CN107805628A - 一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin‑4的细胞系及其构建方法 - Google Patents

一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin‑4的细胞系及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin‑4的细胞系及其构建方法，本发明采用合成的Nectin‑4基因，利用慢病毒载体系统，构建重组质粒pLOV‑eGFP‑Nectin‑4。将该重组质粒与pSPAX2和pMD2.G质粒共转染293T细胞，获得逆转录病毒样颗粒。将含有逆转录病毒样颗粒的细胞培养上清液感染MDBK细胞，利用嘌呤霉素筛选、纯化，获得了稳定表达Nectin‑4蛋白的MDBK细胞，将其命名为MDBK‑Nectin‑4。该细胞系的建立为深入研究PPRV与受体Nectin‑4的相互作用，以及临床快速分离PPRV提供了实验材料。

Description

一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的细胞系及其构 建方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的细胞系及其构建方法。
背景技术
小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)是由小反刍兽疫病毒(Pestedes petits ruminants virus,PPRV)引起的一种急性、高度接触性传染病，主要感染绵羊、山羊等小反刍兽。世界动物卫生组织将其规定为必须上报的疫病，我国将其列为一类动物疫病。该病导致动物的急性发病率和死亡率严重时可分别高达100％和90％。近年来PPR呈现扩散的趋势，我国周边的印度、巴基斯坦等国家均暴发过大规模的疫情。
2007年7月，我国西藏地区首次发生了PPR疫情，随即被有关部门迅速扑灭，引起了国家的高度重视。在随后的数年里，我国新疆及西藏地区零散发生了数起PPR疫情。2014年3月，我国的内蒙古、辽宁省、湖南省、江西省、江苏省以及安徽省发生了多起疑似PPR疫情，经国家外来动物疫病研究中心确诊为PPR疫情，这为我国PPR防疫工作再次敲响了警钟！由于目前对于该病尚无特效的治疗方法，主要依靠疫苗进行免疫预防。由于该病具有高发病率和死亡率的特点，PPR疫情给养羊业造成了巨大的危害。作为一种重大的跨国动物传染病，严重威胁着我国畜牧业经济的发展。因此，加强对该病的研究工作具有重要的现实意义。2017年，研究人员在中国安徽省的野生动物河麂体内发现了PPRV感染，野生动物携带PPRV不利于该病毒的消灭计划，提示对于该病的防治工作任重而道远。
PPRV属于副粘病毒科麻疹病毒属成员，为单股、负链、不分节段的RNA病毒。PPRV仅有1个血清型，分为4个群。病毒基因组从3′端至5′端依次包含6个基因，对应编码6种结构蛋白和2种非结构蛋白(N、P、M、F、H、L结构蛋白，以及C和V非结构蛋白)。其中H蛋白具有神经氨酸酶活性和血凝素活性，能够引起感染的细胞出现细胞病变(CPE)。在PPRV感染细胞的过程中，H蛋白首先与宿主细胞受体结合，启动病毒对细胞的感染。科研人员新近发现Nectin-4为PPRV感染宿主上皮细胞的受体。Nectin-4又名脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白，属于Ig球蛋白超家族中的Nectin家族。截至目前，H蛋白如何与受体Nectin-4相互作用的分子机制尚不清楚，有待深入研究。为深入研究H蛋白与受体Nectin-4的相互作用，有必要构建稳定表达Nectin-4蛋白的细胞系。
Nectin-4蛋白是PPRV新的受体，能够与构成PPRV囊膜表面纤突的H蛋白存在相互作用，为进一步有待深入研究二者的相互作用，有必要构建过表达病毒受体Nectin-4的细胞系。Adombi等曾经利用构建的稳定表达SLAM的猴CV1细胞系从病料样品中快速、敏感地分离出PPRV。因此，构建稳定表达Nectin-4受体细胞系能够为临床快速分离病毒提供重要的材料，具有重要的现实意义。
目前，建立细胞系有多种方法，如直接利用脂质体转染将表达质粒转染靶细胞然后进行筛选获得，但直接转染的方法往往效率不高。慢病毒系统由于能够感染分裂细胞及非分裂细胞，外源基因容量较大，目的基因表达时间较长，不易引发宿主免疫反应等诸多优点，逐渐成为稳定表达外源蛋白细胞系构建的热点。慢病毒细胞系中由于带有嘌呤霉素抗性基因，使用嘌呤霉素筛选时，能够正常存活，而正常对照293T细胞则由于不具备嘌呤霉素抗性而发生死亡。从而有利于快速、高效构建稳定表达外源蛋白的细胞系。
发明内容
为了弥补以上不足，本发明提供了一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的细胞系及其构建方法。
本发明的方案是：
一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的细胞系，所述细胞系为MDBK-Nectin-4细胞系，所述细胞系整合了小反刍兽疫病毒受体Nectin-4基因，所述细胞系能稳定高效表达Nectin-4基因。
一种稳定表达所述小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的细胞系的构建方法，包括如下步骤：
(1)利用基因重组技术将小反刍兽疫病毒受体Nectin-4基因克隆到慢病毒表达系统pLOV-eGFP载体中，得到重组表达载体pLOV-eGFP-Nectin-4；
(2)将构建好的重组表达载体pLOV-eGFP-Nectin-4与包装质粒pSPAX2和外膜质粒pMD2.G通过脂质体共转染293T细胞，通过嘌呤霉素筛选出阳性重组细胞系；
(3)对阳性细胞系进行Western blot和IFA鉴定，得到稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的细胞系。
进一步地，所述步骤(1)具体为：先根据小反刍兽疫病毒受体Nectin-4基因，设计带有XmaI和XbaI双酶切位点及保护碱基的小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的特异引物，再通过PCR反应从合成的Nectin-4模板中扩增含有特异性酶切位点的小反刍兽疫病毒受体Nectin-4基因，然后在慢病毒表达系统pLOV-eGFP载体的XmaI和XbaI多克隆位点插入小反刍兽疫病毒受体Nectin-4基因，得到重组表达载体pLOV-eGFP-Nectin-4。
进一步地，所述特异引物的序列为：
上游引物F(SEQ ID NO.1)：
5’-TCCCCCCGGGATGCCTCTGTCCCTGGGAGCCG-3’
上游引物R(SEQ ID NO.2)：
5’-GCTCTAGAGACCAGATGCCCCCGCCCGTTGAT-3’。
进一步地，所述PCR的反应体系为：上下游引物各2μl、模板DNA 1μg、rTaq DNA聚合酶(Mix)50μl，加双蒸水补齐至100μl。
进一步地，所述步骤(2)具体为：将构建好的重组表达载体pLOV-eGFP-Nectin-4先与包装质粒pSPAX2和外膜质粒pMD2.G通过脂质体共转染293T细胞，再通过含嘌呤霉素筛的培养基筛选出阳性细胞系。
进一步地，所述步骤(3)中一抗为鼠源Nectin-4多抗血清。
进一步地，所述步骤(3)中IFA的二抗为FITC标记的羊抗鼠IgG抗体，Western blot的二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG抗体。
进一步地，所述步骤(3)取第5、10、15和20代次的MDBK-Nectin-4细胞进行Westernblot和IFA检测，以鉴定Nectin-4蛋白的表达。将上述代次的MDBK-Nectin-4细胞系反复冻融3次，裂解后进行SDS-PAGE电泳。将蛋白转印至硝酸纤维素膜后，依次与鼠源Nectin-4多抗血清(1:200倍稀释)和HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(1:2000)反应，利用ECL化学发光试剂盒进行显色。将上述代次的MDBK-Nectin-4细胞系用丙酮和甲醇的混合液固定，然后进行IFA检测。一抗为鼠源Nectin-4多抗血清(1:200倍稀释)，二抗为FITC标记的羊抗鼠IgG抗体(1:1000倍稀释)，荧光显微镜下观察结果。
有益效果
1.本发明首先根据绿色荧光蛋白来观察慢病毒颗粒的成功包装。然后再利用嘌呤霉素抗性加压筛选，得到能够稳定表达Nectin-4蛋白的MDBK-Nectin-4细胞系。该细胞系一方面能够稳定传代20代，表现出良好的遗传稳定性。另一方面相对于亲本MDBK细胞而言，在同样剂量的PPRV感染过程中，能够更加快速的表现出CPE，有利于临床PPRV的病毒分离工作。
2.本发明通过慢病毒包装系统成功构建了稳定表达PPRV受体Nectin-4蛋白的MDBK-Nectin-4细胞系。通过蛋白水平检测，该细胞系能够稳定高效表达Nectin-4蛋白，为研究PPRV与受体Nectin-4的相互作用以及临床快速分离PPRV提供了重要的平台。
附图说明
图1Nectin-4基因PCR扩增产物电泳图，其中M为DL2500Marker；1为Nectin-4PCR扩增产物。
图2pLOV-eGFP-Nectin4质粒双酶切电泳图，其中M为DL15000Marker；1为pLOV-eGFP-Nectin4质粒双酶切产物。
图3pLOV-eGFP-Nectin-4、pSPAX2和pMD2.G共转染293T细胞荧光图，其中A为普通显微镜下观察三质粒共转染24h后细胞的形态；B为荧光显微镜下观察三质粒共转染24h后的荧光。
图4MDBK-Nectin-4细胞中Nectin-4基因检测图，其中M为DNA分子质量标准；1为第10代MDBK-Nectin-4细胞；2为MDBK细胞。
图5Western blot检测不同代次MDBK-Nectin-4细胞中Nectin-4蛋白的表达图，其中1为MDBK细胞裂解液；2、3、4、5分别为MDBK-Nectin-4细胞第5、10、15和20代MDBK-Nectin-4细胞裂解液。
图6IFA检测MDBK-Nectin-4中Nectin-4蛋白的表达，A、B、C、D分别为传代至第5、10、15、20代的MDBK-Nectin-4中Nectin-4蛋白的表达；绿色荧光为Nectin-4的位置，蓝色为DAPI染色的细胞核。
图7PPRV感染MDBK及MDBK-Nectin4细胞系，A、B分别为PPRV感染MDBK-Nectin4细胞48、96h的CPE；C、D分别为PPRV感染MDBK细胞48、96h的CPE。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例及附图1～5对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定，实施例中未注明具体条件的，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商的，均为可以通过市售获得的常规产品。
1.pLOV-eGFP-Nectin-4表达载体构建
根据Genbank公开发表的羊源Nectin-4基因序列(登录号JX944709)合成Nectin-4基因。
所述Nectin-4基因序列(SEQ ID NO.3)：(登录号JX944709)
atgcctctgtccctgggagccgagatgtggggtcctgtggcctggctgctgctgctgctcctggcatcatttacaggtcagtgccttgctggtgagctggagacctcggacctggtgaccgtggtgctgggccaggatgccaggctgccctgcttctaccgaggggatccgggcgagcaggtggagcaggtggcatgggctcgcgtggatgcgggcgagggcggccgggaactggcactgctgaactccaaatacgggctgcacgtgagctcagcctacgagggccgcgtggaacagccgccgcccccacggaaccccctggatggtgcggtactgctgcgcaacgcggtgcaggctgacgagggcgagtacgagtgtcgcgtcagcaccttccctgccggaagcttccaggcaaggctgcggctccgcgttctggtgcctcccttgccctcgctgaatcctggtccggcgctagaagagggccagggcctgacactggcagcctcctgcacagcagagggcagcccggcccccagcgttacctgggacacagaggtcaagggcacagcatcccaccgctccttcacacactcccgctcagctgccgtcacttcagaattccatctggtgcccagccgcagcatgaacggacagccacttacctgcgtggtatcccaccctggcctgctgcaggaccaacggatcacccacatcctccaggtggccttccttgcggaagcctctgtgaggggccttgaagaccgaaagctgtggcaggttggcagagaaggggctatgctcaagtgcttgagtgaagggcagcccccgccctcgtacaactggacacggctggacgggcctctgcccagtggggtacgagcagaaggagacaccctgggcttccccacactgaccactgagcacagtggcacatacgtctgccgtgttagcaatgcactctcctcaagggattctcaggtggtggtggacgttcttgaccccgaggatgccgccgggaagcaggtggacctcgtgtcggcctccgtggtagtggtgggcgtaattgctgcactcttgttctgccttctggtggtggtcgtggtgctcatgtcccgataccatcggcgcaaggcccagcagatgacccagaaatatgaggaggagctgaccctgaccagggagaactccatccggaggctgcattcccatcactcggaccccagaaaccagccggaggagagtgtagggctgagagccgagggccaccccgatagtctcaaggacaacagtagctgctctgtgatgagtgaagagccggagggccgcagttactccacgctgaccacagtgagggagattgaaacgcagaccgagctgccgtctccaggccctgggcgggcagaggaggaggaggatcgggatgaaggcatcaagcaggccatgaaccattttgttcaggagaacgggaccctgcgggccaagcccacgggcaatggcatctacatcaacgggcgggggcatctggtctga
同时设计一对PCR特异性引物，去除了Nectin-4基因的终止密码子TGA，并在两端添加XmaI和XbaI酶切位点。引物序列见表1。
表1.PCR扩增Nectin-4的特异性引物
利用PCR扩增含有酶切位点的Nectin-4基因，所述PCR的反应体系为：上下游引物各2μl、模板DNA 1μg、rTaq DNA聚合酶(Mix)50μl，加双蒸水补齐至100μl。PCR产物切胶回收后利用XmaI和XbaI双酶切，将其亚克隆至同样经双酶切的慢病毒表达系统pLOV-eGFP载体中。重组质粒经PCR、酶切鉴定正确后送上海生工生物工程有限公司进行序列测定。重组质粒经鉴定后命名为pLOV-eGFP-Nectin-4。
以合成的pMD18-T-Nectin-4质粒为模板，根据材料和方法1.4，成功扩增出1530bp目的片段，与预期大小相符，结果见图1。构建获得真核表达质粒pLOV-eGFP-Nectin-4经XmaI和XbaI双酶切后生成大小约为8500bp载体和1530bp目的基因条带，结果见图2，表明质粒构建成功。测序结果表明，Nectin-4基因未发生碱基突变或缺失。
2.慢病毒样颗粒的制备
提取无内毒素的pLOV-eGFP-Nectin-4重组质粒以及pSPAX2和pMD2.G质粒，分别按照25、15和25μg的量利用Lipofectamine 2000转染试剂共转染293T细胞，具体操作步骤参见Lipofectamine 2000转染试剂说明书。转染24h后收集含慢病毒样颗粒的细胞培养上清液。
3.嘌呤霉素对MDBK细胞最小致死浓度测定
将MDBK细胞以约1.0×105个/瓶的浓度接种于25mL细胞瓶。在将其置于5％CO2、37℃培养箱中培养48h左右，当细胞长成70％～80％满的单层细胞时，每组细胞分别添加1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL和5μg/mL浓度的嘌呤霉素，每48h换液一次。利用含嘌呤霉素抗性培养基培养约10d，然后利用不加嘌呤霉素的培养基继续培养3d。实验每组设置3个重复。期间无细胞存活的嘌呤霉素的最小浓度即为对MDBK细胞的最小致死浓度。
实验结果表明，加入不同浓度的嘌呤霉素24h后，MDBK细胞出现明显的生长停滞。第3d时MDBK细胞出现大量的死亡，培养至第5d几乎没有正常形态的MDBK细胞的存在。当第10d时，1μg/mL组中仅有极少量MDBK细胞存活，而2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL和5μg/mL组中MDBK细胞均死亡。因此，确定嘌呤霉素对MDBK细胞的最小致死浓度为2μg/mL。实验中采用1μg/mL的嘌呤霉素作为筛选工作浓度。
4.表达Nectin-4细胞系的构建与筛选
将含慢病毒样颗粒的293T细胞培养上清感染MDBK细胞。感染24h后，重复感染一次。第二次感染24h后，用含1μg/mL工作浓度的嘌呤霉素培养基进行筛选，每隔1d弃去细胞培养上清液，更换含嘌呤霉素的新培养液。用含工作浓度的嘌呤霉素培养基连续传5代进行加压筛选。
5.Nectin-4基因组mRNA转录水平检测
提取第10代MDBK-Nectin-4细胞的基因组总RNA，用M-MLV反转录获得cDNA，并以cDNA为模板，用引物Nectin-4-up和Nectin-4-dw进行PCR扩增。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明，RT-PCR检测第10代MDBK-Nectin-4细胞能测出Nectin-4基因，而MDBK细胞中未检测出，结果见图4。从而表明，Nectin-4基因能在MDBK-Nectin-4细胞中转录成mRNA。
7.MDBK-Nectin-4细胞系遗传稳定性检测
将MDBK-Nectin-4细胞系进行传代至第20代。期间取第5、10、15和20代次细胞，将细胞反复冻融裂解后，分别进行Western blot鉴定，方法同4。同时设置MDBK细胞作对照，结果见图5。
将MDBK-Nectin-4细胞传代至第20代，分别取第5、10、15和20代次细胞，利用IFA实验观察Nectin-4的表达。结果表明，传至第20代的MDBK-Nectin-4细胞依然能够稳定表达Nectin-4蛋白，且Nectin-4蛋白主要分布在细胞膜上，结果见图6。
8.PPRV感染MDKB-Nectin-4细胞系实验
PPRV以0.1MOI的量接种长成单层的MDBK-Nectin-4细胞系，病毒吸附1h后更换为含2％FBS的DMEM维持液培养5～6d，同时设置MDBK细胞接种PPRV作对照。每天观察比较MDBK-Nectin-4细胞系和MDBK细胞出现CPE的时间。
PPRV感染MDBK-Nectin-4细胞后48h即出现一定程度的CPE，96h后出现了明显的CPE。对照组MDBK细胞在接种PPRV后96h才开始形成一定程度的CPE，结果见图7。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界。
序列表
<110> 安徽农业大学
<120> 一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的细胞系及其构建方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工引物序列(未知)
<400> 1
tccccccggg atgcctctgt ccctgggagc cg 32
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工引物序列(未知)
<400> 2
gctctagaga ccagatgccc ccgcccgttg at 32
<210> 3
<211> 1530
<212> DNA
<213> 绵羊(Ovis aries)
<400> 3
atgcctctgt ccctgggagc cgagatgtgg ggtcctgtgg cctggctgct gctgctgctc 60
ctggcatcat ttacaggtca gtgccttgct ggtgagctgg agacctcgga cctggtgacc 120
gtggtgctgg gccaggatgc caggctgccc tgcttctacc gaggggatcc gggcgagcag 180
gtggagcagg tggcatgggc tcgcgtggat gcgggcgagg gcggccggga actggcactg 240
ctgaactcca aatacgggct gcacgtgagc tcagcctacg agggccgcgt ggaacagccg 300
ccgcccccac ggaaccccct ggatggtgcg gtactgctgc gcaacgcggt gcaggctgac 360
gagggcgagt acgagtgtcg cgtcagcacc ttccctgccg gaagcttcca ggcaaggctg 420
cggctccgcg ttctggtgcc tcccttgccc tcgctgaatc ctggtccggc gctagaagag 480
ggccagggcc tgacactggc agcctcctgc acagcagagg gcagcccggc ccccagcgtt 540
acctgggaca cagaggtcaa gggcacagca tcccaccgct ccttcacaca ctcccgctca 600
gctgccgtca cttcagaatt ccatctggtg cccagccgca gcatgaacgg acagccactt 660
acctgcgtgg tatcccaccc tggcctgctg caggaccaac ggatcaccca catcctccag 720
gtggccttcc ttgcggaagc ctctgtgagg ggccttgaag accgaaagct gtggcaggtt 780
ggcagagaag gggctatgct caagtgcttg agtgaagggc agcccccgcc ctcgtacaac 840
tggacacggc tggacgggcc tctgcccagt ggggtacgag cagaaggaga caccctgggc 900
ttccccacac tgaccactga gcacagtggc acatacgtct gccgtgttag caatgcactc 960
tcctcaaggg attctcaggt ggtggtggac gttcttgacc ccgaggatgc cgccgggaag 1020
caggtggacc tcgtgtcggc ctccgtggta gtggtgggcg taattgctgc actcttgttc 1080
tgccttctgg tggtggtcgt ggtgctcatg tcccgatacc atcggcgcaa ggcccagcag 1140
atgacccaga aatatgagga ggagctgacc ctgaccaggg agaactccat ccggaggctg 1200
cattcccatc actcggaccc cagaaaccag ccggaggaga gtgtagggct gagagccgag 1260
ggccaccccg atagtctcaa ggacaacagt agctgctctg tgatgagtga agagccggag 1320
ggccgcagtt actccacgct gaccacagtg agggagattg aaacgcagac cgagctgccg 1380
tctccaggcc ctgggcgggc agaggaggag gaggatcggg atgaaggcat caagcaggcc 1440
atgaaccatt ttgttcagga gaacgggacc ctgcgggcca agcccacggg caatggcatc 1500
tacatcaacg ggcgggggca tctggtctga 1530

Claims (9)

1.一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的细胞系，其特征在于，所述细胞系为MDBK-Nectin-4细胞系，所述细胞系整合了小反刍兽疫病毒受体Nectin-4基因，所述细胞系能稳定、高效表达Nectin-4基因。
2.根据权利要求1所述的一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)利用基因重组技术将小反刍兽疫病毒受体Nectin-4基因克隆到慢病毒表达系统pLOV-eGFP载体中，得到重组表达载体pLOV-eGFP-Nectin-4；
(2)将构建好的重组表达载体pLOV-eGFP-Nectin-4转染293T细胞，通过嘌呤霉素筛选出阳性细胞系；
(3)对阳性细胞系进行IFA和Western blot鉴定，得到稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的细胞系。
3.根据权利要求2所述的一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：先根据小反刍兽疫病毒受体Nectin-4基因，设计带有XmaI和XbaI双酶切位点及保护碱基的小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的特异性引物，再通过PCR反应扩增含有上述酶切位点的小反刍兽疫病毒受体Nectin-4基因，然后在慢病毒表达系统pLOV-eGFP载体的XmaI和XbaI多克隆位点插入小反刍兽疫病毒受体Nectin-4基因，得到重组表达载体pLOV-eGFP-Nectin-4。
4.根据权利要求3所述的一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的细胞系的构建方法，其特征在于，所述特异引物的序列为：
上游引物F：5’-TCCCCCCGGGATGCCTCTGTCCCTGGGAGCCG-3’
下游引物R：5’-GCTCTAGAGACCAGATGCCCCCGCCCGTTGAT-3’。
5.根据权利要求3所述的一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的细胞系的构建方法，其特征在于，所述PCR的反应体系为：上下游引物各2μl、模板DNA 1μg、rTaq DNA聚合酶(Mix)50μl，加双蒸水补齐至100μl。
6.根据权利要求2所述的一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为：将构建好的重组表达载体pLOV-eGFP-Nectin-4先与包装质粒pSPAX2和外膜质粒pMD2.G通过脂质体转染的方式转染293T细胞，再通过含嘌呤霉素筛的培养基筛选出阳性重组细胞系。
7.根据权利要求2所述的一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中一抗均为鼠源Nectin-4多抗血清。
8.根据权利要求2所述的一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中IFA的二抗为FITC标记的羊抗鼠IgG抗体，Western blot的二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG抗体。
9.根据权利要求2所述的一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中取第5、10、15和20代次的MDBK-Nectin-4细胞进行Western blot和IFA检测，以鉴定Nectin-4蛋白的表达。将上述代次的MDBK-Nectin-4细胞系反复冻融3次，裂解后进行SDS-PAGE电泳。将蛋白转印至硝酸纤维素膜后，依次与鼠源Nectin-4多抗血清(1:200倍稀释)和HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(1:2000)反应，利用ECL化学发光试剂盒进行显色。将上述代次的MDBK-Nectin-4细胞系用丙酮和甲醇的混合液固定，然后进行IFA检测。一抗为鼠源Nectin-4多抗血清(1:200倍稀释)，二抗为FITC标记的羊抗鼠IgG抗体(1:1000倍稀释)，荧光显微镜下观察结果。
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