CN101376879A - 表达牛干扰素(α、β或γ-干扰素)的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种表达牛干扰素(α、β或γ－干扰素)的重组新城疫LaSota弱毒疫苗。本发明还公开了制备所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗的方法和该重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备牛α、β或γ－干扰素中的应用。

Description

表达牛干扰素(α、β或γ-干扰素)的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株

技术领域

本发明涉及重组病毒疫苗领域，更具体地，本发明涉及一种表达牛干扰素(α、β或γ-干扰素)的重组新城疫LaSota弱毒疫苗。本发明还公开了制备所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗的方法和该重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备牛α、β或γ-干扰素中的应用。

背景技术

牛干扰素(Bo IFN)基因分为I型和II型，其中I型干扰素又可分为α、β、ω、τ四个类型，均为无内含子的单拷贝或多拷贝基因。干扰素以其广谱的抗病毒活性、抑制细胞分化和增殖及广泛的免疫调节能力决定了其具有巨大的应用潜力，可用来预防和治疗病毒性疾病、寄生虫病等^[1]。随着DNA重组技术的发展，人工大量生产干扰素已成为可能，从而大大降低了干扰素生产成本，增加了利用重组牛干扰素治疗牛病的可能性。牛干扰素的研究始于80年代中期，Velan等(1985)最先以人IFN-α基因为探针从牛的cDNA文库中克隆了牛IFN-α基因，从此广泛展开了对牛IFN生物学功能的研究。20世纪80年代末，随着基因工程技术的发展，重组干扰素被广泛使用。国内外对动物干扰素进行了深入的研究，目前已克隆了猪、狗、鸡等动物的多种干扰素基因，部分重组产品已应用于临床。研究报道体外表达的BoIFN蛋白可以抗水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、呼吸道合胞体病毒、副流感以及非洲猪瘟等病毒的增殖和复制^[2～7]。

大肠杆菌表达系统已广泛用于制备人和动物干扰素，所表达的重组蛋白在体内外具有明显的抗病毒活性^[8～10]。但大肠杆菌表达的蛋白经尿素溶解、变性后复性率低。而且成本高，不便于大规模生产。毕赤酵母和杆状病毒表达系统是近年来发展起来的真核表达系统，表达的外源蛋白可以获得正确折叠和糖基化^[11，12]，但两种表达系统同样存在成本高、纯化困难的缺点。新近发展起来的新城疫活病毒载体系统，使表达的外源蛋白接近天然状态，无需纯化，成本低廉，利于大规模生产有生物活性的外源蛋白。

负链RNA病毒的反向遗传操作(Reverse genetic)是通过操作病毒基因组cDNA制造新病毒的过程，其基本过程是：①组装完整的病毒基因组(或重组型基因组)cDNA克隆，5’末端精确地缀于T7启动子后，3’末端精确缀于自我剪切的核酸酶序列和T7转录终止信号之前，构成基因组cDNA转录模板；②以基因组cDNA转录模板与启动病毒复制必须的转录相关功能结构蛋白如核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)的表达质粒(T7启动子)一起，共转染整合表达T7聚合酶的病毒复制许可细胞；③24-72小时后收获培养上清，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获(rescue)病毒。对基因组cDNA进行突变、缺失或外源基因插入修饰后，通过反向遗传操作系统(reverse genetic system，RGS系统)可获得相应的突变或重组的负链RNA病毒。

申请人之前获得授权的中国专利“新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用”(申请号200510097997.8，申请日2005年9月2日)已经建立了一种新城疫LaSota弱毒疫苗株的反向遗传操作系统，并且成功救获了野生型病毒株，并且为进一步开展新城疫病毒活载体疫苗研制及重组新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)相关基础奠定了坚实的基础。

发明内容

基于重组牛干扰素在治疗牛病毒性疾病和寄生虫病方面广阔的应用前景，本发明人在已建立的新城疫病毒LaSota疫苗株反向遗传操作系统的基础上，构建了表达牛α、β、γ干扰素基因的全基因组克隆，实现了牛α、β、γ干扰素在SPF鸡胚内高效、稳定表达，并对其表达产物进行了抗病毒活性研究。

因此，本发明的一个目的是提供以下各项：

1.一种表达编码牛干扰素的基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗。

2.根据以上1的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，其中所述牛干扰素是牛α、β或γ-干扰素(优选所述牛α、β或γ-干扰素的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，更优选编码所述牛α、β或γ-干扰素的基因如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示)。

3.根据以上1的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，其为rLBoIFN-α，rLBoIFN-β或rLBoIFN-γ。

4.根据以上1-3中任何一项的重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备牛干扰素中的应用。

5.一种生产以上1-3中任何一项的重组新城疫LaSota弱毒疫苗的方法，该方法包括：

(1)构建转录质粒，该转录质粒包括其中插入编码牛干扰素的基因的所述新城疫LaSota弱毒疫苗的基因组cDNA序列；

(2)构建一个或多个转录辅助质粒，该辅助质粒包括编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；

(3)将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染所述新城疫LaSota弱毒疫苗复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；

(4)收获上清液，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获重组病毒株。

6.根据以上5的方法，其中所述转录质粒是pBRN-FL-BoIFNα、pBRN-FL-BoIFNβ或pBRN-FL-BoIFNγ(基因序列分别见SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9，质粒图谱分别见图5-7)。

7.根据以上5的方法，其中所述转录辅助质粒是质粒pBSNP、pBSP和pBSL。

8.根据以上5-7中任何一项的方法，其中所述宿主细胞是BHK-21。

9.根据以上5-7中任何一项的方法制备的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，优选为rLBoIFN-α，rLBoIFN-β或rLBoIFN-γ。

10.一种生产牛干扰素的方法，该方法包括：

1)将根据以上1-3中任何一项的重组新城疫LaSota弱毒疫苗接种敏感细胞或接种鸡胚尿囊腔；

2)收获细胞上清液或鸡胚尿囊液。该方法还可以任选地包括常规干扰素纯化步骤。

本发明利用新城疫病毒LaSota株作为表达载体，分别构建表达牛α、β、γ-干扰素(Bovine interferon-α，Bovine interferon-β，Bovine interferon-γ)完整开放阅读框的全基因组质粒pBRN-FL-BoIFNα、pBRN-FL-BoIFNβ、和pBRN-FL-BoIFNγ，转染BHK-21细胞获得表达BoIFN-α、β、γ的重组新城疫病毒。采用RT-PCR方法，证实收获的鸡胚尿囊液内的重组病毒含有相应外源基因。将重组病毒尿囊液经紫外线照射灭活新城疫病毒，利用重组病毒VSV-GFP在MDBK细胞系上测定rLBoIFN-α，rLBoIFN-β，rLBoIFN-γ抗病毒活性，表达BoIFN的重组新城疫病毒均能有效抑制水疱性口炎病毒(VSV)在牛肾细胞(MDBK)上的复制，rLBoIFN-α、rLBoIFN-β、rLBoIFN-γ接种SPF鸡胚所收尿囊液抗病毒活性分别为2×10⁶IU/mL、2×10⁶IU/mL、2×10⁶IU/mL。结果表明：BoIFN-α，BoIFN-β，BoIFN-γ在重组新城疫病毒rLBoIFN-α，rLBoIFN-β，rLBoIFN-γ接种的SPF鸡胚尿囊液中获得良好表达，并具有高效而稳定的抗病毒活性。

附图说明

图1.重组质粒pBRN-FL-BoIFNα、pBRN-FL-BoIFNβ、pBRN-FL-BoIFNγ的酶切鉴定及PCR鉴定(A：M.DNA分子量标准(DL2000)；1.经限制性内切酶Pme I消化的质粒载体pBRN-FL-BoIFNα；2.经限制性内切酶Pme I消化的质粒载体pBRN-FL-BoIFNβ；3.经限制性内切酶Pme I消化的质粒载体pBRN-FL-BoIFNγ.B：M.DNA分子量标准(DL2000)；1.以pBRN-FL-BoIFNα为模板的PCR产物；2.以pBRN-FL-BoIFNβ为模板的PCR产物；3.以pBRN-FL-BoIFNγ为模板的PCR产物)；

图2.重组病毒RT-PCR鉴定测序结果(A，rL-BoIFNα、B，rL-BoIFNβ、C，rL-BoIFNγ)

图3.利用VSV-GFP-MDBK系统测定rL-BoIFNα/β/γ抗病毒活性(A～D：rL-BoIFNα接种SPF鸡胚尿囊液进行梯度稀释；E～H：rL-BoIFNβ接种SPF鸡胚尿囊液进行梯度稀释；I～L：rL-BoIFNγ接种SPF鸡胚尿囊液进行梯度稀释(具体为2×10⁴，2×10⁵，2×10⁶，2×10⁷)；M～N：rLaSota接种SPF鸡胚尿囊液进行梯度稀释(具体为2×10¹，2×10²)；O：阴性对照)；

图4.pBRN-FL-PmeI的质粒图谱；

图5.pBRN-FL-BoIFNα的质粒图谱；

图6.pBRN-FL-BoIFNβ的质粒图谱；

图7.pBRN-FL-BoIFNγ的质粒图谱；

图8.质粒pBSNP的序列，带下划线的斜体部分是NP基因的编码序列；

图9.质粒pBSP的序列，带下划线的斜体部分是P基因的编码序列；

图10.质粒pBSL的序列，带下划线的斜体部分是L基因的编码序列。

具体实施方式

下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实施例1牛α、β、γ干扰素在新城疫病毒LaSota疫苗株中的高效稳定表达及抗病毒活性检测

材料和方法

1 材料

表达绿色荧光蛋白报告基因的重组水疱性口炎病毒VSV-GFP商购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，由本实验室构建、滴定并保存^[13]。BHK-21细胞(ATCCCCL-10)、传代牛肾细胞系(MDBK)(ATCC No.CCL-22)由本实验室传代培养，培养基为含10％胎牛血清的DMEM；表达T7聚合酶的痘病毒vTF7-3(ATCC，VR-2153)购于ATCC、新城疫LaSota克隆株rLaSota(按照ZL200510097997.8制备)由本实验室保存；干扰素克隆质粒pBS-BoIFNβ^[18]、pBS-BoIFNγ^[19]由本实验室构建并保存；rLaSota反向遗传操作系统基因组转录模板质粒pBRN-FL-PmeI(参见：葛金英，温志远，王永，等。表达绿色荧光蛋白重组新城疫病毒LaSota疫苗株的构建[J].微生物学报，2006，46(4):547～551)(病毒基因组转录质粒pBRN-FL-PmeI，含有新城疫病毒的基因组全长cDNA，pBRN-FL-PmeI的序列信息见SEQ ID No.10，质粒图谱见图4)。

如ZL200510097997.8或参考文献[14]所述，将表达新城疫病毒(基因组序列：GenBank登录号AY845400)的核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)及大聚合酶蛋白(L)基因的开放阅读框架(ORF)cDNA分别紧接着克隆在pBlueScript载体(Clontech)质粒T7启动子下游，分别构建转录辅助质粒pBSNP，pBSP和pBSL(序列分别如图8至10所示)。

2 表达牛α、β、γ干扰素基因的全基因组克隆的构建

从GenBank获取BoIFN-α的ORF序列(Genbank Accession No.M29314)，设计引物。上游引物为BoIFNαPF：5’-ca aggtccccaatggccccagc-3’，下游引物为BoIFNαPR：5’-gtcagtcctttctcctgaaac-3’。采集新鲜牛血，分离淋巴细胞，用TRIOL试剂盒提取总RNA，采用随机引物进行cDNA合成，以上述引物进行PCR。扩增的BoIFN-α PCR产物平端克隆到pBlueScript II(S/K+)载体获得质粒pBS-BoIFNα，测序鉴定。

以质粒pBS-BoIFNα、pBS-BoIFNβ^[18]、pBS-BoIFNγ^[19]为模板，通过PCR引物(表1)在干扰素基因ORF的5′端引入PmeI限制酶识别序列和NDV自身聚合酶L识别的转录终止序列GE(TTAAGAAAAAA)、转录起始序列GS(ACGGGTAGAA)及增强基因表达的Kozak序列(GCCACC)，在干扰素基因ORF的3′端引入PmeI限制酶识别序列(所用引物见表1)；为了确保重组基因组cDNA全长总碱基数仍保持6的倍数，在引物GS和Kozak序列之间加入适当数量碱基进行调整。PCR末端经PmeI酶切插入同样经PmeI处理的pBRN-FL-PmeI载体内，表达牛α、β、γ干扰素的重组基因组全长cDNA克隆命名为pBRN-FL-BoIFNα、pBRN-FL-BoIFNβ、pBRN-FL-BoIFNγ。利用引物NDV-3#PF:5′-gtccgtgcattgatcatg-3′和各基因PCR所用下游引物鉴定方向。

3 重组病毒的拯救

BHK-21细胞(ATCC CCL-10)接种于六孔板内生长达50～80％单层时，转录质粒pBRN-FL-BoIFNα(图5)、pBRN-FL-BoIFNβ(图6)、pBRN-FL-BoIFNγ(图7)分别与辅助质粒pBSNP、pBSP和pBSL共转染预先感染vTF7-3的BHK-21细胞。转染上清经0.22um孔径滤器过滤后接种9～11天的SPF鸡胚尿囊腔；接种后的SPF胚继续培养3-5天，收获鸡胚尿囊液，分别为重组新城疫LaSota弱毒疫苗rLBoIFN-α，rLBoIFN-β和rLBoIFN-γ。取鸡胚尿囊液50μl按常规进行新城疫病毒的血凝(HA)和血凝抑止(HI)试验，详细操作方法参见文献^[14]。收获HA及HI试验结果阳性尿囊液，-70℃冻存，并按常规方法分别于9-10日龄鸡胚尿囊腔接种进行传代、EID₅₀滴定^[14]。

4 rL-BoIFNα、rL-BoIFNβ和rL-BoIFNγ抗病毒活性检测

分别取rL-BoIFNα、rL-BoIFNβ、rL-BoIFNγ以及rLaSota接种的SPF鸡胚尿囊液2ml放入平皿中，置于紫外灯下照射2h，每间隔20min摇动一次，以灭活NDV病毒。经紫外线灭活的尿囊液接种SPF鸡胚以检测病毒灭活是否彻底，每胚100μL，共接3枚，接种后的鸡胚置37℃孵化器内孵化，3天后检测鸡胚尿囊液是否HA阳性。HA阴性样品分装，—70℃保存备用。

用VSV-GFP-MDBK细胞系统测定rL-BoIFNα、rL-BoIFNβ、rL-BoIFNγ的抗病毒活性，具体为：取灭活后重组病毒rL-BoIFNα、rL-BoIFNβ、rL-BoIFNγ鸡胚尿囊液，每个样品100μL，用含5％胎牛血清的DMEM进行10倍系列稀释，在生长于96孔细胞培养板上的MDBK细胞上加入2×10¹～2×10⁸稀释的尿囊液，同时取相同稀释倍数的灭活rLaSota鸡胚尿囊液作为对照组，于37℃作用24h。吸出上清后，接种VSV-GFP，剂量为200PFU/孔感染细胞，感作1h后换完全培养液继续培养，同时设空白对照组，24h后荧光显微镜观察结果。以空白对照组为对照，将减少50％VSV-GFP感染率的样品的最高稀释度定为1个病毒抑制单位(IU)。

5 重组病毒尿囊液抗病毒稳定性检测

取灭活后重组病毒rL-BoIFNα、rL-BoIFNβ、rL-BoIFNγ鸡胚尿囊液分装，100μL/管，一部分放4℃冰箱长期保存，每间隔1周取出一份进行抗病毒活性检测；另一部分放—70℃冰箱，取冻融1次、2次、3次的样品检测抗病毒活性单位的变化，以检测反复冻融对抗病毒活性的影响。

结果

1 表达牛α、β、γ干扰素基因的全基因组克隆的构建及鉴定

通过PCR引物在干扰素基因BoIFNα、BoIFNβ、BoIFNγ的ORF的5′端和3′端引入PmeI限制酶识别序列(所用引物见表1)；由于插入的外源基因为PmeI单切连入pBRN-FL-PmeI载体，因此克隆质粒经PmeI酶切的产物应有两条，一条为载体，约为18kb，另一条为外源基因及其所携带的GE/GS等长约500～600bp；而经鉴定引物进行PCR扩增，应得到比相应外源基因大200bp左右的条带，产物约700～800bp，电泳结果显示与预期相符(图1A)。证明表达牛α、β、γ干扰素的重组基因组全长cDNA克隆克隆构建成功(图1B)。

表1 构建表达牛α、β、γ干扰素基因的全基因组克隆所用引物

引物名称           序列

pBoIFNαPF          5-gact

ttagaaaaaatacgggtagaagtgccGCCACCatggcccc

                   agcctggtccttc-3

pBoIFNαPR          5-gact

tcagtcctttctcctgaaactc-3

pBoIFNβPF          5-gact

ttagaaaaaatacgggtagaagtGCCACCatgacctaccg

                   gtgcctcctc-3

pBoIFNβPR          5-gcgc

tcagtcacggagggaagctgttag-3

pBoIFNγPF          5-gact

ttagaaaaaatacgggtagaagtGCCACCatgaaatataca

                   agctatttcttag-3

pBoIFNγPR          5-ccac

ttacgttgatgctctccggcctc-3

注：下划线部分为病毒特异序列，酶切位点用边框表示，Kozak序列用斜体表示，基因起始信号和基因结束信号用小写字符表示，用黑体字符调整碱基数以适应6的倍数规则。

2 重组病毒的拯救及鉴定

全基因组转录质粒pBRN-FL-BoIFNα、pBRN-FL-BoIFNβ、pBRN-FL-BoIFNγ各自分别与辅助质粒pBSNP、pBSP和pBSL一起共转染BHK-21细胞。转染上清接种后SPF胚继续培养3-5天，取鸡胚尿囊液50μL按常规进行新城疫病毒的血凝(HA)和血凝抑止(HI)试验。收获HA及HI试验结果阳性尿囊液，-70℃冻存。同时进行RT-PCR鉴定，PCR产物测序结果(图2)证明重组病毒基因组内含有相应的外源基因片段，至此成功拯救出表达牛干扰素α、β、γ的重组新城疫病毒，并分别命名为rL-BoIFNα、rL-BoIFNβ和rL-BoIFNγ。

3 rL-BoIFNα、rL-BoIFNβ和rL-BoIFNγ抗病毒活性检测

收获的重组病毒尿囊液经紫外线灭活，进行10倍系列稀释，稀释后的样品处理细胞24h，然后按每孔200PFU的接种量感染VSV-GFP，24h后经荧光显微镜观察结果。2×10⁴倍稀释rL-BoIFNα、rL-BoIFNβ和rL-BoIFNγ可以完全抑制VSV-GFP的复制，无荧光出现(图3A，E，I)，2×10⁵和2×10⁶倍稀释rL-BoIFNα、rL-BoIFNβ和rL-BoIFNγ可部分抑制VSV-GFP的复制，2×10⁶倍稀释孔的荧光亮度约为对照组的一半(图3C，G，K)，2×10⁷倍稀释孔与对照组无差别(图3D，H，L)。未加干扰素样品的对照孔出现大量荧光(图3O)，VSV-GFP在MDBK细胞中大量复制。10倍稀释rLaSota病毒接种SPF鸡胚尿囊液可以非特异性的部分抑制VSV-GFP在MDBK细胞中的复制(图3M)，2×10²稀释的rLaSota病毒接种SPF鸡胚尿囊液组出现大量荧光(图3N)，不能抑制VSV-GFP的复制。测得rL-BoIFNα、rL-BoIFNβ和rL-BoIFNγ抗病毒活性为2×10⁷IU/mL。

4 重组病毒尿囊液抗病毒稳定性检测

4℃冰箱保存重组病毒rL-BoIFNα、rL-BoIFNβ、rL-BoIFNγ鸡胚尿囊液3周时检测抗病毒活性仍然没有明显下降，即4℃冰箱保存干扰素样品可以保持至少3周的抗病毒活性；反复冻溶样品在冻融1次、2次、3次后样品的抗病毒活性单位没有明显下降，说明反复冻融对干扰素样品抗病毒活性影响不大，经鸡胚尿囊液生产的干扰素可以长时间保持稳定、高效的抗病毒活性。

干扰素(IFN)是机体在接触病毒或其他诱生物后分泌的一类蛋白，具有广谱抗病毒、抑制细胞增殖和免疫调节等多种生物学活性^[1]。Camilo等^[15]在牛疱疹病毒中表达了BoIFN-γ并进行了体内抗病毒保护实验，取得了良好效果。国内外研究表明，BoIFN在抗水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛白血病病毒以及副流感-3型的试验中均取得了良好效果^{[2～4，7，8，10，12]}。重组BoIFN-γ作为免疫佐剂，曾用于奶牛乳房炎、细菌性疾病的治疗^[16，17]。干扰素在抗病毒以及免疫调节方面的杰出表现使之成为研究焦点。随着重组DNA技术的发展，人们尝试利用多种表达系统探索干扰素大规模生产的捷径。最初研究人员利用大肠杆菌表达干扰素，纯化的蛋白具有广谱抗病毒生物学活性，但纯化困难，且容易复性不完全^[8～11]；之后出现杆状病毒表达系统^[18～20]、酵母表达系统^[17]、疱疹病毒表达系统^[15]等真核表达系统，表达的干扰素近乎天然，但成本高，而且同样涉及纯化问题。

重组新城疫病毒表达系统表达的牛干扰素蛋白糖基化等蛋白翻译后加工和折叠与哺乳动物相似，表达完整的干扰素蛋白更有利于保持蛋白天然构型与生物学活性，因此新城疫病毒具有绝对的优势成为分泌型外源蛋白表达载体系统。亲本株NDVrLaSota具有良好的鸡胚生长特性，低毒力，高生长滴度，表达的干扰素无需纯化，便于大量生产。NDV rLaSota株作为疫苗载体和外源蛋白功能研究载体具有广阔的应用前景。

本文构建了表达牛α、β、γ干扰素的重组新城疫病毒rL-BoIFNα、rL-BoIFNβ和rL-BoIFNγ，IFA实验证实干扰素蛋白与DNA免疫SPF鸡单因子血清具有敏感、特异的免疫反应，说明干扰素蛋白在rL-BoIFNα、rL-BoIFNβ和rL-BoIFNγ内获得了正确表达。收获的SPF鸡胚尿囊液经紫外线灭活NDV病毒后，具有10⁶IU/mL的高滴度抗病毒活性，与杆状病毒表达系统、酵母表达系统具有相近，甚至更高的抗病毒滴度，但成本相对更低，具有产业化应用潜力。本研究克隆的牛IFN-α、-β、-γ基因，为进一步利用基因工程技术生产重组牛IFN及其生物学功能的研究奠定了基础，期望通过进一步开展深入研究，使重组IFN成为具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的主要药物。

此外，表达牛α、β、γ干扰素的重组新城疫病毒接种的鸡胚尿囊液可以长时间稳定保存，反复冻融对其抗病毒活性影响很小，便于保存和长途运输，有利于进一步的现地推广应用。而且可以进一步探索干扰素样品冻干保护工艺，实现常温运输和保存，为将来的推广应用奠定基础。

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[17]Fernando Diaz，Felipe M，Araceli P，Verala E，Suarez-Guemes F and Montano L F.Secretion of IFN-γ by bovine peripheral blood mononuclear cells stimulated withmycobacterium bovis protein fractions obtained by isoelectric-focusing[J].VeterinaryImmunology and Immunopathology，1999，67:203～212

[18]陈伟业，肇慧君，王喜军，等.重组杆状病毒表达牛β干扰素及其生物学活性研究[J].微生物学报，2007，47(6)：992～996

[19]秦立廷，王喜军，胡森，李志中，陈伟业，等.牛γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达及其抗病毒活性的测定[J].微生物学报，2007，47(3):503～507

[20]秦立廷，王喜军，胡森，李志中，陈伟业，等.猪γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达及其抗病毒活性的测定[J].生物工程学报，2007，23(3):386～391

序列表

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120>表达牛干扰素(α、β或γ-干扰素)的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株

<130>IB085347

<160>10

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>189

<212>PRT

<213>牛

<400>1

<210>2

<211>186

<212>PRT

<213>牛

<400>2

<210>3

<211>166

<212>PRT

<213>牛

<400>3

<210>4

<211>570

<212>DNA

<213>牛

<400>4

<210>5

<211>561

<212>DNA

<213>牛

<400>5

<210>6

<211>501

<212>DNA

<213>牛

<400>6

<210>7

<211>20630

<212>DNA

<213>人工

<400>7

<210>8

<211>20618

<212>DNA

<213>人工

<400>8

<210>9

<211>20558

<212>DNA

<213>人工

<400>9

<210>10

<211>20019

<212>DNA

<213>人工

<400>10

Claims (10)

1.一种表达编码牛干扰素的基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗。

2.根据权利要求1的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，其中所述牛干扰素是牛α、β或γ-干扰素，优选所述牛α、β或γ-干扰素的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3所示，更优选编码所述牛α、β或γ-干扰素的基因如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

3.根据权利要求1的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，其为rLBoIFN-α，rLBoIFN-β或rLBoIFN-γ。

4.根据权利要求1-3中任何一项的重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备牛干扰素中的应用。

5.一种生产权利要求1-3中任何一项的重组新城疫LaSota弱毒疫苗的方法，该方法包括：

(1)构建转录质粒，该转录质粒包括其中插入编码牛干扰素的基因的所述新城疫LaSota弱毒疫苗的基因组cDNA序列；

(2)构建一个或多个转录辅助质粒，该辅助质粒包括编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；

(3)将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染所述新城疫LaSota弱毒疫苗复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；

(4)收获上清液，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获重组病毒株。

6.根据权利要求5的方法，其中所述转录质粒是pBRN-FL-BoIFNα、pBRN-FL-BoIFNβ或pBRN-FL-BoIFNγ。

7.根据权利要求5的方法，其中所述转录辅助质粒是质粒pBSNP、pBSP和pBSL。

8.根据权利要求5-7中任何一项的方法，其中所述宿主细胞是BHK-21。

9.根据权利要求5-7中任何一项的方法制备的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，优选为rLBoIFN-α，rLBoIFN-β或rLBoIFN-γ。

10.一种生产牛干扰素的方法，该方法包括：

1)将根据权利要求1-3中任何一项的重组新城疫LaSota弱毒疫苗接种敏感细胞或接种鸡胚尿囊腔；

2)收获细胞上清液或鸡胚尿囊液。

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