、PS7R、PS8R、PS9R、PS10R进行反转录，对应获得S1至S10片段的cDNA。
6.根据权利要求1所述的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法，其特征在于，步骤5）中所述质粒载体选自pIZT-V5/His载体、pUC系列载体、pBlueScript SK II载体中的任意一种，优选pIZT-V5/His载体。
7.根据权利要求1所述的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法，其特征在于，步骤6）中用于体外转录的模板是步骤5）中获得的重组质粒pT-S1至pT-S10或者是以步骤5）中获得的重组质粒pT-S1至pT-S10为模板，对应使用步骤2）中合成的10对引物进行PCR扩增后获得的扩增产物。
8.根据权利要求1所述的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法，其特征在于，步骤7）中所述脂质体为Lipofectamine 2000。
9.根据权利要求1所述的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法，其特征在于，步骤7）中所述宿主是家蚕或家蚕培养细胞，优选家蚕培养细胞，更优选家蚕BmN培养细胞。
10.用于上述权利要求中任一项所述的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法的10对引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:20所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510209183.2A CN104789597B (zh) | 2015-04-28 | 2015-04-28 | 一种家蚕质型多角体病毒的体外构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510209183.2A CN104789597B (zh) | 2015-04-28 | 2015-04-28 | 一种家蚕质型多角体病毒的体外构建方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104789597A true CN104789597A (zh) | 2015-07-22 |
| CN104789597B CN104789597B (zh) | 2018-03-30 |
Family
ID=53554789
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510209183.2A Active CN104789597B (zh) | 2015-04-28 | 2015-04-28 | 一种家蚕质型多角体病毒的体外构建方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104789597B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106834352A (zh) * | 2017-02-27 | 2017-06-13 | 苏州大学 | 基于杆状病毒表达系统制备包裹鲤疱疹病毒ii型抗原的多角体的方法 |
| CN108660157A (zh) * | 2018-05-30 | 2018-10-16 | 苏州大学 | 一种基于dna载体的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法 |
| CN112469281A (zh) * | 2018-05-15 | 2021-03-09 | 旗舰创业创新六公司 | 有害生物防治组合物及其用途 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2512085A1 (en) * | 2003-01-10 | 2004-07-29 | Protein Crystal Co., Ltd. | Protein complex, process for producing the same and use thereof |
| CN1673379A (zh) * | 2005-01-25 | 2005-09-28 | 苏州大学 | 改造重组家蚕核型多角体病毒的基因工程载体的构建方法 |
-
2015
- 2015-04-28 CN CN201510209183.2A patent/CN104789597B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2512085A1 (en) * | 2003-01-10 | 2004-07-29 | Protein Crystal Co., Ltd. | Protein complex, process for producing the same and use thereof |
| CN1673379A (zh) * | 2005-01-25 | 2005-09-28 | 苏州大学 | 改造重组家蚕核型多角体病毒的基因工程载体的构建方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| LUC SWEVERS ET AL: "Transfection of BmCPV genomic dsRNA in silkmoth-derived Bm5 cells: Stability and interactions with the core RNAi machinery", 《JOURNAL OF INSECT PHYSIOLOGY》 * |
| 孟祥坤等: "家蚕质型多角体病毒(苏州株)全基因组序列特征", 《全国家蚕病害控制技术与安全养蚕模式学术研讨会论文集》 * |
| 张轶岭等: "BmCPV 多角体蛋白对异源蛋白的包埋", 《蚕业科学》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106834352A (zh) * | 2017-02-27 | 2017-06-13 | 苏州大学 | 基于杆状病毒表达系统制备包裹鲤疱疹病毒ii型抗原的多角体的方法 |
| CN106834352B (zh) * | 2017-02-27 | 2020-06-16 | 苏州大学 | 基于杆状病毒表达系统制备包裹鲤疱疹病毒ii型抗原的多角体的方法 |
| CN112469281A (zh) * | 2018-05-15 | 2021-03-09 | 旗舰创业创新六公司 | 有害生物防治组合物及其用途 |
| CN108660157A (zh) * | 2018-05-30 | 2018-10-16 | 苏州大学 | 一种基于dna载体的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法 |
| CN108660157B (zh) * | 2018-05-30 | 2020-12-04 | 苏州大学 | 一种基于dna载体的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104789597B (zh) | 2018-03-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Han et al. | Identification of diverse bat alphacoronaviruses and betacoronaviruses in China provides new insights into the evolution and origin of coronavirus-related diseases | |
| Chiba et al. | A novel bipartite double-stranded RNA mycovirus from the white root rot fungus Rosellinia necatrix: molecular and biological characterization, taxonomic considerations, and potential for biological control | |
| Chen et al. | Comparative genomic analysis of classical and variant virulent parental/attenuated strains of porcine epidemic diarrhea virus | |
| Kholodilov et al. | Isolation and characterisation of Alongshan virus in Russia | |
| Satyanarayana et al. | Closterovirus bipolar virion: evidence for initiation of assembly by minor coat protein and its restriction to the genomic RNA 5′ region | |
| Xin et al. | Two negative-strand RNA viruses identified in watermelon represent a novel clade in the order Bunyavirales | |
| Guo et al. | Identification and genomic characterization of a novel CRESS DNA virus from a calf with severe hemorrhagic enteritis in China | |
| Katsuma et al. | Novel macula-like virus identified in Bombyx mori cultured cells | |
| Khalifa et al. | A mechanically transmitted DNA mycovirus is targeted by the defence machinery of its host, Botrytis cinerea | |
| CN103667297B (zh) | 一种用于抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的1010shRNA及其制备方法 | |
| Chirkov et al. | Occurrence and characterization of plum pox virus strain D isolates from European Russia and Crimea | |
| CN101864445A (zh) | 携带分子标记的猪瘟病毒感染性cDNA载体的构建方法 | |
| CN104789597A (zh) | 一种家蚕质型多角体病毒的体外构建方法 | |
| Shafik et al. | Characterization of a novel mitovirus infecting Melanconiella theae isolated from tea plants | |
| Guo et al. | Molecular characteristics of jujube yellow mottle-associated virus infecting jujube (Ziziphus jujuba Mill.) grown at Aksu in Xinjiang of China | |
| CN104789598A (zh) | 一种表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒的构建方法 | |
| CN103725682A (zh) | 用于敲低err表达的小分子干扰rna、重组载体及其应用 | |
| Wijayawardene et al. | Fungi associated with dead branches of Magnolia grandiflora: A case study from Qujing, China | |
| CN101225395A (zh) | 亚洲一型口蹄疫病毒感染性cDNA及其构建方法 | |
| Ghosh et al. | Molecular characterization of rare bovine group A rotavirus G15P [11] and G15P [21] strains from eastern India: identification of simian SA11-like VP6 genes in G15P [21] strains | |
| Liu et al. | Construction of Baculovirus-Inducible CRISPR/Cas9 Antiviral System Targeting BmNPV in Bombyx mori | |
| Hasiów-Jaroszewska et al. | Infectious RNA transcripts derived from cloned cDNA of a Pepino mosaic virus isolate | |
| Wang et al. | Discovery and characterization of a novel ampelovirus on firespike | |
| Xie et al. | Identification and characterization of two novel noda-like viruses from rice plants showing the dwarfing symptom | |
| CN103695427A (zh) | 用于敲低vps11的小分子干扰rna、重组载体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |