CN104531691A - 一种获取牛干扰素α的基因的引物、重组牛干扰素α的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种获取牛干扰素α的基因的引物、重组牛干扰素α的制备方法，包括以下步骤：a.牛干扰素α基因的获取；b.构建克隆载体；c.构建表达载体；d.重组蛋白的表达；e、重组牛干扰素α粗制品的制备；f、重组牛干扰素α粗制品纯化。本发明与现有技术相比，所制的重组牛干扰素α是一类能诱导牛细胞产生多种广谱抗病毒蛋白的细胞因子，能够治疗牛水疱性口炎病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞病毒等引起的疾病。

Description

一种获取牛干扰素α的基因的引物、重组牛干扰素α的制备方法

技术领域

本发明属于基因重组技术领域,具体涉及一种获取牛干扰素α的基因的引物、重组牛干扰素α的制备方法。

背景技术

随着近年来全球畜禽养殖业的迅猛发展，我国养牛业已由农村家庭副业发展成了社会一大产业，无论是兽类的品种还是数量都位于世界前列。然而，养兽业还存在很多问题，如水疱性口炎病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞病毒等传染性疾病，每年都会在不同的季节暴发，这些动物一旦感染发病，则初发病急、临床症状严重、极易传播扩散以及病死率和死亡率均较高的特点，给养殖业造成巨大经济损失。

目前兽类传染性疾病的防治主要采用疫苗免疫和药物治疗，由于疫苗免疫的血清型单一，而病毒的血清型复杂，毒株变异快，常导致疫苗免疫失败。一些病毒病目前尚无疫苗可用，有些病毒也可能直接危害到人类的健康。

常用的药物治疗主要采用抗生素进行治疗，但是近年来由于抗生素的广泛和大量使用，导致耐药性菌株大量产生，并通过食物链传染给人，给人类健康带来更大的威胁。现在一些国家己明令禁止一些抗生素和抗菌剂在养殖业中的应用。因此，使用干扰素来积极治疗和预防家禽、家畜的病毒性疾病将是人类最为关注的问题。

干扰素(Interferon，IFN)是一类由病毒及脂多糖等物质诱导机体产生的具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的蛋白质，1957年由Issacs和Lindeman首先发现。它是一类多功能的细胞因子，与细胞受体结合后，可诱导机体产生多种特异性蛋白质和酶类，主要通过抑制病毒基因转录和降解病毒RNA来抑制病毒的生长繁殖及发挥抗肿瘤等的活性。按照IFN的产生细胞、生化特征及在机体免疫方面所发挥的作用不同，分为α、β、γ三种型。现已知，干扰素α在体内可有选择性地作用于病毒感染细胞，通过抑制受染细胞内的病毒蛋白质的生物合成，发挥广谱和高效抗病毒作用，但对正常宿主细胞无作用。

目前重组牛干扰素α鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种获取牛干扰素α的基因的引物和一种重组牛干扰素α的制备方法，制备的重组牛干扰素α可用于治疗牛水疱性口炎病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞病毒等引起的疾病。

一种获取牛干扰素α的基因的引物，所述引物的序列为：

上游：ATA GGA TCC TGC CAC CTGGCCT CAC

下游：ATA AAG CTT TCA GTC CTT TCT CCT G；

引物分别带有BamHI和HindIII酶切位点。

本发明提供的一种重组牛干扰素α的制备方法，包括以下步骤：

a、牛干扰素α基因的获取；

b、构建克隆载体；

c、构建表达载体；

d、重组蛋白的表达；

e、重组牛干扰素α粗制品的制备；

f、重组牛干扰素α粗制品纯化。

步骤a、牛干扰素α基因的获取，包括以下步骤：

采用TAKARA公司RNA提取试剂盒从牛肝脏组织中提取RNA，并利用引物进行RT-PCR反应；

引物序列：上游：ATA GGA TCC TGC CAC CTGGCCT CAC

下游：ATA AAG CTT TCA GTC CTT TCT CCT G

引物分别带有BamHI和HindIII酶切位点；

牛干扰素α目的基因如SEQ ID NO 1所示；

提取RNA反应条件：在25μL的总反应体系中，基因组DNA 1.5μl，上下游引物各0.5μl，PCR Mix为12.5μl，加无菌水至25μl；

RT-PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30S，55℃退火40S，72℃延伸40s，循环35次，最后72℃延伸20min，RT-PCR扩增产物通过胶回收试剂盒回收。

步骤b、构建克隆载体，包括以下步骤：

PCR扩增牛干扰素α目的基因后，将目的基因克隆于pMD18-Tsimple vector至并转化JM109大肠杆菌涂LB培养基平板进行蓝白斑筛选，取白色样的克隆菌进行目的基因PCR验证，并进行双酶切鉴定。

步骤c.构建表达载体，包括以下步骤：

选择目的基因经测序后与Genebank一致的克隆载体进行双酶切后与分别与表达载体pET-32a进行连接，并转化至BL21大肠杆菌，分别涂布于含氨苄青霉素的LB培养基平板培养过夜，取LB平板上生长的菌落经PCR鉴定目的基因，阳性克隆菌质粒行BamHI和HindIII双酶切鉴定，鉴定为阳性者表示表达载体构建成功。

步骤d、重组蛋白的表达，包括以下步骤：

分别挑取与pET-32a表达载体连接的重组牛干扰素α工程菌于含氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基中少量扩增，后在LB培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)中放大培养2～3h后，测OD值在0.6～0.8时，加入IPTG，32℃诱导表达(终浓度100μg/ml)5h，收集细菌。

步骤e、重组牛干扰素α粗制品的制备，包括以下步骤：

收集细菌，－20℃与室温反复冻融沉淀3次，4℃超声裂解细菌沉淀，功率:400W，工作3S，间隔3S，超声6min，重复3～4次，离心12000r/min离心15min获得上清、沉淀，得到粗制蛋白。

步骤f、重组牛干扰素α粗制品纯化，包括以下步骤：

f.1AKTA^TM explorer蛋白纯化仪亲和层析精纯蛋白：

f.1.1亲和层析：

将粗制蛋白过滤处理后过GST亲和层析柱，用Elution buffer(50mMTris-Cl 40mM还原性谷胱甘肽pH 8.0)梯度洗脱，收集牛干扰素α峰；

f.1.2脱盐、缓冲液置换：

将第一步纯化的牛干扰素α过脱盐柱，用缓冲液(50mMTris-ClpH6.5)置换，准备下一步离子交换层析；

f.1.3离子交换层析：

分别用Loading buffer(50mMTris-Cl pH6.5)平衡好柱体，上样后用Elution buffer(50mMTris-Cl 1M NaCl pH6.5)梯度洗脱，收集牛干扰素α峰；

f.1.4分子筛层析：

离子交换层析收集到的牛干扰素α过分子筛层析柱，Elutionbuffer(50mMNa₂HPO₄0.15MNaCl pH7.0)收集牛干扰素α峰；

测定牛干扰素α效价及比活性，比活性≥1.0×10⁶IU/mg蛋白为合格；无菌分装，-70℃保存。

本发明通过设计特异性引物，从牛肝脏组织中提取RNA进行RT-PCR反应，并将扩增出的牛干扰素α基因克隆于T载体后再连接至原核表达载体pET-32a中，以大肠埃希菌BL21(DE3)作为原核表达的宿主菌，构建成BL21/pET-32a-BovIFNα工程菌，并在通过PCR、双酶切鉴定后用IPTG诱导其表达牛干扰素α，经纯化后除菌、分装和冻干，制成冻干粉针剂。

本发明制备的重组牛干扰素α的冻干粉针剂，加2ml无菌双蒸水后，能迅速溶解为均匀悬浊液，规格为：牛干扰素α含量≥2万IU/瓶，2～8℃可长期保存，室温(≤25℃)可保存两年。使用时轻轻摇匀后即可进行接种，小牛5000IU/头/天，成年牛20000IU/头/天，每日一次，一个疗程3～5次。在治疗已发病牛的同时，应及时隔离未发病牛，并给予等量相应药物预防。

本发明与现有技术相比，所制的重组牛干扰素α是一类能诱导牛细胞产生多种广谱抗病毒蛋白的细胞因子，能够治疗牛水疱性口炎病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞病毒等引起的疾病。

附图说明

图1为牛干扰素α基因RT-PCR扩增的结果；

在图1中，M：DNA Marker DL2000，1～6：牛干扰素α基因RT-PCR扩增产物在498bp左右出现单一条带,7：PCR阴性对照；

图2为重组质粒pMD18-T/BovIFN-αPCR鉴定结果；

在图2中,M：DNA Marker DL2000，1：以重组质粒pMD18-T/ChIFNα为模板PCR产物在498bp处出现单一条带；

图3为重组质粒pET32/BovIFN-α双酶切鉴定结果；

在图3中，M：DNA Marker DL2000，1～2：重组质粒pET-32a-BovIFNαBamHI和HindⅢ酶切鉴定结果；

图4为重组质粒pET32/BovIFN-α的PCR结果；

在图4中，M：DNA Marker DL2000，1～5：以重组质粒pET-32a-BovIFNα模板PCR扩增产物，6：PCR阴性对照；

图5为0.5mmol/L IPTG 32℃诱导的重组牛干扰素α蛋白SDS-PAGE电泳检测结果；

在图5中，M为：蛋白Marker，1：IPTG 32℃诱导后空菌菌体，2～4：不同重组牛干扰素α工程菌诱导5h后的结果，其中3泳道的工程菌目的蛋白表达量最高；

图6重组牛干扰素α蛋白可溶性表达鉴定结果；

M为：蛋白Marker，1：重组牛干扰素α工程菌诱导5h后的菌体破碎后上清，2：重组牛干扰素α工程菌诱导5h后的菌体破碎后沉淀，3：重组牛干扰素α工程菌诱导5h后的菌体。可见重组菌诱导5h后的菌体破碎后上清在35KD处优势表达条带。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详细的说明。

实施例1：

一种重组牛干扰素α的制备方法，包括以下步骤：

a.牛干扰素α基因的获取，包括以下步骤：

采用TAKARA公司RNA提取试剂盒从牛肝脏组织中提取RNA，并利用引物进行RT-PCR反应；

引物序列：上游：ATA GGA TCC TGC CAC CTGGCCT CAC

下游：ATA AAG CTT TCA GTC CTT TCT CCT G

引物分别带有BamHI和HindIII酶切位点；

牛干扰素α目的基因为：

tgccacctgc ctcacaccca cagcctggcc aacaggaggg tcctgatgct cctgcaacaa 60

ctgagaaggg tctccccttc ctcctgcctg caggacagaa atgacttcga attcctccag 120

gaggctctgg gtggcagcca gttgcagaag gctcaagcca tctctgtgct ccacgaggtg 180

acccagcaca ccttccagct cttcagcaca gagggctcgc ccgccacgtg ggacaagagc240

ctcctggaca agctacgcgc tgcgctggat cagcagctca ctgacctgca agcctgtctg 300

acgcaggagg aggggctgcg aggggctccc ctgctcaagg aggactccag cctggctgtg 360

aggaaatact tccacagact cactctctat ctgcaagaga agagacacag cccttgtgcc 420

tgggaggttg tcagagcaga agtcatgaga gccttctctt cctcaacaaa cttgcaggag480

agtttcagga gaaaggac498

提取RNA反应条件：在25μL的总反应体系中，基因组DNA 1.5μl，上下游引物各0.5μl，PCR Mix为12.5μl，加无菌水至25μl；

RT-PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30S，55℃退火40S，72℃延伸40s，循环35次，最后72℃延伸20min，RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在498bp左右出现特异条带，其结果如图1所示。

b.构建克隆载体，包括以下步骤：

PCR扩增牛干扰素α目的基因后，产物通过胶回收试剂盒回收，将目的基因克隆于pMD18-T simple vector至并转化JM109大肠杆菌涂LB培养基平板进行蓝白斑筛选，取白色样的克隆菌进行目的基因PCR验证，产物经琼脂糖凝胶电泳在498bp处出现单一条带，其结果如图2所示。

c.构建表达载体，包括以下步骤：：

选择目的基因经测序后与Genebank一致的克隆载体进行双酶切后与分别与表达载体pET-32a进行连接，并转化至BL21大肠杆菌，分别涂布于含氨苄青霉素的LB培养基平板培养过夜，取LB平板上生长的菌落经PCR鉴定目的基因，阳性克隆菌质粒行BamHI和HindIII双酶切鉴定，鉴定为阳性者表示表达载体构建成功，PCR扩增和双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳在498bp处出现单一条带，其结果如图3、图4所示。

d.重组蛋白的表达，包括以下步骤：：

分别挑取与pET-32a表达载体连接的重组牛干扰素α工程菌于含氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基中少量扩增，后在LB培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)中放大培养2～3h后，测OD值在0.6～0.8时，加入IPTG，32℃诱导表达(终浓度100μg/ml)5h，收集细菌，经SDS-PAGE电泳检测，重组菌诱导5h后的菌体在35KD处可见优势表达条带，其结果如图5所示。

e、重组牛干扰素α粗制品的制备，包括以下步骤：

收集细菌，－20℃与室温反复冻融沉淀3次，4℃超声裂解细菌沉淀，功率:400W，工作3S，间隔3S，超声6min，重复3～4次，离心12000r/min离心15min获得上清、沉淀，得到粗制蛋白；分别取沉淀和上清及菌体经SDS-PAGE电泳检测，如图6所示。

f、重组牛干扰素α粗制品纯化，包括以下步骤：

f.1AKTA^TM explorer蛋白纯化仪亲和层析精纯蛋白：

f.1.1亲和层析：

将粗制蛋白过滤处理后过GST亲和层析柱，用Elution buffer(50mMTris-Cl 40mM还原性谷胱甘肽pH 8.0)梯度洗脱，收集牛干扰素α峰；

f.1.2脱盐、缓冲液置换：

将第一步纯化的牛干扰素α过脱盐柱，用缓冲液(50mMTris-ClpH6.5)置换，准备下一步离子交换层析；

f.1.3离子交换层析：

分别用Loading buffer(50mMTris-Cl pH6.5)平衡好柱体，上样后用Elution buffer(50mMTris-Cl 1M NaCl pH6.5)梯度洗脱，收集牛干扰素α峰；

f.1.4分子筛层析：

离子交换层析收集到的牛干扰素α过分子筛层析柱，Elutionbuffer(50mMNa₂HPO₄0.15MNaCl pH7.0)收集牛干扰素α峰；

测定牛干扰素α效价及比活性，比活性≥1.0×10⁶IU/mg蛋白为合格；无菌分装，-70℃保存。

实施例2

重组牛干扰素α的鉴定：

蛋白定量检测：

用Lowry法，以中国食品药品生物制品检定院的标准蛋白作标准测定，测定蛋白含量≥1.0mg/ml。

SDS-PAGE电泳检测：

与空菌对照相比，重组菌在35KD左右有一条浓染的新增目的蛋白条带。

Western Blot结果:

以Abcam公司鼠抗牛干扰素(1:2000稀释)为多抗，以山羊抗小鼠IgG-HRP为二抗(1:5000稀释)。重组牛干扰素α样品能与抗牛干扰素多克隆抗体发生特异性反应，35KD左右处出现特异性条带示。

实施例3：

重组牛干扰素α效价检测：按照微量细胞病变抑制法，采用Hep-2细胞/VSV病毒系统：在96孔微量细胞培养板上用DMEM营养液培养Hep-2细胞，置5％CO₂培养箱37℃条件下培养24小时，加入不同剂量的重组牛干扰素α，24小时后吸弃，再分别接种100TCID₅₀VSV病毒。结果表明获得的重组牛干扰素α对VSV引起的细胞病变具有明显的抑制作用。未经处理的细胞接种病毒后均出现细胞变圆、脱落、崩解等病变。而获得的重组牛干扰素α处理后的细胞接种病毒后，在倒置显微镜下连续观察，细胞形态正常，未出现任何病变，测得效价＞1.0×10⁶IU/ml。

Claims (10)

1.一种获取牛干扰素α的基因的引物，其特征在于，所述引物的序列为：

上游：ATA GGA TCC TGC CAC CTGGCCT CAC

下游：ATA AAG CTT TCA GTC CTT TCT CCT G。

2.一种权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物分别带有BamHI和HindIII酶切位点。

3.一种利用权利要求1所述引物的重组牛干扰素α的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

a、牛干扰素α基因的获取；

b、构建克隆载体；

c、构建表达载体；

d、重组蛋白的表达；

e、重组牛干扰素α粗制品的制备；

f、重组牛干扰素α粗制品纯化。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤a、牛干扰素α基因的获取方法为：采用TAKARA公司RNA提取试剂盒从牛肝脏组织中提取RNA，并利用引物进行RT-PCR反应；

提取RNA反应条件：在25μL的总反应体系中，基因组DNA 1.5μl，上下游引物各0.5μl，PCR Mix为12.5μl，加无菌水至25μl；

RT-PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30S，55℃退火40S，72℃延伸40s，循环35次，最后72℃延伸20min，RT-PCR扩增产物通过胶回收试剂盒回收。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，提取的牛干扰素α目的基因如SEQ ID NO 1所示。

6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，步骤b、构建克隆载体，包括以下步骤：

PCR扩增牛干扰素α目的基因后，将目的基因克隆于pMD18-Tsimple vector至并转化JM109大肠杆菌涂LB培养基平板进行蓝白斑筛选，取白色样的克隆菌进行目的基因PCR验证，并进行双酶切鉴定。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤c.构建表达载体，包括以下步骤：

选择目的基因经测序后与Genebank一致的克隆载体进行双酶切后与分别与表达载体pET-32a进行连接，并转化至BL21大肠杆菌，分别涂布于含氨苄青霉素的LB培养基平板培养过夜，取LB平板上生长的菌落经PCR鉴定目的基因，阳性克隆菌质粒行BamHI和HindIII双酶切鉴定，鉴定为阳性者表示表达载体构建成功。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤d、重组蛋白的表达，包括以下步骤：

分别挑取与pET-32a表达载体连接的重组牛干扰素α工程菌于含氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基中少量扩增，后在含氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基中放大培养2～3h后，测OD值在0.6～0.8时，加入IPTG，32℃诱导表达5h，终浓度100μg/ml，收集细菌。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤e、重组牛干扰素α粗制品的制备，包括以下步骤：

收集细菌，－20℃与室温反复冻融沉淀3次，4℃超声裂解细菌沉淀，功率:400W，工作3S，间隔3S，超声6min，重复3～4次，离心12000r/min离心15min获得上清、沉淀，得到粗制蛋白。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤f、重组牛干扰素α粗制品纯化，包括以下步骤：

f.1AKTA^TM explorer蛋白纯化仪亲和层析精纯蛋白：

f.1.1亲和层析：

将粗制蛋白过滤处理后过GST亲和层析柱，用Elution buffer梯度洗脱，收集牛干扰素α峰；

所述Elution buffer含有50mMTris-Cl，40mM还原性谷胱甘肽，pH为8.0；

f.1.2脱盐、缓冲液置换：

将第一步纯化的牛干扰素α过脱盐柱，用缓冲液置换，准备下一步离子交换层析；

所述缓冲液含有50mMTris-Cl，pH为6.5；

f.1.3离子交换层析：

分别用Loading buffer平衡好柱体，上样后用Elution buffer梯度洗脱，收集牛干扰素α峰；所述Loading buffer含有50mMTris-Cl，pH为6.5；所述Elution buffer含有50mMTris-Cl，1M NaCl，pH为6.5；

f.1.4分子筛层析：

离子交换层析收集到的牛干扰素α过分子筛层析柱，Elutionbuffer收集牛干扰素α峰；所述Elution buffer含有50mMNa₂HPO₄，0.15MNaCl，pH为7.0；

测定牛干扰素α效价及比活性，比活性≥1.0×10⁶IU/mg蛋白为合格；无菌分装，-70℃保存。