CN105349549A - 一种牛α-干扰素基因及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种牛α-干扰素基因及其制备方法和应用，其序列如SEQ？ID？NO:1所示。制备方法包括：在BoIFN-α成熟蛋白编码基因3’端添加终止密码子TGA，分别在两端设计Nde？I/Hind？III酶切位点，即得。应用包括：将基因克隆到表达载体pCold？II中，转化大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，获得可溶性目的蛋白。本发明为牛α-干扰素的规模化生产和应用奠定了基础。

Description

一种牛α-干扰素基因及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于干扰素领域，特别涉及一种牛α-干扰素基因及其制备方法和应用。

背景技术

干扰素是一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等功能的细胞因子，能通过多种机制抑制病毒生长，促进免疫细胞活性。α-干扰素(IFN-α)属于I型干扰素，是由白细胞分泌的一类具有抗病毒和免疫调节功能的细胞因子。IFN-α与靶细胞的表面受体结合后可以激活靶细胞内潜在抗病毒基因的表达，产生具有酶活性的抗病毒蛋白(Anti-virualProtein，AVP)，使细胞具备抗病毒的能力，降低病毒在细胞内的增殖速度，同时减少细胞感染的损伤。随着奶牛集约化养殖程度不断提高，奶牛病毒性疾病的感染率也在逐年上升。研究表明，牛α干扰素(BoIFN-α)可以抑制多种牛类病毒的增殖，包括牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、口蹄疫病毒(FMDV)、牛传染性腹泻病毒(BVDV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)等。然而由于生产工艺和成本等问题，牛干扰素的研制还停留在实验室阶段，并未在临床上大量使用。大肠杆菌表达系统具有操作简单和成本低廉两个显著特征，是应用最广泛的表达系统之一，而国内目前利用大肠杆菌表达系统获得的BoIFN-α绝大多数完全以包涵体的形式存在，需要经过繁琐的变性复性过程，才能获得少量有活性的重组蛋白。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种牛α-干扰素基因及其制备方法和应用，在IPTG浓度为0.64mmol/L，诱导温度为15℃，诱导时间为9h的条件下，可溶性目的蛋白的表达量最高，为36mg/L菌液，为牛α-干扰素的规模化生产和应用奠定了基础。

本发明的一种牛α-干扰素基因，其序列如SEQIDNO:1所示。

本发明的一种牛α-干扰素基因的重组质粒，所述重组质粒为rBoIFN-α-pColdII。

本发明的一种牛α-干扰素基因的重组菌株，所述重组菌株为rBoIFN-α-pColdII/BL21。

本发明的一种牛α-干扰素基因的制备方法，包括：

在BoIFN-α成熟蛋白编码基因3’端添加终止密码子TGA，分别在两端设计NdeI/HindIII酶切位点，即得。

本发明的一种牛α-干扰素基因的应用，具体步骤如下：

(1)将基因通过NdeI/HindIII双酶切克隆至表达载体pColdII，转化大肠杆菌BL21(DE3)后挑取单菌落进行培养，提取质粒，用NdeI/HindIII双酶切鉴定；

(2)挑取单个阳性重组菌落，置于含有氨苄的LB培养液中振荡培养过夜；将培养菌液按1：250比例接种于上述LB培养液中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.4～0.6，加入IPTG至终浓度为0.01～0.64mmol/L，5～35℃诱导1～21h后，收集菌体沉淀，加入裂解缓冲液，充分悬浮混匀；置冰浴中超声裂解，裂解产物离心，收集上清，沉淀用裂解缓冲液充分悬浮，即得可溶性目的蛋白。

所述氨苄的浓度为0.1mg/mL。

所述超声裂解的具体条件为：超声功率400w，工作5s、间隔5s，共计10min。

有益效果

本发明采用冷表达体系在大肠杆菌系统中表达出有活性的牛α-干扰素蛋白，具有以下有益效果：

(1)本发明人工设计合成的牛α-干扰素基因选用大肠杆菌偏爱密码子，有利于密码子在大肠杆菌中的识别和表达，从而可达到高效表达的目的；

(2)本发明的表达系统有利于重组蛋白的正确折叠，促进了牛α-干扰素以可溶性形式表达，该蛋白在非变性条件下经一步纯化即可获得高纯度产品，工序少，生产效率高；

(3)本发明获得的可溶性表达的牛α-干扰素表达量高，能达到36mg/L,为后续规模化生产打下了良好的基础；

(4)上述牛α-干扰素蛋白实现良好的抗病毒活性，在MDBK细胞上的抗水泡性口炎病毒(VSV)的活性可达1.0×10⁶U/mg，具有良好的产业应用前景。

附图说明

图1为重组表达载体BoIFN-α-pColdII的双酶切鉴定；其中，M为DNA标准；1为NdeI和HindIII双酶切质粒BoIFN-α-pColdII；2为未酶切对照质粒BoIFN-α-pColdII；

图2为rBoIFN-α表达后的纯化；其中，M为：蛋白质标准；1为过柱前上清；2为过柱后上清；3为洗脱液。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(1)BoIFN-α基因的优化与合成

为提高BoIFN-α在大肠杆菌中的表达水平，首先根据牛α干扰素成熟蛋白的基因序列(登录号：EU276064)，采用大肠杆菌偏爱的密码子设计编码BoIFN-α成熟蛋白基因的核苷酸序列。BoIFN-α成熟蛋白编码基因全长498bp，3’端添加终止密码子TGA，分别在两端设计NdeI/HindIII酶切位点，根据设计合成BoIFN-α基因，序列如SEQIDNO:1所示。

(2)BoIFN-α基因的克隆与鉴定

将合成好的基因通过双酶切(NdeI/HindIII)克隆至表达载体pColdII，转化大肠杆菌BL21(DE3)后挑取单菌落进行培养，提取质粒，用NdeI/HindIII双酶切鉴定(图1)。酶切后，重组质粒出现2条带，其中1条带大小约为500bp，与BoIFN-α基因的长度相符，表明目的基因已经克隆进入重组表达载体中。阳性重组质粒命名为rBoIFN-α-pColdII，阳性重组菌株命名为rBoIFN-α-pColdII/BL21。

(3)表达产物鉴定及诱导表达条件优化

①转化菌的诱导表达及表达产物的鉴定

挑取单个阳性重组菌落，置于4mL含有0.1mg/mL氨苄的LB培养液中37℃振荡培养过夜。将培养菌液按1：250比例接种于25ml上述培养液中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.4～0.6(培养约3h)，加入IPTG至终浓度为0.03mmol/L，20℃诱导10h后8000r/min离心5min，收集菌体沉淀，加入4mL裂解缓冲液，充分悬浮混匀。置冰浴超声裂解(超声功率为400w，工作5s、间隔5s，共计10min)，裂解产物12000r/min离心15min，收集上清，沉淀用4mL裂解缓冲液充分悬浮，取样进行12％SDS-PAGE分析。结果诱导上清和沉淀均在约19ku处出现目的蛋白条带，说明目的蛋白在大肠杆菌中得到成功表达。

②不同浓度IPTG对rBoIFN-α表达的影响

设置8个IPTG浓度(0、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32和0.64mmol/L)，以15℃诱导表达8h，按照①的方法对获得菌液进行处理，最后进行12％SDS-PAGE分析。结果表明，随着IPTG浓度的增加，上清与沉淀中的目的蛋白含量明显增加，经BandScan软件分析可知在IPTG浓度达到0.64mmol/L时，目的蛋白含量占上清蛋白总含量的比例最高，达到38.7％。

③不同诱导温度对rBoIFN-α表达的影响

设置4个温度梯度(5、15、25和35℃)，以②中最佳IPTG浓度进行诱导表达8h。经BandScan软件分析可知在15℃条件下，目的蛋白含量占上清蛋白总含量的比例最高，达到53.2％。

④不同诱导时间对BoIFN-α表达的影响

设置8个诱导时间，以②中最佳IPTG浓度和③中最佳诱导温度进行表达，结果上清中目的蛋白占总蛋白含量在1、3、6、9、12、15、18、21h分别为38.3％、39.5％、48.9％、49.7％、43.9％、41.9％，43.7％，40.6％，目的蛋白在诱导9h时表达量最高。

(4)表达蛋白的纯化及定量

按照优化条件和方法诱导表达250mL菌液，将离心菌体用8ml裂解缓冲液充分悬浮后超声破碎离心，取上清。按照Novagen公司的His-BindPurificationkit说明书对获得菌体上清液进行亲和层析纯化，收集洗脱蛋白样本进行12％SDS-PAGE分析，过柱前目标蛋白条带明显，过柱后目标位置没有条带出现，说明rBoIFN-α已经与树脂结合。洗脱后的蛋白液在目标位置出现明显条带，经BandScan软件分析，蛋白纯度达到99.2％(图2)。根据测得的纯化后的蛋白浓度计算，250ml菌液总量可纯化获得9mg左右的rBoIFN-α，即最佳诱导条件下可溶性重组蛋白的表达量约为36mg/L菌液。

(5)重组rBoIFN-α抗病毒活性的测定

采用微量细胞病变抑制法测定重组BoIFN-α的抗病毒活性，应用MDBK/VSV测定系统测定。在接种VSV18h后，未经rBoIFN-α处理的MDBK细胞均出现CPE，而空白对照的细胞均没有出现CPE。试验测得rBoIFN-α的抗病毒活性为1×10⁶U/mg。

Claims (9)

1.一种牛α-干扰素基因，其特征在于：其序列如SEQIDNO:1所示。

2.一种含如权利要求1所述的牛α-干扰素基因的重组质粒。

3.根据权利要求2所述的一种牛α-干扰素基因的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒为rBoIFN-α-pColdII。

4.一种含如权利要求1所述的牛α-干扰素基因的重组菌株。

5.根据权利要求4所述的一种牛α-干扰素基因的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株为rBoIFN-α-pColdII/BL21。

6.一种牛α-干扰素基因的制备方法，包括：

在BoIFN-α成熟蛋白编码基因3’端添加终止密码子TGA，分别在两端设计NdeI/HindIII酶切位点，即得。

7.一种含如权利要求1所述的牛α-干扰素基因的应用，其特征在于：具体步骤如下：

(1)将基因通过NdeI/HindIII双酶切克隆至表达载体pColdII，转化大肠杆菌BL21(DE3)后挑取单菌落进行培养，提取质粒，用NdeI/HindIII双酶切鉴定；

(2)挑取单个阳性重组菌落，置于含有氨苄的LB培养液中振荡培养过夜；将培养菌液按1：250比例接种于上述LB培养液中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.4～0.6，加入IPTG至终浓度为0.01～0.64mmol/L，5～35℃诱导1～21h后，收集菌体沉淀，加入裂解缓冲液，充分悬浮混匀；置冰浴中超声裂解，裂解产物离心，收集上清，沉淀用裂解缓冲液充分悬浮，即得可溶性目的蛋白。

8.根据权利要求7所述的一种牛α-干扰素基因的应用，其特征在于：所述氨苄的浓度为0.1mg/mL。

9.根据权利要求7所述的一种牛α-干扰素基因的应用，其特征在于：所述超声裂解的具体条件为：超声功率400w，工作5s、间隔5s，共计10min。