CN104450731A - 一种鸡γ干扰素蛋白的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明首先提供一种鸡γ干扰素蛋白的基因，该基因经过核苷酸突变后，能在大肠杆菌中高效的表达可溶性鸡γ干扰素蛋白，该基因的序列为SEQ ID NO:1。本发明通过对鸡γ干扰素基因序列的改变，实现了鸡γ干扰素蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达。该表达产物为胞液中可溶性蛋白，具有天然鸡γ干扰素蛋白的生物活性，同时本发明也提供了一种工程菌诱导表达工艺。通过细胞病变抑制试验、鸡胚病毒抑制试验、免疫增强试验、动物攻毒保护试验，证明表达的鸡γ干扰素蛋白具有良好的抗病毒和免疫增强活性。
Description
技术领域
本发明属于重组蛋白表达技术领域，具体涉及一种可溶性鸡γ干扰素蛋白的生产方法。
背景技术
干扰素是一类由T淋巴细胞和NK细胞产生的低分子可溶性多功能糖蛋白，能增强细胞毒性T细胞功能，促进B细胞分化和活化，诱导动物细胞产生多种抗病毒、抗肿瘤活性的细胞因子，具有良好的免疫调节作用(HOU Y-D.Molecular virology.Beijing:Xueyuan Press,1990.)。
鸡γ干扰素最早由Issaacs等于1957年利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒干扰现象时发现的，之后得益于生物技术的飞速发展，鸡γ干扰素的生物学研究进入到一个更为深入广泛的研究阶段。近几年，Digby等国内外学者相继报道了鸡γ干扰素基因序列，在基因克隆、序列分析等方面进行了大量的研究。已有的研究表明，鸡γ干扰素开放性阅读框有495个碱基，编码19个氨基酸的信号肽和145个氨基酸的成熟蛋白。鸡γ干扰素对某些病毒(腺病毒，流感病毒，水疱性口炎病毒等)的生长及繁殖有较强的抑制作用，可作为一种活化机体细胞的抗病毒生物制剂，同时也可作为免疫佐剂提高疫苗的保护效力(Kaiser P,Wain H M,Rothwell L.Structure of thechicken interferon-γgene and comparison to mammalianhomologues.Gene,1998,207(1):25-32；Digby M R,Lowenthal J W.Cloning andexpression of the chicken interferon-gamma gene.J IFN CytoRes,1995,15:939-945；Weining K C,Schultz U,Munster U,et al.Biologicalproperties of recombinant chicken interferon-gamma.Eur J Immunol.1996,26:2440-2447；Michalski W P,Shiell B J,ONeil TE,et al.Recombinant chickenIFN-gamma expressed in E.coli:analysis of C-terminal truncation and effect onbiologic activity.J IFN Cyto Res,1999,19:383-392；Yeh H Y,Winslow B J,JunkerD E,et al.In vitro effects of recombinant chicken interferon-gamma on immunecells.J IFN Cyto Res,1999,19:687-691)。
为了更广泛的利用鸡γ-干扰素蛋白，研究者将鸡γ-干扰素基因克隆到大肠杆菌中进行表达。但鸡γ-干扰素在原核细胞中表达主要是以不可溶的包涵体形式存在，这就需要经过复杂的变性、复性过程才能使用。(戴建华,秦爱建,许金俊等.鸡γ-干扰素基因的克隆及其在原核和真核系统中的表达[J].中国预防兽医学报,2003,25(4):249-253；鲍鸣,仲大莲等.鸡γ-干扰素基因的克隆及原核表达[J].安徽农业大学学报,2004,31(1):92-95；蔡梅红,曹瑞兵,周斌等.鸡γ-干扰素成熟蛋白基因的表达及其产物抗病毒活性测定,中国病毒学[J],2004,19(1):32-35；史耀旭,关贵全,高金亮党志胜等.鸡γ-干扰素基因的克隆及原核表达[J].中国兽药杂志,2006,40(7):12-16；吴树华宫鹏涛等.鸡γ-干扰素基因在大肠杆菌中的表达[J].青岛农业大学学报,2009,26(1):8-11.)。而包涵体蛋白没有生物活性，后续纯化非常复杂，而且在复性过程中很难做到完全复性，很难达到50％的复性。因此，为了满足对鸡γ干扰素的需有，有必要提供一种鸡γ干扰素的可溶性表达方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种可溶性鸡γ干扰素蛋白的生产方法，从而可以高效的表达可溶性鸡γ干扰素蛋白。
本发明首先提供一种鸡γ干扰素蛋白的基因，该基因经过核苷酸突变后，能在大肠杆菌中高效的表达可溶性鸡γ干扰素蛋白，该基因的序列为SEQ ID NO:1。
ATGCATACCGCAAGCAGCCTTAATCTTGTTCAGCTTCAGGACGACATTGACAAACTGAAAGCAGACTTTAATAGCAGCCATAGCGATGTTGCAGATGGTGGACCTATTATTGTAGAGAAACTGAAGAACTGGACAGAGAGAAATGAGAAAAGGATCATACTGAGCCAGATTGTTTCGATGTACTTGGAAATGCTTGAAAACACTGACAAGTCAAAGCCGCACATCAAACACATATCTGAGGAGCTCTATACTCTGAAAAACAACCTTCCTGATGGCGTGAAGAAGGTGAAAGATATCATGGACCTGGCCAAGCTCCCGATGAACGACTTGAGAATCCAGCGCAAAGCCGCGAATGAACTCTTCAGCATCTTACAGAAGCTGGTGGATCCTCCGAGTTTCAAAAGGAAACGTAGCCAGAGCCAGCGTCGTTGTAATTGTTAA
用于扩增上述基因的引物，其序列信息如下：
CHIF1:5′-TTGAATTCATGCATACCGCAAGCAG-3′(SEQ ID NO:2)；
CHIF2:5′-GGCGTCGACTTAACAATTACAACGA-3′(SEQ ID NO:3)。
本发明还提供一种重组表达载体，为携带有上述基因片段的原核表达载体；
上述的表达载体优选为28a-CHIF；
本发明还提供一种重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌携带有上述的重组表达载体。
本发明还提供一种可溶性鸡γ干扰素蛋白的生产方法，是用上述的重组大肠杆菌来表达鸡γ干扰素蛋白。
本发明通过对鸡γ干扰素基因序列的改变，实现了鸡γ干扰素蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达。该表达产物为胞液中可溶性蛋白，具有天然鸡γ干扰素蛋白的生物活性，同时本发明也提供了一种工程菌诱导表达工艺。通过细胞病变抑制试验、鸡胚病毒抑制试验、免疫增强试验、动物攻毒保护试验，证明表达的鸡γ干扰素蛋白具有良好的抗病毒和免疫增强活性。
附图说明
图1：本发明实施例鸡γ干扰素基因PCR的扩增鉴定图，
其中：1、阴性对照；2、PCR扩增结果；M、DL2000 DNA Marker；
图2：本发明实施例鸡γ干扰素基因的酶切鉴定图，
其中：1、EcoRI/SalI酶切鉴定；M、DL15000 DNA Marker；
图3：本发明实施例工程菌发酵诱导表达产物的SDS-PAGE电泳检定图；
其中：1、对照菌28a-BL21全菌破碎后电泳结果；2、3表达菌28a-CHIF的全菌破碎电泳结果；4、表达菌28a-CHIF的菌体破碎上清电泳结果；5、对照菌28a-BL21菌体破碎上清结果；M、蛋白质标准Marker；
图4：本发明实施例纯化的鸡γ干扰素蛋白SDS-PAGE电泳检定图。
具体实施方式
本发明对GENBANK中发表的鸡γ干扰素基因序列，进行序列比对并对鸡γ干扰素基因的抗原表位分析基础上，人工设计突变合成了新的鸡γ干扰素基因，并将其克隆到原核表达载体中，经诱导表达，成功表达出鸡γ干扰素蛋白，试验分析结果表明表达的蛋白是以可溶性的形式存在。在细胞、鸡胚上对表达蛋白的活性检测，结果显示表达的蛋白具有良好的抗病毒活性，在CEF细胞上显著抑制VSV增殖，干扰素效价达106.7单位/ml；在鸡胚上有效抑制禽流感(H9N2)、新城疫病毒的增殖；进一步开展了动物试验，免疫试验结果表明，表达的可溶性蛋白对禽流感(H9N2)灭活疫苗、鸡传染性法氏囊(VP2)亚单位疫苗均具有显著的免疫增强作用。
下面通过实施例对本发明的方法进行详细的描述。
实施例1：鸡γ干扰素基因的改造
1、鸡γ干扰素基因的设计参考Genbank中发表的鸡γ干扰素基因，结合大肠杆菌表达的密码子偏好性，设计合成了鸡γ干扰素基因。同时设计扩增用引物。
2、鸡γ干扰素基因的扩增及回收以合成的基因为模板，进行PCR扩增。反应结束后取10μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果。结果见图1(本发明实施例鸡γ干扰素基因PCR的扩增鉴定图)。切下约500bp处目的条带，按回收试剂盒(上海生工生物工程有限公司)使用说明进行回收、纯化。
二、重组表达载体的构建
1、表达质粒28a-CHIF构建将回收的鸡γ干扰素基因EcoRI和SalI双酶切，与同样酶切的pET28a载体连接，构建表达质粒28a-CHIF，使用限制性内切酶鉴定正确，详见图2(本发明实施例鸡γ干扰素基因的酶切鉴定图)。
2、重组大肠杆菌(BL21/28a-CHIF)的构建、诱导表达
将28a-CHIF质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，涂布于卡那霉素平板上。将平板于37℃温箱中培养18h至出现单菌落。挑取单克隆菌落接种于含卡那霉素的LB液体培养基，37℃振荡培养过夜。次日接种于含卡那霉素的LB培养基，37℃振荡培养至测定合适浓度(OD600＝0.6-0.8)时，按终浓度0.02mmol/L加入0.2mmol/L乳糖，30℃诱导6h，4000rpm离心5min。用PBS重悬菌体。
3、可溶性蛋白表达量分析
将PBS重悬的菌体经超声波破碎(150hz破碎100次至液体清亮)后，4℃条件下12000r/min离心10min后，分离沉淀和上清，分别置于-20℃保存。采用Pierce BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit)对上清中的总蛋白含量进行检测，结果为3500μg/ml。取少量上清进行SDS-PAGE电泳，结果详见图3(本发明实施例工程菌发酵诱导表达产物的SDS-PAGE电泳检定图)。分析结果表明表达的鸡γ干扰素蛋白是以可溶性蛋白形式存在，同时应用Bandscan软件分析鸡γ干扰素蛋白占上清总蛋白的比例约为18％，换算结果，表达的可溶性鸡γ干扰素蛋白量为630μg/ml，表明鸡γ干扰素获得了高效表达。
4、鸡γ干扰素在大肠杆菌中表达检测及纯化将上清液经Ni柱纯化获得鸡γ干扰素蛋白。图4为纯化鸡γ干扰素蛋白SDS-PAGE电泳检定图。
三、重组表达的可溶性鸡γ干扰素蛋白的效果检测
1、细胞病变抑制法测定表达的鸡γ干扰素生物活性将提取好的鸡γ干扰素以细胞维持液作4倍系列稀释，作10个稀释度，接入长满单层的96孔细胞培养板，每孔加入0.1mL稀释好的样品，每个稀释度加入8孔。置37℃5％CO2孵箱中培养24h。倒掉培养板中的上清液。将水泡性口炎病毒稀释成100TCID50/0.1mL，加入到培养板中，每孔加0.1mL，同时设立阴性对照(只加21稀释的干扰素，不加病毒)、阳性对照(不加干扰素，只加病毒)，空白对照(不加干扰素，不加病毒)，置于37℃5％CO2温箱培养，逐日观察病变情况，判定结果并计算鸡γ干扰素效价。结果显示鸡γ干扰素蛋白可以明显抑制病毒的增殖，每0.1mL鸡γ干扰素效价为49.5单位。
2、鸡γ干扰素对病毒(禽流感H9N2、新城疫NDV)的抑制效果
为进一步验证鸡γ干扰素的抗病毒活性，在SPF鸡胚中进行了相关试验。具体方法：10日龄SPF鸡胚80枚，随机分为2组：第1组为干扰素处理组，SPF鸡胚经消毒后打孔，每胚接入鸡γ干扰素蛋白0.2mL，第2组为对照组，接入生理盐水；37℃温箱中培养24小时。禽流感病毒H9N2或新城疫NDV使用无菌生理盐水进行10倍系列稀释(10-1～10-8)，每个稀释度接种10枚SPF鸡胚(干扰素组、对照组各5枚)，0.1mL/胚。37℃温箱中培养96小时，吸取尿囊液检测其血凝效价和感染情况，按照Reed-Muench方法计算鸡γ干扰素与对照组的病毒效价，结果如下：
(1)对禽流感病毒H9N2抑制试验检测的对照组病毒效价为107.6EID50/0.1ml，鸡γ干扰素处理组的病毒效价为103.4EID50/0.1ml，抑制病毒效果明显，可降低104.2EID50/0.1ml病毒效价。
(2)对新城疫NDV抑制试验对照组病毒效价为107.2EID50/0.1ml，鸡γ干扰素处理组的病毒效价为104.1EID50/0.1ml，可以降低病毒效价为103.1EID50/0.1ml，同时对每个胚的血凝价检测，结果鸡γ干扰素处理组的平均血凝效价比对照组降低24。
3、鸡γ干扰素的免疫增强试验
(1)为验证鸡γ干扰素的免疫增强效果，开展了对禽流感病毒H9N2灭活疫苗的免疫增强试验。
将鸡γ干扰素蛋白做倍比稀释(10-1-10-3)，分别与禽流感病毒H9N2灭活抗原混合后制备水相抗原，按比例加入到油佐剂中乳化制备成复合疫苗。同时，设生理盐水与禽流感病毒H9N2灭活抗原制备疫苗作为对照。将每组疫苗分别免疫10只21日龄的SPF鸡，颈部皮下0.2ml/只，分别于免疫后14、21、28、35、42天采血检测抗体。结果，鸡γ干扰素复合疫苗免疫组的平均抗体水平自免疫后14天开始，明显高于对照组的抗体1-2.5个滴度，并且抗体水平与鸡γ干扰素的稀释度呈正相关，疫苗中的鸡γ干扰素浓度越高对应的免疫抗体水平也相应提高。已有的文献报道，未见鸡γ干扰素对于H9N2灭活疫苗的效力提高作用。试验结果证明，鸡γ干扰素可明显提高禽流感H9N2灭活疫苗的抗体水平，具有明显免疫增强作用。
(2)鸡γ干扰素对鸡传染性法氏囊VP2亚单位疫苗的免疫增强试验。
已有的文献报道，未见鸡γ干扰素对于鸡传染性法氏囊VP2亚单位疫苗的免疫增强效果试验。本试验的制苗过程同上，即鸡γ干扰素稀释(1：10)与鸡传染性法氏囊VP2蛋白混合制备复合疫苗，设正常疫苗对照。分别免疫21日龄的SPF鸡，于免疫后21天采血分离血清，检测比较2组的IBDV抗体水平。结果，鸡γ干扰素制备的复合疫苗抗体水平明显高于对照疫苗免疫组，可提高1个平均抗体滴度。试验结果证明表达的鸡γ干扰素蛋白可以显著提高鸡传染性法氏囊VP2亚单位疫苗的免疫效果。
4、鸡γ干扰素的抗病毒试验
为了验证鸡γ干扰素的抗病毒效果，开展此次试验。取35日龄SPF鸡20只，随机分为2组，第一组攻毒前24小时(即-24小时)胸部肌肉注射鸡γ干扰素蛋白，0.5ml/只，攻毒同时(0小时)重复注射，肌肉注射攻毒新城疫病毒(NDV-F48E9标准强毒株)0.1ml/只，含1000ELD50/0.1ml。攻毒后24小时重复注射干扰素；第二组为盐水对照组，同样的处理。攻毒后观察7天，记录发病死亡情况。结果，鸡γ干扰素处理组与盐水组SPF鸡均死亡，但鸡γ干扰素处理组的平均死亡时间比对照组的死亡时间延迟36小时。已有的文献未见鸡γ干扰素对于新城疫病毒的动物攻毒保护试验，本次试验结果表明，表达的鸡γ干扰素可抑制新城疫在机体内的增殖，抗病毒效果明显，具有辅助治疗作用。
Claims (6)
1.一种鸡γ干扰素蛋白的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
2.用于扩增权利要求1所述的基因的引物对，其特征在于，所述的引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
3.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体为携带有权利要求1所述的基因的原核表达载体。
4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述的原核表达载体为28a-CHIF。
5.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌携带有权利要求3所述的重组表达载体。
6.一种可溶性鸡γ干扰素蛋白的生产方法，其特征在于，所述的方法是用权利要求5所述的重组大肠杆菌来表达鸡γ干扰素蛋白。
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