CN107253995A

CN107253995A - 一种由牛白蛋白、牛干扰素γ和牛干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法

Info

Publication number: CN107253995A
Application number: CN201710675794.5A
Authority: CN
Inventors: 王明丽; 汪良青; 王利利; 夏兵兵; 梅志强; 何志远; 鲍可兵; 刘家炉
Original assignee: Wuhu Phil Biological Products Industry Research Institute Co Ltd
Current assignee: Wuhu Phil Biological Products Industry Research Institute Co Ltd
Priority date: 2017-08-09
Filing date: 2017-08-09
Publication date: 2017-10-17
Also published as: CN108794645A

Abstract

本发明公开了一种由牛白蛋白、牛干扰素γ和牛干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法，所述融合蛋白由牛白蛋白、牛干扰素γ和牛干扰素α经柔性linker连接而形成，融合蛋白与冻干保护剂混配后经冷冻干燥即可得到重组牛长效干扰素。所述重组牛长效干扰素可显著提高牛干扰素的半衰期，较普通牛干扰素的半衰期提高18倍以上，并具有广谱抗病毒作用并能提高牛自身的免疫应答。

Description

一种由牛白蛋白、牛干扰素γ和牛干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及由牛白蛋白、牛干扰素γ和牛干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法。

背景技术

牛是我国重要的畜牧种类之一，随着集约化和规模化养殖的不断发展，牛病毒性传染性疾病的发病率逐年提高。许多牛的传染性疾病在国内大型规模化牧场长期流行，因疾病传染快，发病率、死亡率高严重制约着我国牛养殖业的健康发展；更为严重的是一些人畜共患传染病如牛的布鲁氏菌病、结核病等直接威胁人类的生命健康。

目前对牛传染性疾病的预防和治疗途径主要是通过疫苗接种和使用抗生素。大部分抗生素类药物以及传统的口服抗病毒药物，由于药物残留问题，给健康带来负面影响；而传统的疫苗，由于它的高特异性以及副作用，无法抵抗病毒变异和新型病毒不断出现给猪养殖业带来的巨大危害。干扰素以其广谱的抗病毒活性和广泛的免疫调节能力决定了其具有巨大的临床应用潜力，可以用来预防和治疗牛病毒性细菌性传染性疾病。

IFN是一类病毒感染诱导机体产生具有广谱抗病毒、抗肿瘤和具有免疫调节作用的蛋白质，1957年Issacs和Lindeman首先发现，它是一类多功能的细胞因子，与细胞受体结合后，可诱导机体产生多种特异性蛋白质和酶类，主要通过抑制病毒基因转录和降解病毒RNA来抑制病毒的生长繁殖以及发挥抗肿瘤等的活性。现已知，α型IFN在体内可有选择性地作用于病毒等感染细胞，通过抑制受染细胞内的病毒蛋白质的生物合成，发挥广谱和高效抗病毒作用。但对正常宿主细胞无作用或作用微弱。IFN-α主要生物学活性为具有抑制病毒复制、抗寄生虫、抑制多种细胞增殖、刺激免疫细胞的杀伤活性。

γ型IFN是由激活的T细胞和NK细胞产生，具有较强抗病毒和免疫调节功能。大量研究表明，干扰素γ除了具有广谱抗病毒功能外，对免疫系统也起着关键的调节作用，所以IFN-γ又称为免疫调节干扰素。虽然各种类型的干扰素均能够介导细胞对病毒感染的反应，但干扰素γ的免疫调节活性在协调免疫反应和确定机体长期的抗病毒状态中发挥更为重要的作用，因此干扰素γ具有极为重要的临床应用价值。

血清白蛋白是血浆的重要成分，正常情况下不易透过肾小球，体内分布极广而且没有酶学和免疫学活性，是理想的药物载体。白蛋白融合技术有以下优点：白蛋白与目标蛋白在细胞内经蛋白翻译系统通过肽键链接，不需额外的体外处理；白蛋白的表达水平较高，与其融合后可以提高目的蛋白的表达水平；白蛋白是一个稳定的“惰性蛋白”，与其融合后可以提高目的蛋白的稳定性；白蛋白融合蛋白具有较长的药物半衰期，将小分子蛋白药物与白蛋白融合可有望提高在血液中的半衰期。目前，多种蛋白与白蛋白融合后在实验动物体内半衰期的延长得到了证实。

天然干扰素及人工重组干扰素目前普遍存在半衰期短的局限，半衰期一般为2-4个小时。半衰期短给治疗带来了极大的不便，治疗次数的增加，相应的时间成本及经济成本随之增加，而机体的耐受极限也有可能被突破导致不良反应的产生。半衰期短的主要原因有两个：干扰素的分子量过小在体内代谢过快，干扰素尤其是重组干扰素亲和力较差被免疫系统清除。

而市面上常见的长效干扰素以聚乙二醇融合干扰素为代表，仅在分子量的层面上部分解决了干扰素分子量小而导致半衰期短的问题，同时聚乙二醇融合干扰素成本非常高，不利于临床上应用。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种由牛白蛋白、牛干扰素γ和牛干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法，并由此融合蛋白与冻干保护剂混配之后，经冷冻干燥制备得到一种重组牛长效干扰素，所述重组牛长效干扰素可显著提高牛干扰素的半衰期，较普通牛干扰素的半衰期提高18倍以上，并具有广谱抗病毒作用并能提高牛自身的免疫应答。

本发明采取的技术方案为：

一种由牛白蛋白、牛干扰素γ和牛干扰素α组成的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示。

本发明还提供了编码上述融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列表如SEQUENCELISTING 400〈2〉所示，记为基因组1；或如SEQUENCE LISTING 400〈3〉所示，记为基因组2。

所述基因组1和所述基因组2均可编码所述融合蛋白。基因组2是对基因组1的核苷酸序列进行优化之后的结果，通常密码子适应指数CAI＝1.0时被认为该基因在该表达系统中为最优的高效表达状态，CAI值越低表明在宿主中表达水平越低。基因中GC含量最理想分布范围为30～70％，在任何区域内超过该范围均会影响翻译和转录效率。利用软件检测发现牛白蛋白、牛IFN-γ、牛IFN-α原始基因的密码子在大肠杆菌中密码子适应指数(CAI)分别为0.22、0.24、0.25，GC百分比为42.9％、39.8％、58.2％；而通过对牛白蛋白、牛IFN-γ、牛IFN-α基因优化后得到各基因在大肠杆菌中密码子适应指数(CAI)为0.99、1.0、0.97，GC百分比49.9％、44.8％、54.6％。通过基因优化显著降低了低密码子的使用率，避免了稀有密码子对蛋白表达的影响，改善了基因的GC含量，提高了转录翻译效率。

本发明还提供了含有基因组1或基因组2的表达载体。

进一步地，所述表达载体为含有基因组1或基因组2的pET-32a大肠杆菌表达载体。

本发明还提供了含有基因组1或基因组2的基因工程菌。

进一步地，所述基因工程菌为pET-32a/rAlb-IFNγ-IFNα。

含有基因组1或基因组2的宿主细胞也属于本发明的保护范围，进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞，更进一步地，所述大肠杆菌宿主细胞为BL21(DE3)感受态细胞或带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞。

本发明还提供了一种重组牛长效干扰素，所述重组牛长效干扰素由所述的融合蛋白与冻干保护剂混配之后，经冷冻干燥而成。

所述冻干保护剂为甘油、甘露醇和蔗糖，用10mmol/L PBS为缓冲液，三者的终浓度为甘油100mL/L、甘露醇0.12g/mL和蔗糖0.025g/mL。

本发明还公开了所述融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将含有基因组1或基因组2的表达载体导入到大肠杆菌宿主细胞中，获得基因工程菌，基因工程菌经IPTG诱导表达后得到所述融合蛋白的粗品，经纯化后即可得到融合蛋白。

所述表达载体为含有基因组1或基因组2的pET-32a大肠杆菌表达载体；

所述基因工程菌为pET-32a/rAlb-IFNγ-IFNα，其制备方法为：

(1)设计引物，通过反转录得到或人工分别合成带有柔性linker序列的牛白蛋白、牛干扰素γ、牛干扰素α的目的基因；通过柔性linker将牛白蛋白、牛干扰素γ、牛干扰素α的目的基因连接起来，连接后的目的基因的核苷酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示或如SEQUENCE LISTING 400〈3〉所示；

(2)将连接后的目的基因连接到pET-32a质粒上获得表达载体；

(3)将表达载体导入到大肠杆菌宿主细胞中，即可得到基因工程菌pET-32a/rAlb-IFNγ-IFNα。

所述大肠杆菌宿主细胞为BL21(DE3)感受态细胞或带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞。

所述纯化的方法为：融合蛋白的粗品先后经亲和层析、阴离子交换层析和分子筛层析纯化。

所述带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞购自上海近岸科技有限公司/欣百诺生物，货号为V205。

所述基因组1的获取方法为：

a.引物设计

牛白蛋白(Alb)的引物序列为：

上游Alb-F1：CCGGAATTCATGAAGTGGGTGACTT，带有EcoRI酶切位点；

下游Alb-R1：

ACCACCACCAGAACCACCACCACCGGCTAAGGCTGTTTG，带有柔性linker；

牛干扰素γ(IFN-γ)的引物序列为：

上游IFN-γ-F1：

GGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTATGAAATATACAAGCTATTT，带有柔性linker；

下游IFN-γ-R1：

ACCACCACCAGAACCACCACCACCCGTTGATGCTCTCCG，带有柔性linker；

牛干扰素α(IFN-α)的引物序列为：

上游IFN-α-F1：

GGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTTGCCACCTGCCTC，带有柔性linker；

下游IFN-α-R1：CCCTCGAGGTCCTTTCTCCTGAAAC，带有XhoI酶切位点；

b.从牛肝脏中提取RNA，通过反转录获得牛Alb、牛IFN-γ和牛IFN-α的目的基因，三者的基因序列分别如SEQUENCE LISTING 400〈4〉、SEQUENCE LISTING 400〈5〉所示和SEQUENCE LISTING 400〈6〉所示；

分别以牛Alb、牛IFN-γ和牛IFN-α的目的基因为模板，并分别利用牛Alb、牛IFN-γ和牛IFN-α的上下游引物进行PCR扩增，分别得到连接有柔性linker的牛Alb、牛IFN-γ和牛IFN-α基因。

PCR反应体系及条件为：在25μL的总反应体系中，模板RNA 1.5μL，上下游引物各0.5μL，反转录酶2.5μL，dNTP Mix为10μL，加RNase Free水至25μL；所述RT-PCR反应的反应条件为：50℃反转录30min，95℃预变性4min，进入循环；95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，循环35次，最后72℃延伸10min。

c.利用柔性linker连接牛Alb和牛IFN-γ目的基因得到rAlb-IFNγ基因

连接的PCR反应体系及反应条件为：在25μL的总反应体系中，连接有柔性linker的Alb基因模板DNA 1μL，连接有柔性linker的IFN-γ模板DNA 1μL，Alb上游引物0.5μL，IFN-γ下游引物0.5μL，Taq DNA聚合酶2.5μL，dNTP Mix为10μL，加RNase Free水至25μL；连接PCR反应条件为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

d.利用柔性linker连接rAlb-IFNγ基因和牛IFN-α目的基因得到rAlb-IFNγ-IFNα基因

连接的PCR反应体系及反应条件为：在25μL的总反应体系中，rAlb-IFNγ基因模板DNA 1μL，连接有柔性linker的IFN-α模板DNA 1μL，Alb上游引物0.5μL，IFN-α下游引物0.5μL，Taq DNA聚合酶2.5μL，dNTP Mix为10μL，加RNase Free水至25μL；连接PCR反应条件为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

基因组2是对基因组1进行优化之后，人工合成的基因，所述基因组2的获取方法为：

a.引物设计

牛白蛋白(Alb)的引物序列为：

上游Alb-F2：CGGGATCCATGAAATGGGTTACCTT，带有BamHI酶切位点；

下游Alb-R2：

ACCACCACCAGAACCACCACCACCAGCCAGAGCGGTC，带有柔性linker；

牛干扰素γ(IFN-γ)的引物序列为：

上游IFN-γ-F2：

GGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTATGAAATACACCTCTTAC，带有柔性linker；

下游IFN-γ-R2：

ACCACCACCAGAACCACCACCACCGGTAGAAGCACGACG，带有柔性linker；

牛干扰素α(IFN-α)：

上游IFN-α-F2：

GGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTTGCCACCTGCCG，带有柔性linker；

下游IFN-α-R2：

CCCTCGAGGTCTTTACGACGGAAA，带有XhoI酶切位点。

b.所述牛Alb、牛IFN-γ和牛IFN-α的目的基因，三者的基因序列分别如SEQUENCELISTING 400〈7〉、SEQUENCE LISTING 400〈8〉和SEQUENCE LISTING 400〈9〉所示；

PCR反应体系及条件为：在25μL的总反应体系中，基因组DNA 1.0μL，上下游引物各0.5μL，Taq DNA聚合酶2.5μL，dNTP Mix为10μL，加RNase Free水至25μL；所述RT-PCR反应的反应条件为：95℃预变性4min，进入循环；95℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，循环35次，最后72℃延伸10min。

c.利用柔性linker连接牛Alb和牛IFN-γ目的基因得到rAlb-IFNγ基因

连接的PCR反应体系及反应条件为：在25μL的总反应体系中，连接有柔性linker的Alb基因模板DNA 1μL，连接有柔性linker的IFN-γ模板DNA 1μL，Alb上游引物0.5μL，IFN-γ下游引物0.5μL，Taq DNA聚合酶2.5μL，dNTP Mix为10μL，加RNase Free水至25μL；连接PCR反应条件为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

d.利用柔性linker连接rAlb-IFNγ基因和牛IFN-α目的基因得到rAlb-IFNγ-IFN-α基因

连接的PCR反应体系及反应条件为：在25μL的总反应体系中，rAlb-IFNγ基因模板DNA 1μL，IFN-α模板DNA 1μL，连接有柔性linker的Alb上游引物0.5μL，IFN-α下游引物0.5μL，Taq DNA聚合酶2.5μL，dNTP Mix为10μL，加RNase Free水至25μL；连接PCR反应条件为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

本发明还提供了所述重组牛长效干扰素的应用，其半衰期长达72小时以上，具有广谱抗病毒作用并能提高牛自身的免疫应答。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.通过柔性linker将牛Alb、牛IFN-γ和牛IFN-α基因实现融合表达，提高了干扰素半衰期，与普通干扰素相比，提高了18倍以上；

2.通过对牛Alb、牛IFN-γ和牛IFN-α基因进行优化，提高了牛Alb、牛IFN-γ和牛IFN-α融合蛋白的表达量。

3.以重组大肠杆菌pET-32a/rAlb-IFNγ-IFNα作为表达菌株，通过引入分子伴侣pGro7质粒，在蛋白表达时产生包涵体较少，形成大量可溶性蛋白，避免了包涵体变性和复性的过程，大大缩短了融合蛋白表达的时间；

4.本发明公开的由牛Alb、牛IFN-γ和牛IFN-α组成的融合蛋白不仅具有IFN-α的广谱抗病毒作用，同时显著提高了牛自身的免疫应答。

附图说明

图1为实施例1中的牛白蛋白基因、牛干扰素α基因与牛干扰素γ基因RT-PCR扩增的结果；泳道M：DNA Marker DL2000；泳道1：牛干扰素α基因RT-PCR扩增产物；泳道2：牛干扰素γ基因RT-PCR扩增产物；泳道3：牛白蛋白基因RT-PCR扩增产物；

图2为实施例1中的牛Alb、IFN-γ和IFN-α的目的基因连接之后的PCR扩增的结果；泳道M：DNA Marker DL10000；泳道1：牛白蛋白基因、牛干扰素γ基因与牛干扰素α基因连接扩增产物；

图3为实施例1中的阳性克隆质粒的PCR扩增及双酶切鉴定结果；泳道M：DNAMarker DL10000；泳道1：重组质粒双酶切结果；泳道2：质粒PCR结果；

图4为实施例1中的重组蛋白的SDS-PAGE电泳检查结果；泳道M：蛋白Marker；泳道1：重组菌诱导后的菌体破碎后上清；泳道2：重组菌诱导后的菌体破碎后沉淀；泳道3：空载对照；

图5为实施例1得到的融合蛋白的Western Blot鉴定结果；泳道M：蛋白Marker；泳道1：重组菌诱导破碎后上清；泳道2：为重组菌诱导破碎后沉淀；

图6为实施例5中由实施例1中的融合蛋白制得的重组牛长效干扰素α对VSV致细胞病变的抑制作用；1为VSV病毒对照孔；2为HEp-2细胞对照孔；A3-12为梯度稀释(从右向左)的人干扰素标准品处理孔；B3-12为梯度稀释(从右向左)的重组牛长效干扰素α处理孔；

图7为实施例8中由实施例1中的融合蛋白制得的重组牛长效干扰素α肌肉注射血药浓度-时间变化曲线。

具体实施方式

实施例1

一种由牛白蛋白、牛干扰素γ与牛干扰素α组成的融合蛋白，其制备方法如下：

1.牛白蛋白(Alb)、牛干扰素γ(IFN-γ)与牛干扰素α(IFN-α)目的基因的获取与扩增

引物设计：

根据Genebank中已报道的目的基因序列设计合成引物见表1，在牛白蛋白的上游引物和下游引物中分别引入EcoRI酶切位点和Linker序列，在牛干扰素γ的上游引物和下游引物中分别引入Linker序列，在牛干扰素α的上游引物和下游引物中分别引入Linker序列和XhoI酶切位点。

表1 PCR扩增引物

RT-PCR获取目的基因：

从牛肝脏组织中提取RNA，通过反转录获得牛Alb、牛IFN-γ和牛IFN-α的目的基因，三者的基因序列分别如SEQUENCE LISTING 400〈4〉、SEQUENCE LISTING 400〈5〉和SEQUENCE LISTING 400〈6〉所示；

RT-PCR反应体系(25μL)见表2

表2 RT-PCR反应体系

RNase Free水	10μL
		dNTP Mix	10μL
反转录酶	2.5μL
		上、下游引物	各0.5μL
基因组RNA	1.5μL

反应参数为：50℃反转录30min，95℃预变性4min，进入循环：95℃变性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在1850bp、560bp和530bp左右出现特异条带，其结果如图1所示，说明分别制备得到了分别连接有柔性linker序列的牛Alb、牛IFN-γ和牛IFN-α的目的基因。

2.目的基因的连接

将目的基因均稀释到10ug/mL，利用重叠PCR连接各段目的基因，25μL反应体系如表3、表4所示：

表3 rAlb-IFNγPCR反应体系

表4 rAlb-IFNγ-IFNαPCR反应体系

反应参数为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在2880bp左右出现特异条带，其结果如图2所示，图2中出现了rAlb-IFNγ和IFN-α扩增产物条带，这是因为在rAlb-IFNγ和IFN-α基因连接的过程中，出现了非特异反应。得到的目的基因的核苷酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示。

3.表达载体构建

选择连接后的目的基因经测序无误后，PCR胶回收产物与pET-32a质粒均使用EcoRI和XhoI限制性内切酶进行双酶切和回收，按表5中的20μL体系做双酶切：

表5双酶切体系

将连接后的目的基因与pET-32a质粒的酶切回收产物按表6中的体系进行连接，4℃过夜连接：

表6酶连体系

目的片段DNA	10μL
		表达载体	3μL
buffer	2μL
		连接酶	1μL
RNase Free水	4μL

转化连接产物至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，将感受态细胞涂布于含氨苄青霉素的LB培养基平板过夜培养；挑取LB平板上的单菌落进行目的基因PCR鉴定，阳性克隆菌质粒经EcoRI和XhoI双酶切鉴定，鉴定为阳性者表示工程菌构建成功，PCR扩增和双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳在2880bp处检测出单一条带，其结果如图3所示，说明成功得到了pET-32a/rAlb-IFNγ-IFNα工程菌。

4.重组蛋白的表达

挑取工程菌于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃摇床复苏1h，在LB培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)中放大培养4h(OD＝1.0)，加入终浓度为100μg/ml的IPTG，32℃诱导表达5h；收集菌体，经SDS-PAGE电泳检测，其结果如图4所示，从图中可以看出，重组菌诱导5h后的菌体破碎后上清和沉淀在123.8KD左右处可见优势表达条带，说明在沉淀和上清中均成功表达了融合蛋白。

加入质量体积比1:1的PBS重悬沉淀；-20℃于室温反复冻融沉淀3次；4℃超声裂解细菌沉淀，工作10s，间隔3S，超声6min，整个过程重复3～4次；4℃，12000r/min离心15min，分别取上清、沉淀，得到粗制融合蛋白。

5.融合蛋白纯化

5.1 His亲和层析

粗制融合蛋白用0.22μm孔径的滤膜过滤后，上样通过连接在AKTA explorer 100蛋白纯化系统上，用Binding Buffer Ⅰ(PBS)平衡好的His亲和层析柱，用PBS缓冲液洗去未结合的蛋白，直到A280nm稳定，再用Elution buffer Ⅰ(50mM三羟甲基氨基甲烷，20～500mM咪唑，PH8.0)洗脱，收集rAlb-IFNγ-IFNα蛋白峰。

5.2 DEAE阴离子交换层析

将经过His亲和层析纯化后收集的蛋白置换到Binding Buffer Ⅱ(50mM三羟甲基氨基甲烷，PH6.5)中后，上样通过用Binding Buffer Ⅱ平衡好的DEAE阴离子交换层析柱，再用Binding Buffer Ⅱ过柱至A280nm值稳定后，用Elution Buffer Ⅱ(50mM三羟甲基氨基甲烷，1M NaCl，PH6.5)线性梯度洗脱，收集rAlb-IFNγ-IFNα蛋白峰。

5.3分子筛层析

将离子交换层析收集到的样品浓缩后上样通过用Binding Buffer Ⅲ(50mMNa₂HPO4，0.15M NaCl，PH7.4)平衡好Superdex 200分子筛层析柱，用Binding Buffer Ⅲ洗脱，收集rAlb-IFNγ-IFNα蛋白峰。

5.4样品鉴定

测定rAlb-IFNγ-IFNα效价及比活性，比活性≥10⁷IU/mg，蛋白合格；无菌分装，-80℃保存。即可得到由牛白蛋白、牛干扰素γ与牛干扰素α组成的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示。

实施例2

一种由牛白蛋白、牛干扰素γ与牛干扰素α组成的融合蛋白，其他同实施例1，只是将其中的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞替换为了带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞。其融合蛋白的SDS-PAGE电泳结果同实施例1对照，上清液中123.8KD左右处优势表达条带较粗，说明引入分子伴侣pGro7后，目的蛋白在上清液中的表达更好，得到的融合蛋白量更高。大肠杆菌表达的蛋白大部分存在于包涵体中；通过在表达菌株中引入分子伴侣，协同表达蛋白正确折叠，达到蛋白可溶性表达。

所述带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞购自上海近岸科技有限公司/欣百诺生物，货号V205。

实施例3

对实施例1中的牛Alb、牛IFN-γ和牛IFN-α进行优化，人工合成牛Alb、牛IFN-γ和牛IFN-α目的基因，优化后，三者的核苷酸序列分别如SEQUENCE LISTING 400〈7〉、SEQUENCELISTING 400〈8〉和SEQUENCE LISTING 400〈9〉所示。

1.1密码子优化

遗传密码子有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。那些被最频繁利用的称为最佳密码子(optimal codons)，那些不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子(rare or low-usage codons)。实际上，常用做蛋白表达或生产的每种生物(包括大肠杆菌，酵母，哺乳动物细胞，植物细胞和昆虫细胞)都表现出某种程度的密码子利用的差异或偏爱。大肠杆菌、酵母和果蝇中对含最佳密码子的基因的表达效率明显高于含低利用率的密码子的基因的表达效率。因此，在异源表达系统中，密码子的偏爱性很大程度上影响了重组蛋白的表达。利用偏爱密码子(preferred codons)并避免利用稀有的密码子进行基因合成，这种基因的重新设计叫密码子优化。因此，本实施例中对牛Alb、牛IFN-γ和牛IFN-α基因密码子进行优化。

1.2密码子优化后结果分析

通常密码子适应指数(CAI)＝1.0时被认为该基因在该表达系统中的最优的高效表达状态，CAI值越低表明在宿主中表达水平越低。基因中GC含量最理想分布范围为30～70％，在任何区域内超过该范围均会影响翻译和转录效率。利用软件检测发现牛Alb、牛IFN-γ和牛IFN-α原始基因的密码子在大肠杆菌中密码子适应指数(CAI)分别为0.22、0.24、0.25，GC百分比为42.9％、39.8％、58.2％；而通过对牛Alb、牛IFN-γ和牛IFN-α基因优化后得到重组基因在大肠杆菌中密码子适应指数(CAI)分别为0.99、1.0、0.97，GC百分比49.9％、44.8％、54.6％。通过基因优化显著降低了低密码子的使用率，避免了稀有密码子对蛋白表达的影响，改善了基因的GC含量，提高了转录翻译效率。

1.3引物设计：

表7 PCR扩增引物

将优化后的牛Alb、牛IFN-γ和牛IFN-α的基因组DNA分别稀释至0.05mg/mL。利用PCR扩增获得目的基因，25μL反应体系如表8所示：

表8 PCR反应体系

反应参数为：95℃预变性4min，进入循环：95℃变性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

牛Alb、牛IFN-γ与牛IFN-α的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分别在1850bp、560bp和530bp左右出现特异条带，说明制备得到了优化后的分别连接有柔性linker的牛Alb、牛IFN-γ和牛IFN-α的目的基因。

2.目的基因的连接

将目的基因均稀释到10ug/mL，利用重叠PCR连接各段目的基因，25μL反应体系如表9、表10所示：

表9 rAlb-IFNγPCR反应体系

表10 rAlb-IFNγ-IFN-αPCR反应体系

反应参数为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在2880bp左右出现特异条带，说明成功得到了连接后的rAlb-IFNγ-IFN-α基因。得到的目的基因的核苷酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈3〉所示。

3.表达载体构建

选择连接后的目的基因经测序后无误的PCR的胶回收产物与pET-32a质粒均使用BamHI、XhoI限制性内切酶进行双酶切和回收，按表11中的20μL体系做双酶切：

表11双酶切体系

通用buffer	2μL
		限制性内切酶(一对)	1μL+1μL
载体或回收片段	2ul
		RNase Free水	14μL

将连接后的目的基因与pET-32a质粒的酶切回收产物按表12中的体系进行连接，4℃过夜连接：

表12

转化连接产物至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，将感受态涂布于含氨苄青霉素的LB平板中过夜培养；取LB平板上生长的菌落经PCR鉴定目的基因，阳性克隆菌质粒经BamHI、XhoI双酶切鉴定，鉴定为阳性者表示表达载体构建成功，PCR扩增和双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳在2880bp左右处出现单一条带，说明含有rAlb-IFNγ-IFNα融合基因工程菌pET-32a/rAlb-IFNγ-IFNα构建成功。

4.重组蛋白的表达

挑取工程菌于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃摇床复苏1h，在LB培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)中放大培养4h(OD＝1.0)，加入终浓度为100μg/ml的IPTG，32℃诱导表达5h；收集菌体，经SDS-PAGE电泳检测，重组菌诱导5h后的菌体破碎后上清和沉淀在123.8KD左右处可见优势表达条带，说明在上清和沉淀中均得到了重组蛋白。

5.融合蛋白纯化

5.1 His亲和层析

5.2 DEAE阴离子交换层析

5.3分子筛层析

将离子交换层析收集到的样品浓缩后上样通过用Binding Buffer Ⅲ(50mMNa₂HPO4，0.15M NaCl，PH7.4)平衡好Superdex 200分子筛层析柱，用Binding BufferⅢ洗脱，收集rAlb-IFNγ-IFNα蛋白峰。

5.4样品鉴定

测定rAlb-IFNγ-IFNα效价及比活性，比活性≥10⁷IU/mg，蛋白为合格；无菌分装，-80℃保存。即可得到由牛白蛋白、牛干扰素γ与牛干扰素α组成的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示。

实施例4

一种由牛白蛋白、牛干扰素γ和牛干扰素α组成的融合蛋白，其他同实施例3，只是将其中的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞替换为了带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞。其融合蛋白的SDS-PAGE电泳结果同实施例3对照，上清液中123.8KD左右处优势表达条带较粗，说明引入分子伴侣pGro7后，目的蛋白在上清液中的表达更好，得到的融合蛋白量更高。大肠杆菌表达的蛋白大部分存在于包涵体中；通过在表达菌株中引入分子伴侣，协同表达蛋白正确折叠，达到蛋白可溶性表达。

实施例5

一种重组牛长效干扰素α，由实施例1、2、3、4中的融合蛋白分别与冻干保护剂混配之后，经冷冻干燥而成。所述冻干保护剂为甘油、甘露醇和蔗糖，用10mmol/L PBS为缓冲液，三者的终浓度为甘油100mL/L、甘露醇0.12g/mL和蔗糖0.025g/mL。

实施例6

实施例1～4得到由牛白蛋白、牛干扰素γ与牛干扰素α组成的融合蛋白的鉴定

6.1蛋白含量的定量检测

用Lowry法，以中国食品药品生物制品检定院的标准蛋白作标准测定，测定实施例1～4得到的融合蛋白浓度均大于1.1mg/ml。

6.2 SDS-PAGE电泳检测

与空菌相比，融合蛋白在123.8KD左右有一条浓染的新增蛋白条带，如图4所示。

6.3 Western Blot结果

分别检测实施例1～4中融合蛋白，以abcam公司鼠抗牛α干扰素(1:5000稀释)为一抗，以山羊抗小鼠IgG-HRP为二抗(1:10000稀释)。重组牛长效干扰素样品能与抗牛干扰素α单克隆抗体发生特异性反应，123.8KD左右处出现特异性条带，如图5所示。

实施例7

实施例5中的四份重组牛长效干扰素α冻干剂的效价检测

按照微量细胞病变抑制法，用培养基将Hep-2细胞配成5×10⁵细胞/ml细胞悬浮液，每孔接种0.1ml移入96孔细胞培养板。37℃、5％CO₂培养24h，加入不同剂量的重组牛长效干扰素α，24h后吸弃，再分别接种100 TCID50 VSV病毒。

试验结果

结果表明获得的重组牛长效干扰素α对VSV引起HEp-2细胞的病变具有明显的抑制作用。未经处理的细胞接种病毒后均出现细胞变圆、脱落、崩解等病变。而获得的重组牛长效干扰素处理后的细胞接种病毒后，在倒置显微镜下连续观察，细胞形态正常，未出现任何病变，测得效价≥10⁷IU/ml，如图6所示。

实施例8

实施例5中的分别由实施例1～4的融合蛋白得到的四份重组牛长效干扰素α冻干剂(分别记为A、B、C、D)在牛体内的半衰期的测定

细胞病变抑制法测定rAlb-IFNγ-IFNα的血药浓度与时间关系

取六只体重大致相同的牛(雌雄各半)，颈部皮下注射2mg/ml重组牛长效干扰素α冻干剂2ml，分别在1h、2h、4h、8h、16h、26h、44h、79h静脉采血，血样4℃凝固，3500rpm低温离心10min分离血清，各时点每只牛血样于-20℃保存待测。采用细胞病变抑制法测定血清样品中rAlb-IFNγ-IFNα的浓度，用DAS药动学软件进行曲线拟合并计算参数。参数计算结果见表13。

表13重组牛长效干扰素α肌肉注射后血清中主要动力学参数

结果表明重组牛长效干扰素α有较长的半衰期。经测定半衰期能达到72h左右，较普通干扰素提高约18倍。

实施例9

实施例5中的四份重组牛长效干扰素α冻干剂对牛细胞免疫应答影响的测定

取六只体重大致相同的肉牛分为两组，记为实验组和对照组；实验组颈部皮下注射2mg/ml重组牛长效干扰素α冻干剂2ml，对照组颈部皮下注射2mL的PBS，取注射4周后牛外周血，之后每周取一次血，使用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，淋巴细胞经过无血清RPMI1640培养基洗2次后，用完全培养基重悬、调整细胞浓度为2×10⁶个/ml，24孔细胞培养板每孔加入1ml淋巴细胞，37℃，5％CO₂培养72h，收集淋巴细胞培养时上清。ELISA检测培养上清中IL-2、IL-4含量，按试剂盒说明书进行，检测结果如表14所示：

表14 ELISA检测各组牛细胞免疫应答水平

结果表明注射重组牛长效干扰素α后，能够显著提高牛外周血中细胞因子IL-2、IL-4的含量，增强了细胞免疫应答水平，显著提高免疫力水平。

上述参照实施例对一种由牛白蛋白、牛干扰素γ和牛干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司

<120> 一种由牛白蛋白、牛干扰素γ和牛干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法

<130> 1

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 959

<212> PRT

<213> 牛白蛋白-干扰素γ-干扰素α融合蛋白

<400> 1

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Leu Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Thr His Lys Ser Glu Ile Ala

20 25 30

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu His Phe Lys Gly Leu Val Leu

35 40 45

Ile Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Asp Glu His Val

50 55 60

Lys Leu Val Asn Glu Leu Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

65 70 75 80

Glu Ser His Ala Gly Cys Glu Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

85 90 95

Glu Leu Cys Lys Val Ala Ser Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Asp Met Ala

100 105 110

Asp Cys Cys Glu Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Ser

115 120 125

His Lys Asp Asp Ser Pro Asp Leu Pro Lys Leu Lys Pro Asp Pro Asn

130 135 140

Thr Leu Cys Asp Glu Phe Lys Ala Asp Glu Lys Lys Phe Trp Gly Lys

145 150 155 160

Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu

165 170 175

Leu Leu Tyr Tyr Ala Asn Lys Tyr Asn Gly Val Phe Gln Glu Cys Cys

180 185 190

Gln Ala Glu Asp Lys Gly Ala Cys Leu Leu Pro Lys Ile Glu Thr Met

195 200 205

Arg Glu Lys Val Leu Ala Ser Ser Ala Arg Gln Arg Leu Arg Cys Ala

210 215 220

Ser Ile Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Leu Lys Ala Trp Ser Val Ala

225 230 235 240

Arg Leu Ser Gln Lys Phe Pro Lys Ala Glu Phe Val Glu Val Thr Lys

245 250 255

Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Lys Glu Cys Cys His Gly Asp

260 265 270

Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys

275 280 285

Asp Asn Gln Asp Thr Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Asp Lys

290 295 300

Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Lys Asp Ala

305 310 315 320

Ile Pro Glu Asn Leu Pro Pro Leu Thr Ala Asp Phe Ala Glu Asp Lys

325 330 335

Asp Val Cys Lys Asn Tyr Gln Glu Ala Lys Asp Ala Phe Leu Gly Ser

340 345 350

Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Glu Tyr Ala Val Ser Val

355 360 365

Leu Leu Arg Leu Ala Lys Glu Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Glu Cys Cys

370 375 380

Ala Lys Asp Asp Pro His Ala Cys Tyr Ser Thr Val Phe Asp Lys Leu

385 390 395 400

Lys His Leu Val Asp Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Asp

405 410 415

Gln Phe Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Leu Ile Val

420 425 430

Arg Tyr Thr Arg Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu

435 440 445

Val Ser Arg Ser Leu Gly Lys Val Gly Thr Arg Cys Cys Thr Lys Pro

450 455 460

Glu Ser Glu Arg Met Pro Cys Thr Glu Asp Tyr Leu Ser Leu Ile Leu

465 470 475 480

Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys Val

485 490 495

Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser

500 505 510

Ala Leu Thr Pro Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Ala Phe Asp Glu Lys

515 520 525

Leu Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Pro Asp Thr Glu Lys

530 535 540

Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Leu Lys His Lys Pro

545 550 555 560

Lys Ala Thr Glu Glu Gln Leu Lys Thr Val Met Glu Asn Phe Val Ala

565 570 575

Phe Val Asp Lys Cys Cys Ala Ala Asp Asp Lys Glu Ala Cys Phe Ala

580 585 590

Val Glu Gly Pro Lys Leu Val Val Ser Thr Gln Thr Ala Leu Ala Gly

595 600 605

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Phe

610 615 620

Leu Ala Leu Leu Leu Cys Gly Leu Leu Gly Phe Ser Gly Ser Tyr Gly

625 630 635 640

Gln Gly Gln Phe Phe Arg Glu Ile Glu Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Asn

645 650 655

Ala Ser Ser Pro Asp Val Ala Lys Gly Gly Pro Leu Phe Ser Glu Ile

660 665 670

Leu Lys Asn Trp Lys Asp Glu Ser Asp Lys Lys Ile Ile Gln Ser Gln

675 680 685

Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Glu Asn Leu Lys Asp Asn Gln

690 695 700

Val Ile Gln Arg Ser Met Asp Ile Ile Lys Gln Asp Met Phe Gln Lys

705 710 715 720

Phe Leu Asn Gly Ser Ser Glu Lys Leu Glu Asp Phe Lys Lys Leu Ile

725 730 735

Gln Ile Pro Val Asp Asp Leu Gln Ile Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu

740 745 750

Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser Pro Lys Ser Asn Leu Arg Lys

755 760 765

Arg Lys Arg Ser Gln Asn Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Thr Gly

770 775 780

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys His Leu Pro His Thr His

785 790 795 800

Ser Leu Ala Asn Arg Arg Val Leu Met Leu Leu Gly Gln Leu Arg Arg

805 810 815

Val Ser Pro Ser Ser Cys Leu Gln Asp Arg Asn Asp Phe Ala Phe Pro

820 825 830

Gln Glu Ala Leu Gly Gly Ser Gln Leu Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser

835 840 845

Val Leu His Glu Val Thr Gln His Thr Phe Gln Leu Phe Ser Thr Glu

850 855 860

Gly Ser Ala Thr Thr Trp Asp Glu Ser Leu Leu Asp Lys Leu Arg Ala

865 870 875 880

Ala Leu Asp Gln Gln Leu Thr Asp Leu Gln Ala Cys Leu Arg Gln Glu

885 890 895

Glu Glu Leu Gln Gly Ala Pro Leu Leu Lys Glu Asp Ser Ser Leu Ala

900 905 910

Val Arg Lys Tyr Phe His Arg Leu Thr Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Lys

915 920 925

His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Gln Val Met Arg Ala

930 935 940

Phe Ser Ser Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Phe Arg Arg Lys Asp

945 950 955

<210> 2

<211> 2877

<212> DNA

<213> 基因组1

<400> 2

atgaagtggg tgacttttat ttctcttctc cttctcttca gctctgctta ttccaggggt 60

gtgtttcgtc gagatacaca caagagtgag attgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa 120

gaacatttta aaggcctggt actgattgcc ttttctcagt atctccagca gtgtccattt 180

gatgagcatg taaaattagt gaacgaacta actgagtttg caaaaacatg tgttgctgat 240

gagtcccatg ccggctgtga aaagtcactt cacactctct ttggagatga attgtgtaaa 300

gttgcatccc ttcgtgaaac ctatggtgac atggctgact gctgtgagaa acaagagcct 360

gaaagaaatg aatgcttcct gagccacaaa gatgatagcc cagacctccc taaattgaaa 420

ccagacccca atactttgtg tgatgagttt aaggcagatg aaaagaagtt ttggggaaaa 480

tacctatacg aaattgctag aagacatccc tacttttatg caccagaact cctttactat 540

gctaataaat ataatggagt ttttcaagaa tgctgccaag ctgaagataa aggtgcctgc 600

ctgctaccaa agattgaaac tatgagagaa aaggtactag cttcatctgc cagacagaga 660

ctcaggtgtg ccagtattca aaaatttgga gaaagagctt taaaagcatg gtcagtagct 720

cgcctgagcc agaaatttcc caaggctgag tttgtagaag ttaccaagct agtgacagat 780

ctcacaaaag tccacaagga atgctgccat ggtgacctac ttgaatgcgc agatgacagg 840

gcagatcttg ccaagtacat atgtgataat caagatacaa tctccagtaa actgaaggaa 900

tgctgtgata agcctttgtt ggaaaaatcc cactgcattg ctgaggtaga aaaagatgcc 960

atacctgaaa acctgccccc attaactgct gactttgctg aagataagga tgtttgcaaa 1020

aactatcagg aagcaaaaga tgccttcctg ggctcgtttt tgtatgaata ttcaagaagg 1080

catcctgaat atgctgtctc agtgctattg agacttgcca aggaatatga agccacactg 1140

gaggaatgct gtgccaaaga tgatccacat gcatgctatt ccacagtgtt tgacaaactt 1200

aagcatcttg tggatgagcc tcagaattta atcaaacaaa actgtgacca attcgaaaaa 1260

cttggagagt atggattcca aaatgcgctc atagttcgtt acaccaggaa agtaccccaa 1320

gtgtcaactc caactctcgt ggaggtttca agaagcctag gaaaagtggg tactaggtgt 1380

tgtacaaagc cggaatcaga aagaatgccc tgtactgaag actatctgag cttgatcctg 1440

aaccggttgt gcgtgctgca tgagaagaca ccagtgagtg aaaaagtcac caagtgctgc 1500

acagagtcat tggtgaacag acggccatgt ttctctgctc tgacacctga tgaaacatat 1560

gtacccaaag cctttgatga gaaattgttc accttccatg cagatatatg cacacttccc 1620

gatactgaga aacaaatcaa gaaacaaact gcacttgttg agctgttgaa acacaagccc 1680

aaggcaacag aggaacaact gaaaaccgtc atggagaatt ttgtggcttt tgtagacaag 1740

tgctgtgcag ctgatgacaa agaagcctgc tttgctgtgg agggtccaaa acttgttgtt 1800

tcaactcaaa cagccttagc cggtggtggt ggttctggtg gtggtggttc tatgaaatat 1860

acaagctatt tcttagcttt actgctctgt gggcttttgg gtttttctgg ttcttatggc 1920

cagggccaat tttttagaga aatagaaaac ttaaaggagt attttaatgc aagtagccca 1980

gatgtagcta agggtgggcc tctcttctca gaaattttga agaattggaa agatgaaagt 2040

gacaaaaaaa ttattcagag ccaaattgtc tccttctact tcaaactctt tgaaaacctc 2100

aaagataacc aggtcattca aaggagcatg gatatcatca agcaagacat gtttcagaag 2160

ttcttgaatg gcagctctga gaaactggag gacttcaaaa agctgattca aattccggtg 2220

gatgatctgc agatccagcg caaagccata aatgaactca tcaaagtgat gaatgacctg 2280

tcaccaaaat ctaacctcag aaagcggaag agaagtcaga atctctttcg aggccggaga 2340

gcatcaacgg gtggtggtgg ttctggtggt ggtggttctt gccacctgcc tcacacccac 2400

agcctggcca acaggagggt cctgatgctc ctgggacaac tgaggagggt ctccccttcc 2460

tcctgcctgc aggacagaaa tgacttcgca ttcccccagg aggcgctggg tggcagccag 2520

ttgcagaagg ctcaagccat ctctgtgctc cacgaggtga cccagcacac cttccagctt 2580

ttcagcacag agggctcggc cactacgtgg gatgagagcc tcctggacaa gctccgcgct 2640

gcactggatc agcagctcac tgacctgcaa gcctgtctga ggcaggagga ggagctgcaa 2700

ggagctcccc tgctcaagga ggactccagc ctggctgtga ggaaatactt ccacagactc 2760

actctctatc tgcaagagaa gaaacacagc ccttgtgcct gggaggttgt cagagcacaa 2820

gtcatgagag ccttctcttc ctcaacaaac ttgcaggaga gtttcaggag aaaggac 2877

<210> 3

<211> 2877

<212> DNA

<213> 基因组2

<400> 3

atgaaatggg ttaccttcat ctctctgctg ctgctgttct cttctgctta ctctcgtggt 60

gttttccgtc gtgacaccca caaatctgaa atcgctcacc gtttcaaaga cctgggtgaa 120

gaacacttca aaggtctggt tctgatcgct ttctctcagt acctgcagca gtgcccgttc 180

gacgaacacg ttaaactggt taacgaactg accgaattcg ctaaaacctg cgttgctgac 240

gaatctcacg ctggttgcga aaaatctctg cacaccctgt tcggtgacga actgtgcaaa 300

gttgcttctc tgcgtgaaac ctacggtgac atggctgact gctgcgaaaa acaggaaccg 360

gaacgtaacg aatgcttcct gtctcacaaa gacgactctc cggacctgcc gaaactgaaa 420

ccggacccga acaccctgtg cgacgaattc aaagctgacg aaaaaaaatt ctggggtaaa 480

tacctgtacg aaatcgctcg tcgtcacccg tacttctacg ctccggaact gctgtactac 540

gctaacaaat acaacggtgt tttccaggaa tgctgccagg ctgaagacaa aggtgcttgc 600

ctgctgccga aaatcgaaac catgcgtgaa aaagttctgg cttcttctgc tcgtcagcgt 660

ctgcgttgcg cttctatcca gaaattcggt gaacgtgctc tgaaagcttg gtctgttgct 720

cgtctgtctc agaaattccc gaaagctgaa ttcgttgaag ttaccaaact ggttaccgac 780

ctgaccaaag ttcacaaaga atgctgccac ggtgacctgc tggaatgcgc tgacgaccgt 840

gctgacctgg ctaaatacat ctgcgacaac caggacacca tctcttctaa actgaaagaa 900

tgctgcgaca aaccgctgct ggaaaaatct cactgcatcg ctgaagttga aaaagacgct 960

atcccggaaa acctgccgcc gctgaccgct gacttcgctg aagacaaaga cgtttgcaaa 1020

aactaccagg aagctaaaga cgcttttctc ggtagcttcc tgtacgaata ctctcgtcgt 1080

cacccggaat acgctgtttc tgttctgctg cgtctggcta aagaatacga agctaccctg 1140

gaagaatgct gcgctaaaga cgacccgcac gcttgctact ctaccgtttt cgacaaactg 1200

aaacacctgg ttgacgaacc gcagaacctg atcaaacaga actgcgacca gttcgaaaaa 1260

ctgggtgaat acggtttcca gaacgctctg atcgttcgtt acacccgtaa agttccgcag 1320

gtttctaccc cgaccctggt tgaagtttct cgttctctgg gtaaagttgg tacccgttgc 1380

tgcaccaaac cggaatctga acgtatgccg tgcaccgaag actacctgtc tctgatcctg 1440

aaccgtctgt gcgttctgca cgaaaaaacc ccggtttctg aaaaagttac caaatgctgc 1500

accgaatctc tggttaaccg tcgtccgtgc ttctctgctc tgaccccgga cgaaacctac 1560

gttccgaaag ctttcgacga aaaactgttc accttccacg ctgacatctg caccctgccg 1620

gacaccgaaa aacagatcaa aaaacagacc gctctggttg aactgctgaa acacaaaccg 1680

aaagctaccg aagaacagct gaaaaccgtt atggaaaact tcgttgcttt cgttgacaaa 1740

tgctgcgctg ctgacgacaa agaagcttgc ttcgctgttg aaggtccgaa actggttgtt 1800

tctacccaga ccgctctggc tggtggtggt ggttctggtg gtggtggttc tatgaaatac 1860

acctcttact tcctggctct gctgctgtgc ggtctgctgg gtttctctgg ttcttacggt 1920

cagggtcagt tcttccgtga aatcgaaaac ctgaaagaat acttcaacgc ttcttctccg 1980

gacgttgcta aaggtggtcc gctgttctct gaaatcctga aaaactggaa agacgaatct 2040

gacaaaaaaa tcatccagtc tcagatcgtt tctttctact tcaaactgtt cgaaaacctg 2100

aaagacaacc aggttatcca gcgttctatg gacatcatca aacaggacat gttccagaaa 2160

ttcctgaacg gttcttctga aaaactggaa gacttcaaaa aactgatcca gatcccggtt 2220

gacgacctgc agatccagcg taaagctatc aacgaactga tcaaagttat gaacgacctg 2280

tctccgaaat ctaacctgcg taaacgtaaa cgttctcaga acctgttccg tggtcgtcgt 2340

gcttctaccg gtggtggtgg ttctggtggt ggtggttctt gccacctgcc gcacacccac 2400

tctctggcta accgtcgtgt tctgatgctg ctgggtcagt tacgtcgtgt aagcccgtct 2460

tcttgcctgc aggaccgtaa cgacttcgct ttcccgcagg aagctctggg tggttctcag 2520

ctgcagaaag ctcaggctat ctctgttctg cacgaagtta cccagcacac cttccagctg 2580

ttctctaccg aaggttctgc taccacctgg gacgaatctc tgctggacaa actgcgtgct 2640

gctctggacc agcagctgac cgacctgcag gcttgcctgc gtcaggaaga agaactgcag 2700

ggtgctccgc tgctgaaaga agactcttct ctggctgttc gtaaatactt ccaccgtctg 2760

accctgtacc tgcaggaaaa aaaacactct ccgtgcgctt gggaagttgt tcgtgctcag 2820

gttatgcgtg ctttctcttc ttctaccaac ctgcaggaat ctttccgtcg taaagac 2877

<210> 4

<211> 1821

<212> DNA

<213> 牛白蛋白

<400> 4

atgaagtggg tgacttttat ttctcttctc cttctcttca gctctgctta ttccaggggt 60

gtgtttcgtc gagatacaca caagagtgag attgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa 120

gaacatttta aaggcctggt actgattgcc ttttctcagt atctccagca gtgtccattt 180

gatgagcatg taaaattagt gaacgaacta actgagtttg caaaaacatg tgttgctgat 240

gagtcccatg ccggctgtga aaagtcactt cacactctct ttggagatga attgtgtaaa 300

gttgcatccc ttcgtgaaac ctatggtgac atggctgact gctgtgagaa acaagagcct 360

gaaagaaatg aatgcttcct gagccacaaa gatgatagcc cagacctccc taaattgaaa 420

ccagacccca atactttgtg tgatgagttt aaggcagatg aaaagaagtt ttggggaaaa 480

tacctatacg aaattgctag aagacatccc tacttttatg caccagaact cctttactat 540

gctaataaat ataatggagt ttttcaagaa tgctgccaag ctgaagataa aggtgcctgc 600

ctgctaccaa agattgaaac tatgagagaa aaggtactag cttcatctgc cagacagaga 660

ctcaggtgtg ccagtattca aaaatttgga gaaagagctt taaaagcatg gtcagtagct 720

cgcctgagcc agaaatttcc caaggctgag tttgtagaag ttaccaagct agtgacagat 780

ctcacaaaag tccacaagga atgctgccat ggtgacctac ttgaatgcgc agatgacagg 840

gcagatcttg ccaagtacat atgtgataat caagatacaa tctccagtaa actgaaggaa 900

tgctgtgata agcctttgtt ggaaaaatcc cactgcattg ctgaggtaga aaaagatgcc 960

atacctgaaa acctgccccc attaactgct gactttgctg aagataagga tgtttgcaaa 1020

aactatcagg aagcaaaaga tgccttcctg ggctcgtttt tgtatgaata ttcaagaagg 1080

catcctgaat atgctgtctc agtgctattg agacttgcca aggaatatga agccacactg 1140

gaggaatgct gtgccaaaga tgatccacat gcatgctatt ccacagtgtt tgacaaactt 1200

aagcatcttg tggatgagcc tcagaattta atcaaacaaa actgtgacca attcgaaaaa 1260

cttggagagt atggattcca aaatgcgctc atagttcgtt acaccaggaa agtaccccaa 1320

gtgtcaactc caactctcgt ggaggtttca agaagcctag gaaaagtggg tactaggtgt 1380

tgtacaaagc cggaatcaga aagaatgccc tgtactgaag actatctgag cttgatcctg 1440

aaccggttgt gcgtgctgca tgagaagaca ccagtgagtg aaaaagtcac caagtgctgc 1500

acagagtcat tggtgaacag acggccatgt ttctctgctc tgacacctga tgaaacatat 1560

gtacccaaag cctttgatga gaaattgttc accttccatg cagatatatg cacacttccc 1620

gatactgaga aacaaatcaa gaaacaaact gcacttgttg agctgttgaa acacaagccc 1680

aaggcaacag aggaacaact gaaaaccgtc atggagaatt ttgtggcttt tgtagacaag 1740

tgctgtgcag ctgatgacaa agaagcctgc tttgctgtgg agggtccaaa acttgttgtt 1800

tcaactcaaa cagccttagc c 1821

<210> 5

<211> 498

<212> DNA

<213> 牛IFN-γ

<400> 5

atgaaatata caagctattt cttagcttta ctgctctgtg ggcttttggg tttttctggt 60

tcttatggcc agggccaatt ttttagagaa atagaaaact taaaggagta ttttaatgca 120

agtagcccag atgtagctaa gggtgggcct ctcttctcag aaattttgaa gaattggaaa 180

gatgaaagtg acaaaaaaat tattcagagc caaattgtct ccttctactt caaactcttt 240

gaaaacctca aagataacca ggtcattcaa aggagcatgg atatcatcaa gcaagacatg 300

tttcagaagt tcttgaatgg cagctctgag aaactggagg acttcaaaaa gctgattcaa 360

attccggtgg atgatctgca gatccagcgc aaagccataa atgaactcat caaagtgatg 420

aatgacctgt caccaaaatc taacctcaga aagcggaaga gaagtcagaa tctctttcga 480

ggccggagag catcaacg 498

<210> 6

<211> 498

<212> DNA

<213> 牛IFN-α

<400> 6

tgccacctgc ctcacaccca cagcctggcc aacaggaggg tcctgatgct cctgggacaa 60

ctgaggaggg tctccccttc ctcctgcctg caggacagaa atgacttcgc attcccccag 120

gaggcgctgg gtggcagcca gttgcagaag gctcaagcca tctctgtgct ccacgaggtg 180

acccagcaca ccttccagct tttcagcaca gagggctcgg ccactacgtg ggatgagagc 240

ctcctggaca agctccgcgc tgcactggat cagcagctca ctgacctgca agcctgtctg 300

aggcaggagg aggagctgca aggagctccc ctgctcaagg aggactccag cctggctgtg 360

aggaaatact tccacagact cactctctat ctgcaagaga agaaacacag cccttgtgcc 420

tgggaggttg tcagagcaca agtcatgaga gccttctctt cctcaacaaa cttgcaggag 480

agtttcagga gaaaggac 498

<210> 7

<211> 1821

<212> DNA

<213> 牛白蛋白

<400> 7

atgaaatggg ttaccttcat ctctctgctg ctgctgttct cttctgctta ctctcgtggt 60

gttttccgtc gtgacaccca caaatctgaa atcgctcacc gtttcaaaga cctgggtgaa 120

gaacacttca aaggtctggt tctgatcgct ttctctcagt acctgcagca gtgcccgttc 180

gacgaacacg ttaaactggt taacgaactg accgaattcg ctaaaacctg cgttgctgac 240

gaatctcacg ctggttgcga aaaatctctg cacaccctgt tcggtgacga actgtgcaaa 300

gttgcttctc tgcgtgaaac ctacggtgac atggctgact gctgcgaaaa acaggaaccg 360

gaacgtaacg aatgcttcct gtctcacaaa gacgactctc cggacctgcc gaaactgaaa 420

ccggacccga acaccctgtg cgacgaattc aaagctgacg aaaaaaaatt ctggggtaaa 480

tacctgtacg aaatcgctcg tcgtcacccg tacttctacg ctccggaact gctgtactac 540

gctaacaaat acaacggtgt tttccaggaa tgctgccagg ctgaagacaa aggtgcttgc 600

ctgctgccga aaatcgaaac catgcgtgaa aaagttctgg cttcttctgc tcgtcagcgt 660

ctgcgttgcg cttctatcca gaaattcggt gaacgtgctc tgaaagcttg gtctgttgct 720

cgtctgtctc agaaattccc gaaagctgaa ttcgttgaag ttaccaaact ggttaccgac 780

ctgaccaaag ttcacaaaga atgctgccac ggtgacctgc tggaatgcgc tgacgaccgt 840

gctgacctgg ctaaatacat ctgcgacaac caggacacca tctcttctaa actgaaagaa 900

tgctgcgaca aaccgctgct ggaaaaatct cactgcatcg ctgaagttga aaaagacgct 960

atcccggaaa acctgccgcc gctgaccgct gacttcgctg aagacaaaga cgtttgcaaa 1020

aactaccagg aagctaaaga cgcttttctc ggtagcttcc tgtacgaata ctctcgtcgt 1080

cacccggaat acgctgtttc tgttctgctg cgtctggcta aagaatacga agctaccctg 1140

gaagaatgct gcgctaaaga cgacccgcac gcttgctact ctaccgtttt cgacaaactg 1200

aaacacctgg ttgacgaacc gcagaacctg atcaaacaga actgcgacca gttcgaaaaa 1260

ctgggtgaat acggtttcca gaacgctctg atcgttcgtt acacccgtaa agttccgcag 1320

gtttctaccc cgaccctggt tgaagtttct cgttctctgg gtaaagttgg tacccgttgc 1380

tgcaccaaac cggaatctga acgtatgccg tgcaccgaag actacctgtc tctgatcctg 1440

aaccgtctgt gcgttctgca cgaaaaaacc ccggtttctg aaaaagttac caaatgctgc 1500

accgaatctc tggttaaccg tcgtccgtgc ttctctgctc tgaccccgga cgaaacctac 1560

gttccgaaag ctttcgacga aaaactgttc accttccacg ctgacatctg caccctgccg 1620

gacaccgaaa aacagatcaa aaaacagacc gctctggttg aactgctgaa acacaaaccg 1680

aaagctaccg aagaacagct gaaaaccgtt atggaaaact tcgttgcttt cgttgacaaa 1740

tgctgcgctg ctgacgacaa agaagcttgc ttcgctgttg aaggtccgaa actggttgtt 1800

tctacccaga ccgctctggc t 1821

<210> 8

<211> 498

<212> DNA

<213> 牛IFN-γ

<400> 8

atgaaataca cctcttactt cctggctctg ctgctgtgcg gtctgctggg tttctctggt 60

tcttacggtc agggtcagtt cttccgtgaa atcgaaaacc tgaaagaata cttcaacgct 120

tcttctccgg acgttgctaa aggtggtccg ctgttctctg aaatcctgaa aaactggaaa 180

gacgaatctg acaaaaaaat catccagtct cagatcgttt ctttctactt caaactgttc 240

gaaaacctga aagacaacca ggttatccag cgttctatgg acatcatcaa acaggacatg 300

ttccagaaat tcctgaacgg ttcttctgaa aaactggaag acttcaaaaa actgatccag 360

atcccggttg acgacctgca gatccagcgt aaagctatca acgaactgat caaagttatg 420

aacgacctgt ctccgaaatc taacctgcgt aaacgtaaac gttctcagaa cctgttccgt 480

ggtcgtcgtg cttctacc 498

<210> 9

<211> 498

<212> DNA

<213> 牛IFN-α

<400> 9

tgccacctgc cgcacaccca ctctctggct aaccgtcgtg ttctgatgct gctgggtcag 60

ttacgtcgtg taagcccgtc ttcttgcctg caggaccgta acgacttcgc tttcccgcag 120

gaagctctgg gtggttctca gctgcagaaa gctcaggcta tctctgttct gcacgaagtt 180

acccagcaca ccttccagct gttctctacc gaaggttctg ctaccacctg ggacgaatct 240

ctgctggaca aactgcgtgc tgctctggac cagcagctga ccgacctgca ggcttgcctg 300

cgtcaggaag aagaactgca gggtgctccg ctgctgaaag aagactcttc tctggctgtt 360

cgtaaatact tccaccgtct gaccctgtac ctgcaggaaa aaaaacactc tccgtgcgct 420

tgggaagttg ttcgtgctca ggttatgcgt gctttctctt cttctaccaa cctgcaggaa 480

tctttccgtc gtaaagac 498

Claims

1.一种由牛白蛋白、牛干扰素γ和牛干扰素α组成的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示。

2.一种编码如权利要求1所述的融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示，记为基因组1；或如SEQUENCE LISTING 400〈3〉所示，记为基因组2。

3.含有如权利要求2所述基因的表达载体。

4.含有如权利要求2所述基因的基因工程菌。

5.一种重组牛长效干扰素，其特征在于，所述重组牛长效干扰素由权利要求1所述的融合蛋白与冻干保护剂混配之后，经冷冻干燥而成。

6.根据权利要求1所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将权利要求3所述的表达载体导入到大肠杆菌宿主细胞中，获得基因工程菌，基因工程菌经IPTG诱导表达后得到所述融合蛋白的粗品，经纯化后即可得到融合蛋白。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述基因工程菌为pET-32a/rAlb-IFNγ-IFNα，其制备方法为：

(2)将连接后的目的基因连接到pET-32a质粒上获得表达载体；

(3)将表达载体导入到大肠杆菌宿主细胞中，即可得到基因工程菌pET-32a/rAlb–IFNγ-IFNα。

8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌宿主细胞为BL21(DE3)感受态细胞或带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞。

9.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述纯化的方法为：融合蛋白的粗品先后经亲和层析、阴离子交换层析和分子筛层析纯化。

10.根据权利要求5所述的重组牛长效干扰素的应用，其特征在于，所述重组牛长效干扰素的半衰期长达72小时以上，具有广谱抗病毒作用并能提高牛自身的免疫应答。