CN104789598A - 一种表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒的构建方法 - Google Patents
一种表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒的构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒的构建方法。具体而言，本发明的方法包括下列步骤：1）获得病毒基因组；2）设计并合成引物；3）获得病毒基因组的cDNA；4）对cDNA进行PCR扩增；5）将扩增产物进行酶切，获得重组质粒；6）将重组质粒pT-S1至pT-S9进行酶切，体外转录获得对应的RNA；7）构建带有红色荧光蛋白基因的重组质粒pT-S10-DsRed并获得S10-DsRed RNA；以及8）将上述RNA等摩尔混合，包裹并转染宿主，进而获得病毒。利用本发明建立的方法可以在家蚕细胞中表达红色荧光蛋白，进而有可能获得人们所需的重组质型多角体病毒生物杀虫剂。
Description
技术领域
本发明属于病毒基因工程领域，具体涉及一种表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒的构建方法。
背景技术
呼肠孤病毒科（Reoviridae）病毒是一类能感染动物、植物以及真菌的双链RNA（dsRNA）病毒。质型多角体病毒（Cytoplasmic polyhedrosis virus，简称CPVs）是呼肠孤病毒科质型多角体病毒属（Cypovirus）中的成员，其基因组由9至11个双链RNA片段组成。CPVs是农林害虫的重要病原，能感染鳞翅目（Lepidoptera）、膜翅目（Hymenoptera）和鞘翅目（Coleoptera）昆虫，在害虫自然种群控制方面发挥重要的作用，是一种极具开发潜力的生物杀虫剂。
根据CPVs基因组dsRNA在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移模式，CPVs可分为20种不同的类型。家蚕细胞质型多角体病毒（Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus，BmCPV）是CPV1型中的典型种。
DsRed基因编码的红色荧光蛋白（DsRed）由225个氨基酸组成，相对分子质量为25.9ku。它的一级结构与绿色荧光蛋白（GFP）的同源性很低（仅为23%），但它们的二级结构很相似。与GFP相比，红色荧光蛋白（DsRed）的激发和发射波长较长，其发射峰位于培养基、组织培养器材及细胞成分等产生的荧光背景范围之外，具有较高的信噪比，而且在细胞内荧光转换效率高，更易检测。
由于家蚕细胞质型多角体病毒基因组由S1至S10共计10个双链RNA片段组成，常规方法难以通过遗传操作来构建重组家蚕质型多角体病毒表达外源基因。至目前为止，未见体外构建重组家蚕质型多角体病毒表达外源基因的报道，也未见构建其他重组质型多角体病毒表达外源基因的报道。因此，开发一种重组质型多角体病毒表达外源基因的构建方法将会弥补现有技术中的空白，将会为今后的科研及开发提供强有力的技术支持。
发明内容
针对上述情况，本发明的目的在于提供一种表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒的构建方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下所述：
一种表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒的构建方法，其包括下列步骤：
（1）获得家蚕质型多角体病毒基因组；
（2）根据家蚕质型多角体病毒基因组S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10片段的双链RNA的末端序列，设计并合成10对引物：PS1F/PS1R、PS2F/PS2R、PS3F/PS3R、PS4F/PS4R、PS5F/PS5R、PS6F/PS6R、PS7F/PS7R、PS8F/PS8R、PS9F/PS9R、PS10F/PS10R，其中所述引物的编号情况如下：
引物PS1F对应SEQ ID NO:1，引物PS1R对应SEQ ID NO:2，
引物PS2F对应SEQ ID NO:3，引物PS2R对应SEQ ID NO:4，
引物PS3F对应SEQ ID NO:5，引物PS3R对应SEQ ID NO:6，
引物PS4F对应SEQ ID NO:7，引物PS4R对应SEQ ID NO:8，
引物PS5F对应SEQ ID NO:9，引物PS5R对应SEQ ID NO:10，
引物PS6F对应SEQ ID NO:11，引物PS6R对应SEQ ID NO:12，
引物PS7F对应SEQ ID NO:13，引物PS7R对应SEQ ID NO:14，
引物PS8F对应SEQ ID NO:15，引物PS8R对应SEQ ID NO:16，
引物PS9F对应SEQ ID NO:17，引物PS9R对应SEQ ID NO:18，
引物PS10F对应SEQ ID NO:19，引物PS10R对应SEQ ID NO:20，
各个引物的序列如下所示：
| SEQ ID NO:1： | 5'-TTCGAGCTC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAAAGTGTATGTTTATACC-3'； |
| SEQ ID NO:2： | 5'-TATCCGCGGGGCTAACGGTCGTGTATG-3'； |
| SEQ ID NO:3： | 5'-TTCGAGCTC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAAGAGCAGCACTTGTACG-3'； |
| SEQ ID NO:4： | 5'-TATCCGCGGGGCTAACGGTGAACAGCGTA-3'； |
| SEQ ID NO:5： | 5'-TTCGAGCTC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAAAGACACATGACGAGAAACTAATGTAGTAGGAAAAGATGGAAATAAATAGAGCTGA-3'； |
| SEQ ID NO:6： | 5'-TATCCGCGGGGCTAACGGTCGACACATGTTCATGCTCCACGCATGCCAGCATATAGGCTCCTCATCGTGGATGCATAACG-3'； |
| SEQ ID NO:7： | 5'-TTCGGTACC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAATTTCCACCATGTGGC-3'； |
| SEQ ID NO:8： | 5'-TATCCGCGGGGCTAACGTTTCCCACCGC-3'； |
| SEQ ID NO:9： | 5'-TCGAATTTAAAGCTTGGTACC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAATTTCCCCTTACC-3'； |
| SEQ ID NO:10： | 5'-ATAGGCTTACCTTCGAACCGCGGCTAACCATCTCCCCGTG-3'； |
| SEQ ID NO:11： | 5'-TTCGGTACC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAAGATTCCGTAATATCC-3'； |
| SEQ ID NO:12： | 5'-TATCCGCGGGGCTAACGTTGACTCCGC-3'； |
| SEQ ID NO:13： | 5'-TTCGGTACC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAATTTGGTCATAACAGC-3'； |
| SEQ ID NO:14： | 5'-GGCTCTAGAGGCTAACGTTTGGTCACTCCG-3'； |
| SEQ ID NO:15： | 5'-TTCGGTACC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAAAGTCCAGTACTAG-3'； |
| SEQ ID NO:16： | 5'-TATCCGCGGGGCTAACGGTAGTCCGCCGC-3'； |
| SEQ ID NO:17： | 5'-TTCGGTACC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAAATCCCAGGCGTAAACCG-3'； |
| SEQ ID NO:18： | 5'-TATCCGCGGGGCTAACGACCCGAGTGCCC-3'； |
| SEQ ID NO:19： | 5'-TTCGGTACC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAAAAGTCAGTATCTTACCGGC-3'； |
| SEQ ID NO:20： | 5'-TATCCGCGGGGCTAACGGTCAGTCAGTACCGC-3'； |
（3）获得S1至S10片段的cDNA；
（4）分别以步骤（3）中获得的S1至S10片段的cDNA为模板，对应使用步骤（2）中合成的10对引物进行PCR扩增，获得S1至S10片段全长cDNA的扩增产物；
（5）将步骤（4）中获得的S1至S10片段全长cDNA的扩增产物分别使用限制性内切酶进行酶切，然后克隆到质粒载体中，获得分别带有S1至S10片段全长cDNA的重组质粒pT-S1、pT-S2、pT-S3、pT-S4、pT-S5、pT-S6、pT-S7、pT-S8、pT-S9、pT-S10，其中所述限制性内切酶的使用情况如下：
S1片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；
S2片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；
S3片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；
S4片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S5片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S6片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S7片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和XbaI进行酶切；
S8片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S9片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S10片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
（6）将步骤（5）中获得的pT-S1至pT-S9重组质粒分别使用限制性内切酶进行酶切、线性化后，作为模板备用，经过体外转录，获得S1至S9片段的RNA，其中所述限制性内切酶的使用情况如下：
重组质粒pT-S1用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S2用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S3用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S4用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S5用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S6用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S7用XbaI进行酶切；
重组质粒pT-S8用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S9用SacII进行酶切；
（7）构建带有红色荧光蛋白基因的重组质粒pT-S10-DsRed，将其进行酶切、线性化后，作为模板备用，经过体外转录，获得S10-DsRed RNA，其中所述红色荧光蛋白基因的5'端带有对应于家蚕质型多角体病毒基因组S10片段的5'非编码区的cDNA序列、3'端带有对应于S10片段的3'非编码区的cDNA序列，所述重组质粒pT-S10-DsRed用SacII进行酶切；
（8）将步骤（6）中获得的S1至S9片段的RNA及步骤（7）中获得的S10-DsRed RNA等摩尔混合，使用脂质体进行包裹并转染宿主，待观察到宿主的细胞内发出红色荧光时，收集细胞并粉碎，离心纯化，获得表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒。
优选的，在上述技术方案中，步骤（1）中所述家蚕质型多角体病毒基因组的获得可以采用实验室提取或者商业购买的方法来实现。在实验室提取的情况下，可以从家蚕质型多角体病毒粒子中提取病毒基因组，也可以从家蚕质型多角体中提取病毒基因组，优选从家蚕质型多角体中提取病毒基因组。
优选的，在上述技术方案中，步骤（2）中所述引物中的10条上游引物PS1F至PS10F具有如下特征：5’端依次带有以下划线表示的限制性内切酶的酶切位点和以粗斜体表示的T7启动子序列；所述引物中的10条下游引物PS1R至PS10R具有如下特征：5’端带有以下划线表示的限制性内切酶的酶切位点。
优选的，在上述实施方案中，步骤（3）中所述S1至S10片段的cDNA的获得可以采用基于RNA序列的全人工合成或反转录的方法来实现。
优选的，在上述实施方案中，在反转录的情况下，将步骤（1）中获得的家蚕质型多角体病毒基因组于100℃煮沸10分钟，再冰浴2分钟后作为模板备用，分别使用步骤（2）中合成的引物PS1R、PS2R、PS3R、PS4R、PS5R、PS6R、PS7R、PS8R、PS9R、PS10R进行反转录，对应获得S1至S10片段的cDNA。
优选的，在上述技术方案中，在反转录的情况下，步骤（1）中获得的家蚕质型多角体病毒基因组可以通过琼脂糖凝胶电泳分离并从琼脂糖凝胶中回收S1至S10双链RNA片段后，再经煮沸10分钟，冰浴2分钟后，作为模板备用。
优选的，在上述技术方案中，步骤（5）中所述质粒载体可以选用pIZT-V5/His载体（Invitrogen公司）、pUC系列载体（TAKATA公司）或pBlueScript SK II载体（Novagen公司），优选pIZT-V5/His载体。
优选的，在上述技术方案中，步骤（6）中用于体外转录的模板可以是步骤（5）中获得的重组质粒pT-S1至pT-S9，也可以是以步骤（5）中获得的重组质粒pT-S1至pT-S9为模板，对应使用步骤（2）中合成的9对引物进行PCR扩增后获得的扩增产物。
优选的，在上述技术方案中，步骤（6）中所述体外转录可以通过使用mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit（Ambion公司）来实现。
优选的，在上述技术方案中，步骤（7）中所述带有红色荧光蛋白基因的重组质粒pT-S10-DsRed通过引物延伸法来构建，所述引物延伸法包括以下步骤：
（a）设计并合成特异性引物PredF-A、PredR-A、PredR-B和PredR-C，其中引物PredF-A对应SEQ ID NO:21，PredR-A对应SEQ ID NO:22，PredR-B对应SEQ ID NO:23，PredR-C对应SEQ ID NO:24，其序列如下所示：
其中：
上游引物PredF-A（SEQ ID NO:21）中以单下划线表示KpnI酶切位点，以粗斜体表示T7启动子序列，以双下划线表示S10片段的5'端非编码区的cDNA序列，以斜体表示红色荧光蛋白基因开放读码框5'端序列；
下游引物PredR-A（SEQ ID NO:22）中以斜体表示S10片段的3'端非编码区的cDNA部分序列的互补序列，以双下划线表示红色荧光蛋白基因开放读码框3'端的互补序列；
下游引物PredR-B（SEQ ID NO:23）中以斜体表示S10片段的3'端非编码区的cDNA部分序列的互补序列，以双下划线表示与下游引物PredR-A的5’端前23个核苷酸序列重叠；
下游引物PredR-C（SEQ ID NO:24）中以斜体表示S10片段的3'端非编码区的cDNA部分序列的互补序列，以单下划线表示SacII酶切位点，以双下划线表示与下游引物PredR-B的5’端前27个核苷酸序列重叠；
（b）以带有红色荧光蛋白基因的质粒为模板，使用步骤（a）中合成的特异性引物PredF-A和PredR-A进行PCR扩增，获得扩增产物-1；
（c）以步骤（b）中获得的扩增产物-1为模板，使用特异性引物PredF-A和PredR-B进行PCR扩增，获得扩增产物-2；
（d）以步骤（c）中获得的扩增产物-2为模板，使用特异性引物PredF-A和PredR-C进行PCR扩增，获得扩增产物-3；
（e）将步骤（d）中获得的扩增产物-3使用KpnI和SacII进行双酶切，然后克隆到质粒载体中，获得重组质粒pT-S10-DsRed，其中所述质粒载体可以选用pIZT-V5/His载体（Invitrogen公司）、pUC系列载体（TAKATA公司）或pBlueScript SK II载体（Novagen公司），优选pIZT-V5/His载体。
优选的，在上述技术方案中，步骤（8）中所述脂质体优选使用Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）。
优选的，在上述技术方案中，步骤（8）中所述宿主可以是家蚕或家蚕培养细胞，所述家蚕培养细胞优选使用家蚕BmN培养细胞。
另一方面，本发明请求保护用于上述构建方法的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:24所示。
由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
1、常规方法难以通过遗传操作对家蚕质型多角体病毒基因组改造获得表达红色荧光蛋白的重组病毒，而将利用本发明中记载的技术获得的重组家蚕质型多角体病毒接种于家蚕培养细胞后，可以表达红色荧光蛋白；
2、常规方法难以通过遗传操作对其它质型多角体病毒基因组改造获得重组病毒，采用本发明中记载的技术有可能通过体外遗传操作实现对其他质型多角体病毒基因组的改变，获得人们所需的重组质型多角体病毒生物杀虫剂。
附图说明
图1中显示了实施例一中体外转录的S10-DsRed RNA与体外转录的基因组S1-S9片段的RNA混合转染的家蚕培养细胞，其中白色箭头指向发红色荧光区域。
图2中显示了实施例一中获得的表达红色荧光蛋白的重组质型多角体病毒接种的家蚕培养细胞，其中白色箭头指向发红色荧光区域。
具体实施方式
下面将结合附图及具体实施例对本发明做出进一步的描述。
实施例一：表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒的构建及性能检测。
1、病毒的构建：
（1）提取家蚕质型多角体病毒基因组：
收集家蚕质型多角体病病蚕的中肠组织，按照1g中肠组织：10mL双蒸水的比例添加双蒸水（自制，成都超纯科技有限公司，UPT-Ⅲ-5T超纯水机），匀浆后用沙布过滤，滤液通过CF15D2型离心机（日本KuBoTa公司）差速离心，获得纯净的家蚕质型多角体；将纯净的家蚕质型多角体加水（自制，成都超纯科技有限公司，UPT-Ⅲ-5T超纯水机）悬浮，调节浓度至每mL水中至少含有108个多角体，取多角体悬浮液0.5mL，加等体积的Tris平衡酚（北京索莱宝科技有限公司），振荡混匀5min，在12000rpm的转速下于4℃离心10min；取上清液，加入等体积的Tris平衡酚（北京索莱宝科技有限公司），振荡混匀5min，在12000rpm的转速下于4℃离心10min；取上清液，加入等体积的氯仿（江苏强盛功能化学股份有限公司），振荡混匀5min，在12000rpm的转速下于4℃离心10min；取上清液，加入1/10体积的浓度为3mol/L的醋酸钠水溶液（自制，其中醋酸钠购自上海国药集团化学试剂有限公司）和2~2.5倍体积的-20℃预冷的99%乙醇（江苏强盛功能化学股份有限公司），振荡混匀后于-20℃放置30min，在12000rpm的转速下于4℃离心10min，弃去上清液，沉淀用75%乙醇（江苏强盛功能化学股份有限公司）洗涤后，用50μL双蒸水溶解，得到家蚕质型多角体病毒基因组，于-20℃冻存备用。
（2）引物的设计与合成：
根据家蚕质型多角体病毒基因组S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10片段的双链RNA的末端序列（在GenBank中的登录号分别为GU323605、GQ924586、GQ924587、GU323606、GQ294468、GQ294469、GQ150538、GQ150539、GQ924588、GQ924589），设计并合成以下引物：
PS1F（SEQ ID NO:1）：TTCGAGCTC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAAAGTGTATGTTTATACC，下划线表示SacI酶切位点，粗斜体表示T7启动子序列；
PS1R（SEQ ID NO:2）：TATCCGCGGGGCTAACGGTCGTGTATG，下划线表示SacII酶切位点；
PS2F（SEQ ID NO:3）：TTCGAGCTC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAAGAGCAGCACTTGTACG，下划线表示SacI酶切位点，粗斜体表示T7启动子序列；
PS2R（SEQ ID NO:4）：TATCCGCGGGGCTAACGGTGAACAGCGTA，下划线表示SacII酶切位点；
PS3F（SEQ ID NO:5）：TTCGAGCTC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAAAGACACATGACGAGAAACTAATGTAGTAGGAAAAGATGGAAATAAATAGAGCTGA，下划线表示SacI酶切位点，粗斜体表示T7启动子序列；
PS3R（SEQ ID NO:6）：TATCCGCGGGGCTAACGGTCGACACATGTTCATGCTCCACGCATGCCAGCATATAGGCTCCTCATCGTGGATGCATAACG，下划线表示SacII酶切位点；
PS4F（SEQ ID NO:7）：TTCGGTACC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAATTTCCACCATGTGGC，下划线表示KpnI酶切位点，粗斜体表示T7启动子序列；
PS4R（SEQ ID NO:8）：TATCCGCGGGGCTAACGTTTCCCACCGC，下划线表示SacII酶切位点；
PS5F（SEQ ID NO:9）：TCGAATTTAAAGCTTGGTACC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAATTTCCCCTTACC，下划线表示KpnI酶切位点，粗斜体表示T7启动子序列；
PS5R（SEQ ID NO:10）：ATAGGCTTACCTTCGAACCGCGGCTAACCATCTCCCCGTG，下划线表示SacII酶切位点；
PS6F（SEQ ID NO:11）：TTCGGTACC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAAGATTCCGTAATATCC，下划线表示KpnI酶切位点，粗斜体表示T7启动子序列；
PS6R（SEQ ID NO:12）：TATCCGCGGGGCTAACGTTGACTCCGC，下划线表示SacII酶切位点；
PS7F（SEQ ID NO:13）：TTCGGTACC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAATTTGGTCATAACAGC，下划线表示KpnI酶切位点，粗斜体表示T7启动子序列；
PS7R（SEQ ID NO:14）：GGCTCTAGAGGCTAACGTTTGGTCACTCCG，下划线表示XbaI酶切位点；
PS8F（SEQ ID NO:15）：TTCGGTACC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAAAGTCCAGTACTAG，下划线表示KpnI酶切位点，粗斜体表示T7启动子序列；
PS8R（SEQ ID NO:16）：TATCCGCGGGGCTAACGGTAGTCCGCCGC，下划线表示SacII酶切位点；
PS9F（SEQ ID NO:17）：TTCGGTACC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAAATCCCAGGCGTAAACCG，下划线表示KpnI酶切位点，粗斜体表示T7启动子序列；
PS9R（SEQ ID NO:18）：TATCCGCGGGGCTAACGACCCGAGTGCCC，下划线表示SacII酶切位点；
PS10F（SEQ ID NO:19）：TTCGGTACC TAATACGACTCACTATAGCTA AGTAAAAGTCAGTATCTTACCGGC，下划线表示KpnI酶切位点，粗斜体表示T7启动子序列；
PS10R（SEQ ID NO:20）：TATCCGCGGGGCTAACGGTCAGTCAGTACCGC，下划线表示SacII酶切位点。
上述引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
（3）反转录获得S1至S10片段的cDNA：
取20μL步骤（1）中的家蚕质型多角体病毒基因组，于100℃煮沸10min，然后冰浴2min，取1μL作为模板，分别利用步骤（2）中的引物PS1R、PS2R、PS3R、PS4R、PS5R、PS6R、PS7R、PS8R、PS9R、PS10，采用反转录试剂盒（瑞士罗氏公司，Transcriptor Reverse Transcriptase）按照产品说明书进行反转录，获得S1至S10片段的cDNA。反转录体系如下：家蚕质型多角体病毒基因组RNA 1μL、各片段下游引物1μL、RNase-free H2O 11μL，先65℃ 10min，冰上放置5min，依次加入5×Reaction Buffer 4μL、RT Enzyme 0.5μL、10×dNTP 2μL，55℃ 30min后85℃ 5min。
（4）PCR扩增S1至S10片段全长cDNA：
分别以1μL的步骤（3）中的S1至S10片段的cDNA作为模板，对应使用步骤（2）中合成的引物对进行PCR扩增，即S1片段的cDNA用引物对PS1F/PS1R扩增，以此类推。PCR扩增条件如下：94℃预变性4min，94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸1-5min，72℃再延伸10min，反应为35个循环。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测后，采用DNA凝胶回收试剂盒按照产品说明书回收扩增产物。
（5）重组质粒的构建：
取步骤（4）中获得的PCR扩增产物，分别使用限制性内切酶进行酶切，其中：
S1片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；
S2片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；
S3片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；
S4片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S5片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S6片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S7片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和XbaI进行酶切；
S8片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S9片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S10片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切。
使用上述限制性内切酶分别对S1至S10片段全长cDNA的扩增产物进行酶切，酶切体系为：片段全长cDNA 8μL、kpnI Buffer 2μL，kpnI 1μL、SacII或XbaI 1μL、无菌水8μL，酶切条件为：37℃ 3h。将上述酶切产物与使用kpnI和SacII或kpnI和XbaI进行酶切后的pIZT-V5/His载体（Invitrogen公司产品）连接，然后将连接产物转化至大肠杆菌。取阳性克隆，送上海生工生物工程股份有限公司测序验证后，获得序列正确的重组质粒pT-S1、pT-S2、pT-S3、pT-S4、pT-S5、pT-S6、pT-S7、pT-S8、pT-S9、pT-S10。
（6）S1至S9片段的RNA的制备：
取步骤（5）中的重组质粒pT-S1至pT-S9，使用限制性内切酶进行酶切、线性化，其中所述限制性内切酶的使用情况如下：
重组质粒pT-S1用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S2用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S3用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S4用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S5用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S6用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S7用XbaI进行酶切；
重组质粒pT-S8用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S9用SacII进行酶切。
将各个酶切产物分别用Tris平衡酚（北京索莱宝科技有限公司）、氯仿（江苏强盛功能化学股份有限公司）抽提后，再用乙醇（江苏强盛功能化学股份有限公司）沉淀DNA，沉淀的DNA用2020μL双蒸水溶解。分别以上述酶切产物为模板，用mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit（Ambion公司）按照产品说明书进行体外转录，方法如下：按RNase-free H20 8μL、2×NTP/CAP 4μL、10×Rxn. Buffer 2μL、模板4μL、Enzyme Mix 2μL依次加样；上下颠倒混匀，点甩离心，37℃ 1-2h；70℃灭活酶，点甩离心。体外转录产物用无RNase的DNA酶消化，以便去除DNA模板，用乙醇沉淀体外转录的RNA，并用紫外分光光度计（美国Picodrop公司，Pico200）测定RNA的浓度，获得S1至S9片段的RNA。
（7）S10-DsRed RNA的制备：
（a）设计并合成如下特异性引物：
（b）以带有红色荧光蛋白基因的质粒为模板，使用引物PredF-A和PredR-A进行PCR扩增，获得扩增产物-1；
（c）以步骤（b）中获得的扩增产物-1为模板，使用引物PredF-A和PredR-B进行PCR扩增，获得扩增产物-2；
（d）以步骤（c）中获得的扩增产物-2为模板，使用引物PredF-A和PredR-C进行PCR扩增，获得扩增产物-3；
（e）将步骤（d）中获得的扩增产物-3使用KpnI和SacII进行双酶切，然后克隆到pIZT-V5/His载体（Invitrogen公司）中，测序验证后，获得重组质粒pT-S10-DsRed；
（f）将步骤（e）中获得的重组质粒pT-S10-DsRed用SacII进行酶切、线性化后，作为模板，用mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit（Ambion公司）按照产品说明书进行体外转录，体外转录产物用无RNase的DNA酶消化，以便去除DNA模板，用乙醇沉淀体外转录的RNA，并用紫外分光光度计测定RNA的浓度，获得S10-DsRed RNA。
（8）获得表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒：
将步骤（6）中的S1至S9片段的RNA及步骤（7）中的S10-DsRed RNA等摩尔混合，取含有10μg总RNA的混合物，用10μL脂质体Lipofectamine 2000 （Invitrogen公司）包裹并转染至家蚕BmN培养细胞，于27℃培养1周后，可观察到细胞内发出红色荧光；收集细胞并粉碎，离心纯化，获得表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒。
2、病毒的性能检测：
将获得的表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒转接培养细胞，可观察到感染的细胞发出红色荧光，说明构建的重组家蚕质型多角体病毒具有复制表达能力。
实施例二：表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒的构建。
（1）提取家蚕质型多角体病毒基因组：同实施例一的步骤（1）。
（2）引物的设计与合成：同实施例一的步骤（2）。
（3）反转录获得S1至S10片段的cDNA：同实施例一的步骤（3）。
（4）PCR扩增S1至S10片段全长cDNA：同实施例一的步骤（4）。
（5）重组质粒的构建：同实施例一的步骤（5）。
（6）S1至S9片段的RNA的制备：分别取步骤4中的PCR扩增S1至S9片段全长cDNA为模板，用mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit (Ambion公司)按产品说明书体外转录，体外转录产物用无RNase的DNA酶消化去除DNA模板，用乙醇沉淀体外转录的RNA，紫外分光光度计测定RNA的浓度。
（7）S10-DsRed RNA的制备：同实施例一的步骤（7）。
（8）获得表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒：同实施例一的步骤（8）。
实施例三：表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒的构建。
（1）提取家蚕质型多角体病毒基因组：同实施例一的步骤（1）。
（2）引物的设计与合成：同实施例一的步骤（2）。
（3）反转录获得S1至S10片段的cDNA：同实施例一的步骤（3）。
（4）PCR扩增S1至S10片段全长cDNA：同实施例一的步骤（4）。
（5）重组质粒的构建：同实施例一的步骤（5）。
（6）S1至S9片段的RNA的制备：以步骤（5）获得的重组质粒pT-S1至pT-S9为模板，对应使用步骤（2）中合成的9对引物进行PCR扩增，即重组质粒pT-S1用引物对PS1F/PS1R进行扩增，重组质粒pT-S2用引物对PS2F/PS2R进行扩增，以此类推。然后分别以各个扩增产物为体外转录模板，用mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit（Ambion公司）按照产品说明书进行体外转录，体外转录产物用无RNase的DNA酶消化，以便去除DNA模板，用乙醇沉淀体外转录的RNA，并用紫外分光光度计测定RNA的浓度，获得S1至S9片段的RNA。
（7）S10-DsRed RNA的制备：同实施例一的步骤（7）。
（8）获得表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒：同实施例一的步骤（8）。
Claims (10)
1.一种表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒的构建方法，其包括下列步骤：
1）获得家蚕质型多角体病毒基因组；
2）根据家蚕质型多角体病毒基因组S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10片段的双链RNA的末端序列，设计并合成10对引物：PS1F/PS1R、PS2F/PS2R、PS3F/PS3R、PS4F/PS4R、PS5F/PS5R、PS6F/PS6R、PS7F/PS7R、PS8F/PS8R、PS9F/PS9R、PS10F/PS10R，其中所述引物的编号情况如下：
引物PS1F对应SEQ ID NO:1，引物PS1R对应SEQ ID NO:2，
引物PS2F对应SEQ ID NO:3，引物PS2R对应SEQ ID NO:4，
引物PS3F对应SEQ ID NO:5，引物PS3R对应SEQ ID NO:6，
引物PS4F对应SEQ ID NO:7，引物PS4R对应SEQ ID NO:8，
引物PS5F对应SEQ ID NO:9，引物PS5R对应SEQ ID NO:10，
引物PS6F对应SEQ ID NO:11，引物PS6R对应SEQ ID NO:12，
引物PS7F对应SEQ ID NO:13，引物PS7R对应SEQ ID NO:14，
引物PS8F对应SEQ ID NO:15，引物PS8R对应SEQ ID NO:16，
引物PS9F对应SEQ ID NO:17，引物PS9R对应SEQ ID NO:18，
引物PS10F对应SEQ ID NO:19，引物PS10R对应SEQ ID NO:20，
所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:20所示；
3）获得S1至S10片段的cDNA；
4）分别以步骤3）中获得的S1至S10片段的cDNA为模板，对应使用步骤2）中合成的10对引物进行PCR扩增，获得S1至S10片段全长cDNA的扩增产物；
5）将步骤4）中获得的S1至S10片段全长cDNA的扩增产物分别使用限制性内切酶进行酶切，然后克隆到质粒载体中，获得分别带有S1至S10片段全长cDNA的重组质粒pT-S1、pT-S2、pT-S3、pT-S4、pT-S5、pT-S6、pT-S7、pT-S8、pT-S9、pT-S10，其中所述限制性内切酶的使用情况如下：
S1片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；
S2片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；
S3片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；
S4片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S5片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S6片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S7片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和XbaI进行酶切；
S8片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S9片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
S10片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；
6）将步骤5）中获得的pT-S1至pT-S9重组质粒分别使用限制性内切酶进行酶切、线性化后，作为模板备用，经过体外转录，获得S1至S9片段的RNA，其中所述限制性内切酶的使用情况如下：
重组质粒pT-S1用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S2用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S3用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S4用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S5用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S6用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S7用XbaI进行酶切；
重组质粒pT-S8用SacII进行酶切；
重组质粒pT-S9用SacII进行酶切；
7）构建带有红色荧光蛋白基因的重组质粒pT-S10-DsRed，将其进行酶切、线性化后，作为模板备用，经过体外转录，获得S10-DsRed RNA，其中所述红色荧光蛋白基因的5'端带有对应于家蚕质型多角体病毒基因组S10片段的5'非编码区的cDNA序列、3'端带有对应于S10片段的3'非编码区的cDNA序列，所述重组质粒pT-S10-DsRed用SacII进行酶切；
8）将步骤6）中获得的S1至S9片段的RNA及步骤7）中获得的S10-DsRed RNA等摩尔混合，使用脂质体进行包裹并转染宿主，待观察到宿主的细胞内发出红色荧光时，收集细胞并粉碎，离心纯化，获得表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒。
2.根据权利要求1所述的表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒的构建方法，其特征在于，步骤1）中所述家蚕质型多角体病毒基因组的获得采用实验室提取或者商业购买的方法来实现。
3.根据权利要求2所述的表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒的构建方法，其特征在于，在实验室提取的情况下，从家蚕质型多角体病毒粒子或家蚕质型多角体中提取病毒基因组，优选从家蚕质型多角体中提取病毒基因组。
4.根据权利要求1所述的表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒的构建方法，其特征在于，步骤3）中所述S1至S10片段的cDNA的获得采用基于RNA序列的全人工合成或反转录的方法来实现。
5.根据权利要求4所述的表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒的构建方法，其特征在于，在反转录的情况下，将步骤1）中获得的家蚕质型多角体病毒基因组于100℃煮沸10分钟，再冰浴2分钟后，作为模板备用，分别使用步骤2）中合成的引物PS1R、PS2R、PS3R、PS4R、PS5R、PS6R、PS7R、PS8R、PS9R、PS10R进行反转录，对应获得S1至S10片段的cDNA。
6.根据权利要求1所述的表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒的构建方法，其特征在于，步骤5）中所述质粒载体选自pIZT-V5/His载体、pUC系列载体或pBlueScript SK II载体中的任意一种，优选pIZT-V5/His载体。
7.根据权利要求1所述的表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒的构建方法，其特征在于，步骤6）中用于体外转录的模板是步骤5）中获得的重组质粒pT-S1至pT-S9或者是以步骤5）中获得的重组质粒pT-S1至pT-S9为模板，对应使用步骤2）中合成的9对引物进行PCR扩增后获得的扩增产物。
8.根据权利要求1所述的表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒的构建方法，其特征在于，步骤7）中所述带有红色荧光蛋白基因的重组质粒pT-S10-DsRed通过引物延伸法来构建，所述引物延伸法包括以下步骤：
a）设计并合成特异性引物PredF-A、PredR-A、PredR-B和PredR-C，其中引物PredF-A对应SEQ ID NO:21，PredR-A对应SEQ ID NO:22，PredR-B对应SEQ ID NO:23，PredR-C对应SEQ ID NO:24，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:21至SEQ ID NO:24所示；
b）以带有红色荧光蛋白基因的质粒为模板，使用步骤a）中合成的特异性引物PredF-A和PredR-A进行PCR扩增，获得扩增产物-1；
c）以步骤b）中获得的扩增产物-1为模板，使用特异性引物PredF-A和PredR-B进行PCR扩增，获得扩增产物-2；
d）以步骤c）中获得的扩增产物-2为模板，使用特异性引物PredF-A和PredR-C进行PCR扩增，获得扩增产物-3；
e）将步骤d）中获得的扩增产物-3使用KpnI和SacII进行双酶切，然后克隆到质粒载体中，获得重组质粒pT-S10-DsRed，其中所述质粒载体选自pIZT-V5/His载体、pUC系列载体或pBlueScript SK II载体中的任意一种，优选pIZT-V5/His载体。
9.根据权利要求1所述的表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒的构建方法，其特征在于，步骤8）中所述脂质体为Lipofectamine 2000；所述宿主是家蚕或家蚕培养细胞，优选家蚕培养细胞，更优选家蚕BmN培养细胞。
10.用于上述权利要求中任一项所述的表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒的构建方法的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:24所示。
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