CN104762274B - 禽呼肠孤病毒σNS蛋白及其相关生物材料的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种禽呼肠孤病毒σNS蛋白及其相关生物材料的应用。本发明公开禽呼肠孤病毒的σNS蛋白或其相关生物材料在制备提高细胞内磷酸化的蛋白激酶B的表达量的产品中的应用。本发明首次证实了ARV的σA蛋白、σNS蛋白能激活PI3K/Akt信号通路，使细胞P‑Akt的表达量升高，因此，有望通过抑制ARVσA蛋白和/或σNS蛋白的表达，来抑制PI3K/Akt信号通路的激活进而抑制ARV的复制，从而发现ARV的治疗药物的新靶点。本发明为ARV的治疗提供了新的方向和思路。

Description

禽呼肠孤病毒σNS蛋白及其相关生物材料的应用
技术领域
本发明涉及一种禽呼肠孤病毒σNS蛋白及其相关生物材料的应用，属于生物技术领域。
背景技术
真核细胞内存在多条信号转导通路，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路在众多信号通路中发挥十分重要的作用，可通过其下游效应分子蛋白激酶B(Akt)来调控多种细胞功能，如细胞增殖与分化、抑制细胞凋亡等，病毒感染通常会干扰该信号通路。PI3K是由催化亚基p110和调节亚基p85所组成的二聚体蛋白，具有类脂激酶和蛋白激酶的双重活性。研究表明，病毒蛋白或细胞蛋白通过PXXP(P为脯氨酸，X为任意氨基酸)或YXXXM/YXXM(Y为酪氨酸，X为任意氨基酸，M为蛋氨酸)基序与P85结合，从而激活PI3K/Akt信号通路，使磷酸化的Akt(P-Akt)表达量升高，实现抑制细胞凋亡的发生。
大量的研究资料表明，当病毒侵入宿主细胞后，被感染的细胞能被宿主的免疫系统识别，并通过诱导细胞凋亡而对感染了病毒的细胞加以清除，从而限制病毒在细胞内的复制及传播。但是在选择压力的作用下，许多病毒已经进化出某些可以逃避细胞凋亡的机制，使得病毒在宿主细胞死亡之前能完成其复制周期，这些对抗措施通常是由病毒蛋白来介导的。许多病毒通过自身的某些蛋白与PI3K的P85调节亚基结合，进而激活PI3K/Akt信号通路，促进P-Akt的转录表达。P-Akt表达量的升高，可磷酸化许多信号蛋白，并通过这些蛋白调节与细胞生存、增殖、迁移、分化和凋亡有关的多条下游信号转导通路，如通过抑制促凋亡蛋白的活性，从而抑制凋亡刺激信号诱发的细胞凋亡，还可通过控制凋亡调节基因的表达而抑制细胞凋亡。
Labrada和Shih等的研究表明，禽呼肠孤病毒(Avian reovirus，ARV)引起感染细胞出现细胞凋亡是发生在其感染的中后期。Lin等使用ARV感染Vero细胞后，通过Westernblot检测P-Akt的表达量，从病毒的角度证实了ARV感染的早期激活了PI3K/Akt信号通路，从而抑制了感染细胞的凋亡，以有利于ARV完成其复制周期。ARV怎样来启动PI3K/Akt信号通路，实现抑制感染细胞的凋亡，目前还不清楚，找出能激活PI3K/Akt信号通路的ARV物质，从细胞信号转导的角度揭示ARV的分子致病机制，可以为寻找抗ARV药物作用靶点提供新的思路。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是确定激活PI3K/Akt信号通路的ARV蛋白，进而可将其作为抗ARV药物的作用靶点。
为了解决以上技术问题，本发明提供禽呼肠孤病毒的σNS蛋白或其相关生物材料在制备提高细胞内磷酸化的蛋白激酶B(P-Akt)的表达量的产品中的应用；
所述禽呼肠孤病毒的σNS蛋白的相关生物材料，为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)编码所述禽呼肠孤病毒的σNS蛋白的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)表达禽呼肠孤病毒σNS蛋白的重组细胞。
为了解决以上技术问题，本发明还提供禽呼肠孤病毒σNS蛋白或其相关的生物材料在制备激活细胞内PI3K/Akt信号通路产品中的应用；
所述禽呼肠孤病毒的σNS蛋白的相关生物材料，为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)编码所述禽呼肠孤病毒的σNS蛋白的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)表达禽呼肠孤病毒σNS蛋白的重组细胞。
上述生物材料中，B1)所述的核酸分子为如下1)或2)或3)所示的核酸分子，即σNS基因：
1)核苷酸序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述σNS蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述σNS蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；
其中，SEQ ID No.2由1104个核苷酸组成，SEQ ID No.2的核苷酸编码SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；
所述σNS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码σNS蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明人工合成的编码σNS蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码σNS蛋白且具有相同功能的蛋白质，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列；
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性；
上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性；
上述生物材料中，B2)所述的含有编码禽呼肠孤病毒的σNS蛋白的核酸分子的表达盒(σNS基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达σNS的DNA，该DNA不但可包括启动σNS基因转录的启动子，还可包括终止σNS基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列；
上述生物材料中，可用现有的表达载体构建含有所述σNS基因表达盒的重组载体。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体；
上述生物材料中，所述的微生物可为原核微生物或真核微生物；所述原核微生物可为细菌；所述细菌可为埃希氏菌属细菌；所述埃希氏菌属细菌可为大肠杆菌；所述真核微生物可为藻类、真菌、原生动物；所述真菌可为单细胞真菌；所述单细胞真菌可为酵母菌。
上述生物材料中，所述重组载体为将pcAGEN的Xho Ⅰ和Not Ⅰ位点间的DNA替换为SEQ ID No.2所示的DNA，保持pcAGEN的其余序列不变，得到的表达所述禽呼肠孤病毒的σNS蛋白的重组表达载体。
为了解决以上技术问题，本发明还提供表达禽呼肠孤病毒σNS蛋白的重组细胞在制备筛选抑制感染禽呼肠孤病毒的细胞中禽呼肠孤病毒σNS蛋白活性的物质的细胞模型中的应用；
本文中所述表达禽呼肠孤病毒σA蛋白的重组细胞可为表达禽呼肠孤病毒σA蛋白的重组哺乳动物细胞，如表达禽呼肠孤病毒σA蛋白的重组Vero细胞。
为了解决以上技术问题，本发明还提供抑制禽呼肠孤病毒σNS蛋白活性的物质在制备预防和/或治疗禽呼肠孤病毒引起的疾病的产品中的应用。
为了解决以上技术问题，本发明还提供抑制禽呼肠孤病毒σNS蛋白活性的物质在制备抑制禽呼肠孤病毒的生长和/或增殖的产品中的应用。
为了解决以上技术问题，本发明还提供抑制禽呼肠孤病毒σNS蛋白表达的物质在制备预防和/或治疗禽呼肠孤病毒引起的疾病的产品中的应用。
为了解决以上技术问题，本发明还提供抑制禽呼肠孤病毒σNS蛋白表达的物质在制备抑制禽呼肠孤病毒的生长和/或增殖的产品中的应用。
为了解决以上技术问题，本发明还提供抑制禽呼肠孤病毒σNS基因表达的物质在制备预防和/或治疗禽呼肠孤病毒引起的疾病的产品中的应用。
为了解决以上技术问题，本发明还提供抑制禽呼肠孤病毒σNS基因表达的物质在制备抑制禽呼肠孤病毒的生长和/或增殖的产品中的应用。
为了解决以上技术问题，本发明还提供以禽呼肠孤病毒σNS蛋白为作用靶点的物质在制备预防和/或治疗禽呼肠孤病毒引起的疾病的产品中的应用；
或，
为了解决以上技术问题，本发明还提供禽呼肠孤病毒σNS蛋白为作用靶点的物质在制备抑制禽呼肠孤病毒的生长和/或增殖的产品中的应用；
或，
为了解决以上技术问题，本发明还提供禽呼肠孤病毒σNS基因为作用靶点的物质在制备预防和/或治疗禽呼肠孤病毒引起的疾病的产品中的应用；
或，
为了解决以上技术问题，本发明还提供禽呼肠孤病毒σNS基因为作用靶点的物质在制备抑制禽呼肠孤病毒的生长和/或增殖的产品中的应用。
上述任一所述的应用中，所述σNS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述σNS基因为如下1)或2)或3)所示的核酸分子：
1)核苷酸序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述σNS蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述σNS蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码σNS蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明人工合成的编码σNS蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码σNS蛋白且具有相同功能的蛋白质，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列；
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性；
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；
所述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述任一所述的应用中，所述禽呼肠孤病毒σNS蛋白活性具体为其提高细胞内磷酸化的蛋白激酶B(P-Akt)的表达量和/或激活细胞内PI3K/Akt信号通路的活性。
本发明证明，与阴性细胞对照组和空载体pcAGEN组相比，转染σA-pcAGEN或σNS-pcAGEN的Vero细胞的P-Akt的表达量明显升高。而转染σA-pcAGEN或σNS-pcAGEN前在Vero细胞培养液中加入PI3K特异性抑制剂LY294002时所检测到的P-Akt，与阴性细胞对照组和空载体pcAGEN组相比并没有升高，说明Akt的磷酸化依赖于PI3K的激活，本发明首次证实了ARV的σA蛋白、σNS蛋白能激活PI3K/Akt信号通路，使细胞P-Akt的表达量升高。
鉴于PI3K/Akt信号通路的激活可抑制宿主细胞的凋亡，以有利于病毒的复制，在实际应用中，可将ARV的σA蛋白和/或σNS蛋白作为抗ARV药物的作用靶点，通过抑制感染ARV的细胞中ARVσA蛋白和/或σNS蛋白的表达，来抑制PI3K/Akt信号通路的激活，促进感染ARV的细胞的凋亡，进而抑制ARV的复制，本发明为ARV的治疗提供了新的方向和思路。也可将表达ARV的σA蛋白和/或σNS蛋白的重组细胞作为筛选抑制感染ARV的细胞中ARVσA蛋白和/或σNS蛋白的物质的细胞模型以筛选预防和/或治疗禽呼肠孤病毒引起的疾病的产品。
附图说明
图1为σA基因片段1、σNS基因片段1、μA基因片段1、μB基因片段1和μNS基因片段1的琼脂糖凝胶电泳结果。
图2为转染6h后的各组细胞的间接免疫荧光检测结果。
图3为转染6h后的各组细胞的目的蛋白的Western blot检测结果。
图4为转染6h后的各组细胞的流式细胞术检测P-Akt的表达结果。图中的百分数为P-Akt阳性细胞的百分率。
图5为转染6h后的Western blot检测P-Akt的表达结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的实验如无特殊说明均为3次重复。
禽呼肠孤病毒S1133标准强毒株(ARV-S1133)(Avian reovirus)为中国兽医药品监察所产品，产品目录号为AV2311。
真核表达载体pcAGEN在文献“Weng Y,Lu W,Harmon A,Xiang X,Deng Q,Song M,et al.The cellular endosomal sorting complex required for transport pathwayis not involved in avian metapneumovirus budding in a virus-like-particleexpression system.J Gen Virol.2011；92:1205-13”中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
Vero细胞为中国典型培养物保藏中心产品。
pMD18-T载体为宝生物工程(大连)有限公司产品。
LipofectamineTM 2000为Invitrogen公司产品。
Alexa fluor 488标记的羊抗鸡IgY、Alexa fluor 488标记的羊抗兔IgG均为abcam公司产品，产品目录号分别为ab150173、ab150081。
Phospho-Akt单克隆抗体为CST公司产品，产品目录号为2965。
Cytofix固定/破膜试剂盒为BD公司产品。
PI3K特异性抑制剂LY294002为CST公司产品。
实施例1、禽呼肠孤病毒σA蛋白和σNS蛋白激活PI3K/Akt信号通路
一、引物的设计与合成
根据禽呼肠孤病毒(ARV)的σA、σNS、μA、μB和μNS的基因序列，设计并合成表1的5对引物。
表1引物序列
表1中，斜体为Xho Ⅰ或Not Ⅰ识别位点，下划线所示的序列为Kozak序列。
二、σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN、μA-pcAGEN、μB-pcAGEN和μNS-pcAGEN载体的构建
(一)提取禽呼肠孤病毒S1133标准强毒株(ARV-S1133)的总RNA，并反转录为cDNA,以cDNA为模板，以σA-F和σA-R为引物进行PCR扩增，得到含有σA基因的PCR产物，将该PCR产物记为σA基因片段1；或以σNS-F和σNS-R为引物进行PCR扩增，得到含有SEQ ID No.2所示的σNS基因的PCR产物，将该PCR产物记为σNS基因片段1；或以μA-F和μA-R为引物进行PCR扩增，得到含有μA基因的PCR产物，将该PCR产物记为μA基因片段1；或以μB-F和μB-R为引物进行PCR扩增，得到含有μB基因的PCR产物，将该PCR产物记为μB基因片段1；或以μNS-F和μNS-R为引物进行PCR扩增，得到含有μNS基因的PCR产物，将该PCR产物记为μNS基因片段1。
σA基因片段1、σNS基因片段1、μA基因片段1、μB基因片段1和μNS基因片段1的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。
图1中，M为DNA分子量标准DL2500bp Ladder；1-5泳道分别为σA基因片段1、σNS基因片段1、μA基因片段1、μB基因片段1和μNS基因片段1。
(二)分别将σA基因片段1、σNS基因片段1、μA基因片段1、μB基因片段1和μNS基因片段1插入pMD18-T，得到σA-pMD18-T、σNS-pMD18-T、μA-pMD18-T、μB-pMD18-T和μNS-pMD18-T重组质粒，将σA-pMD18-T、σNS-pMD18-T、μA-pMD18-T、μB-pMD18-T和μNS-pMD18-T重组质粒送测序，结果正确。测序结果表明σA-pMD18-T、σNS-pMD18-T、μA-pMD18-T、μB-pMD18-T和μNS-pMD18-T重组质粒为分别在pMD18-T中正确插入了σA基因片段1、σNS基因片段1、μA基因片段1、μB基因片段1和μNS基因片段1。
(三)Xho Ⅰ和Not Ⅰ分别双酶切σA-pMD18-T、σNS-pMD18-T、μA-pMD18-T、μB-pMD18-T和μNS-pMD18-T，分别得到σA基因片段2、σNS基因片段2、μA基因片段2、μB基因片段2和μNS基因片段2；Xho Ⅰ和Not Ⅰ双酶切pcAGEN，得到载体大片段；将σA基因片段2、σNS基因片段2、μA基因片段2、μB基因片段2和μNS基因片段2分别与载体大片段连接，分别得到重组质粒σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN、μA-pcAGEN、μB-pcAGEN和μNS-pcAGEN，将σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN、μA-pcAGEN、μB-pcAGEN和μNS-pcAGEN送测序，结果正确。测序结果表明σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN、μA-pcAGEN、μB-pcAGEN和μNS-pcAGEN分别为σA、σNS、μA、μB和μNS基因片段2分别正确替换了pcAGEN的Xho Ⅰ和Not Ⅰ位点间DNA，pcAGEN的其余序列保持不变得到，得到的分别表达σA、σNS、μA、μB和μNS的重组载体。
重组质粒σNS-pcAGEN表达SEQ ID No.1所示的σNS蛋白，重组质粒σNS-pcAGEN含有SEQ ID No.2所示的σNS基因。
三、细胞转染
参照LipofectamineTM 2000试剂盒的说明书，将σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN、μA-pcAGEN、μB-pcAGEN、μNS-pcAGEN和pcAGEN分别转染6孔板上长成的单层Vero细胞，对应得到σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN、μA-pcAGEN、μB-pcAGEN和μNS-pcAGEN转染的Vero细胞组和空载体pcAGEN组，同时设立阴性细胞对照组(将上述质粒替换为等体积的超纯水，其余步骤不变)。
四、间接免疫荧光和Western blot检测σA、σNS、μA、μB和μNS的表达
分别在转染2h、4h、6h、12h和24h后，分别收集σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN、μA-pcAGEN、μB-pcAGEN和μNS-pcAGEN转染的Vero细胞组、空载体pcAGEN组及阴性细胞对照组的细胞分别进行如下操作：
(一)间接免疫荧光检测
将各组各时间点收集的细胞用PBST洗涤三次，按照500uL/孔加入-20℃保存的冷丙酮(丙酮：乙醇按体积比为2：3混匀)进行固定，室温作用10min；用PBST洗涤三次，按照200uL/孔加入用PBS 1：100倍稀释的ARV鸡阳性血清，37℃作用lh；用PBST洗涤三次，按照200uL/孔加入用PBS 1：500稀释的Alexa fluor 488标记的羊抗鸡IgY，37℃作用lh；用PBST洗涤三次，按照100uL/孔加入甘油缓冲液(甘油：PBS按体积比1：1混匀)，将细胞在倒置荧光显微镜下观察。
转染6h后的各组细胞的间接免疫荧光检测结果如图2所示。
图2中，A为阴性细胞对照组；B为空载体pcAGEN组；C为σA-pcAGEN转染的Vero细胞组；D为σNS-pcAGEN转染的Vero细胞组；E为μA-pcAGEN转染的Vero细胞组；F为μB-pcAGEN转染的Vero细胞组；G为μNS-pcAGEN转染的Vero细胞组。
(二)Western blot检测
将各组各时间点收集的细胞参照文献“Xie Z,Qin C,Xie L,et al.Recombinantprotein-based ELISA for detection and differentiation of antibodies againstavian reovirus in vaccinated and non-vaccinated chickens[J].J Virol Methods,2010,165(1):108-111.”的方法，对对应的目的蛋白σA、σNS、μA、μB和μNS进行Western blot检测，检测中所使用的ARV阳性血清参照文献“秦春香,谢芝勋,谢丽基,刘加波,庞耀珊,邓显文,谢志勤.利用σ3和σ2重组蛋白检测禽呼肠孤病毒抗体ELISA的建立[J].西南农业学报,2009,02:492-496.”公开的方法制备。
转染6h后的各组细胞的目的蛋白的Western blot检测结果如图3所示。
图3中，1为阴性细胞对照组；2为空载体pcAGEN组；3为σA-pcAGEN转染的Vero细胞组；4为σNS-pcAGEN转染的Vero细胞组；5为μA-pcAGEN转染的Vero细胞组；6为μB-pcAGEN转染的Vero细胞组；7为μNS-pcAGEN转染的Vero细胞组。
图2和图3表明，转染6小时后，目的蛋白σA、σNS、μA、μB和μNS分别在σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN、μA-pcAGEN、μB-pcAGEN和μNS-pcAGEN转染的Vero细胞组得到了较好的表达，而空载体pcAGEN组和阴性细胞对照组均为阴性，无任何目的蛋白的表达。
五、流式细胞术和Western blot检测P-Akt的表达
由于ARV激活磷酸化的蛋白激酶B(P-Akt)是发生在ARV感染的早期，并且根据步骤四的检测结果，分别取σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN、μA-pcAGEN、μB-pcAGEN和μNS-pcAGEN转染的Vero细胞组、空载体pcAGEN组及阴性细胞对照组转染4h、6h和12h后的细胞，进行如下流式细胞术和Western blot的检测。
(一)流式细胞术检测
将各组各时间点收集的细胞用Cytofix固定/破膜试剂盒固定细胞20分钟，FACS洗涤2次，加入用PBS 1：100稀释的Phospho-Akt单克隆抗体作用30分钟，FACS洗涤2次，加入用PBS 1：500稀释的Alexa fluor 488标记的羊抗兔IgG作用30分钟，FACS洗涤1次，加入300ulFACS重悬浮细胞，上流式细胞仪检测磷酸化的蛋白激酶B(P-Akt)的表达量，记录分析数据。
转染6h后的各组细胞的流式细胞术检测P-Akt的表达结果如图4所示。
图4中，A为阴性细胞对照组；B为空载体pcAGEN组；C为σA-pcAGEN转染的Vero细胞组；D为σNS-pcAGEN转染的Vero细胞组；E为μA-pcAGEN转染的Vero细胞组；F为μB-pcAGEN转染的Vero细胞组；G为μNS-pcAGEN转染的Vero细胞组。
转染4、6、12h后的阴性细胞对照组、空载体pcAGEN组、σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN转染的Vero细胞组检测P-Akt的阳性率结果如表2所示。
(二)Western blot的检测
将各组各时间点收集的细胞参照文献“Wang X,Zhang H,Abel AM,et al.Role ofphosphatidylinositol 3-kinase(PI3K)and Akt1 kinase in porcine reproductiveand respiratory syndrome virus(PRRSV)replication[J].Arch Virol,2014,159(8):2091-2096.”的方法对Vero细胞中的P-Akt进行Western blot检测。
转染6h后的Western blot检测P-Akt的表达结果如图5所示。
图5中，1为阴性细胞对照组；2为空载体pcAGEN组；3为σA-pcAGEN转染的Vero细胞组；4为σNS-pcAGEN转染的Vero细胞组；5为μA-pcAGEN转染的Vero细胞组；6为μB-pcAGEN转染的Vero细胞组；7为μNS-pcAGEN转染的Vero细胞组。
流式细胞术和Western blot检测结果表明，σA-pcAGEN和σNS-pcAGEN在转染Vero细胞4h,6h和12h后，P-Akt的阳性率均高于阴性细胞对照组和空载体pcAGEN组(P<0.01)，表明转染σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN的Vero细胞P-Akt的表达量明显高于阴性细胞对照组和空载体pcAGEN组(如表2所示)，在σA-pcAGEN和σNS-pcAGEN转染的不同时间里(4h,6h和12h)，Vero细胞P-Akt的表达量差异不大。
而μA-pcAGEN、μB-pcAGEN和μNS-pcAGEN转染细胞后，P-Akt的阳性率与阴性细胞对照组和空载体pcAGEN组差异不大(P>0.05)，表明P-Akt的表达量未产生明显变化。
表2 FCM检测P-Akt的表达水平
表2中，同一行中相同字母代表差异不显著(P>0.05)，不同字母代表差异极显著(P<0.01)。
六、依赖于PI3K途径的检测
参照LipofectamineTM 2000试剂盒的说明书，将σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN和pcAGEN分别转染6孔板上长成单层的Vero细胞，分别对应得到σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN转染的Vero细胞组和空载体pcAGEN组，同时设立阴性细胞对照组(将上述质粒替换为等体积的超纯水，其余步骤不变)。
在σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN转染6孔板上长成单层的Vero细胞前1h分别在Vero细胞中加入PI3K特异性抑制剂LY294002，并使其终浓度为20μM，其余步骤与上述实验步骤相同，分别得到LY294002+σA-pcAGEN转染的Vero细胞组和LY294002+σNS-pcAGEN转染的Vero细胞组。
根据步骤五，采用流式细胞术和Western blot方法检测各组的P-Akt的表达，分析转染σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN后，Vero细胞P-Akt表达的升高是否依赖于PI3K的激活。
流式细胞术检测结果表明，转染LY294002+σA-pcAGEN的Vero细胞和转染LY294002+σNS-pcAGEN的Vero细胞，P-Akt的表达量均明显少于转染σA-pcAGEN的的Vero细胞和转染σNS-pcAGEN的Vero细胞(P<0.05)，而与空载体pcAGEN组和阴性细胞对照组的P-Akt的表达量差异不大(P>0.05)，说明细胞P-Akt表达的升高，依赖于σA蛋白、σNS蛋白对PI3K激活。Western blot的检测结果与流式细胞术检测结果一致。
本发明首次证实了ARV的σA蛋白、σNS蛋白能激活PI3K/Akt信号通路，使细胞P-Akt的表达量升高。

Claims (1)

1.禽呼肠孤病毒σNS蛋白或其相关的生物材料在制备激活细胞内PI3K/Akt信号通路产品中的应用；
所述禽呼肠孤病毒的σNS蛋白的相关生物材料，为下述B1）至B8）中的任一种：
B1）编码所述禽呼肠孤病毒的σNS蛋白的核酸分子；
B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；
B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体；
B4）含有B2）所述表达盒的重组载体；
B5）含有B1）所述核酸分子的重组微生物；
B6）含有B2）所述表达盒的重组微生物；
B7）含有B3）所述重组载体的重组微生物；
B8）含有B4）所述重组载体的重组微生物。
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