CN103275918B - 高产dl-丙氨酸的生产菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高产DL-丙氨酸的生产菌株及其应用，具体地，本发明提供了一种产生D-丙氨酸消旋酶的工程菌株，所述菌株为大肠杆菌并且携带表达枯草杆菌D-丙氨酸消旋酶的表达载体。本发明的表达菌株可以高效、低成本地用于DL-丙氨酸的生产，具有较高的应用价值。

Description

高产DL-丙氨酸的生产菌株及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体地说，本发明涉及一种枯草芽孢杆菌来源的D-丙氨酸消旋酶表达菌种。

背景技术

DL-丙氨酸，化学名为DL-α-氨基丙酸（简称丙氨酸），分子式为CH3CH(NH2)COOH，分子量89.09，无色至白色无臭针状结晶或结晶性粉末，有甜味，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚和丙酮，无旋光性。DL-丙氨酸主要用做食品添加剂，同时也是重要的医药中间体。在国外已广泛应用于食品工业，年需求量很大，且增长迅速，其主要生产国为日本，主要生产企业有武藏野化学株式会社和味之素。

现有的DL-丙氨酸生产工艺主要有化学合成法、生物发酵法和丙氨酸消旋酶法三种。化学合成法主要包括：Strecker法、Buchere法、α-卤代羧酸氨化法、相转移催化合成法和L-丙氨酸化学消旋法等。Strecker和Buchere法原料价格便宜，但中间产物水解后分离比较困难，氰化物的运输和管理比较困难；相转移催化合成法原料便宜易得，但操作周期长，原料用量大，生产过程安全性不高，反应需要低温冷冻，提取使用离子交换树脂处理效率低，废水排放较大。

α-卤代羧酸氨化法原料易得，对设备要求不高，但该法生成大量副产物氯化铵，分离要采用大量甲醇醇析而导致精制成本较高，有机溶剂挥发严重污染环境，易燃易爆，生产安全性不高，催化剂用量大，生产成本相对较高。

L-丙氨酸化学消旋法原料价格较高，反应过程对设备的腐蚀较大。但该工艺提取过程简单，收率83%。

随着90年代假单胞菌L-天冬氨酸-β-脱羧酶生产L-丙氨酸技术的运用推广，L-丙氨酸的价格持续下降，这使得化学消旋法生产DL-丙氨酸成为可能。

生物发酵法虽然具有生产条件温和，对环境友好的优点，但根据目前已报道的发酵水平来看，糖酸转化率较低，发酵液的组成比较复杂，提取成本较高。该法的生产成本远高于化学合成法。

丙氨酸消旋酶法生产工艺是以L-丙氨酸为原料、消旋酶为催化剂的一步生化反应。其设备简单，反应条件温和，酶活力高，反应速度快，提取工艺简单。该法收率很高，一般为95%左右。在目前L-丙氨酸的价格下，丙氨酸消旋酶法生产工艺具有很明显的成本优势，是一条绿色经济的生产路线，其必然成为DL-丙氨酸生产工艺的发展方向。然而，目前本领域尚缺乏能够高效地生产丙氨酸消旋酶的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效表达D-丙氨酸消旋酶的基因工程菌。

本发明的第一方面，提供了一种产生D-丙氨酸消旋酶的工程菌株，所述菌株为大肠杆菌并且携带表达枯草杆菌D-丙氨酸消旋酶的表达载体。

在另一优选例中，所述菌株的保藏号为CCTCC M2013188。

本发明的第二方面，提供了一种如本发明第一方面所述的表达菌株的制备方法，所述的方法包括步骤：

(a)提供一表达载体，所述表达载体携带枯草杆菌D-丙氨酸消旋酶的表达盒；

(b)将所述表达载体转入大肠杆菌，从而获得本发明第一方面所述的产生D-丙氨酸消旋酶的工程菌株。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤:

(c)对步骤(b)所述菌株进行紫外诱变，得到D-丙氨酸消旋酶产量进一步提高的工程菌株。

在另一优选例中，所述枯草杆菌D-丙氨酸消旋酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.:4所示。

在另一优选例中，所述枯草杆菌D-丙氨酸消旋酶的编码序列如SEQ ID NO:3所示。

在另一优选例中，所述的步骤(a)中所述的表达载体是用以下方法制备的：

(i)用如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所述的引物，以枯草杆菌基因组DNA为模板，进行核酸扩增，得到扩增产物；

(ii)用Ndel和BamHI对扩增产物进行酶切，得到酶切产物；和

(iii)将所述酶切产物与用Ndel和BamHI进行酶切的载体质粒用DNA连接酶进行连接，从而形成所述的表达载体。

在另一优选例中，在步骤(ii)中，所述的酶切时间为1-12小时，较佳地为2-10小时。

在另一优选例中，在步骤(ii)中，所述Ndel与酶切体系的体积比为0.5～5:50，较佳地为1～3:50。

在另一优选例中，在步骤(c)中，紫外诱变的时间为1～10min，较佳地为3～5min。

本发明的第三方面，提供了一种如本发明第一方面所述的表达菌株的用途，所述表达菌株用于生产DL-丙氨酸。

本发明的第四方面，提供了一种DL-丙氨酸的制备方法，所述的方法包括步骤：

用如本发明第一方面所述的菌株转化原料L-丙氨酸，得到DL-丙氨酸；

或者所述方法包括：用如本发明第一方面所述的菌株的发酵液转化原料L-丙氨酸，得到DL-丙氨酸。

在另一优选例中，所述方法包括：在L-丙氨酸存在下，培养如本发明第一方面所述的菌株。

在另一优选例中，所述L-丙氨酸的转化率为≥95%，较佳地为≥98%，更佳地为≥99%。

在另一优选例中，所述菌株的用量为0.5～5g/l，较佳地为1～3g/l。

在另一优选例中，所述菌株与所述L-丙氨酸的重量比为1:100～300，较佳地为1：150～200。

在另一优选例中，所述的发酵液是含菌体的发酵液。

在另一优选例中，所述发酵液的D-丙氨酸消旋酶酶活为≥5000U/g，较佳地为≥6000U/g，更佳地为≥7000U/g。

在另一优选例中，所述发酵液是通过包括以下步骤的方法制备：

将所述菌株接种至培养基进行培养，形成种子；

将所述种子接种入发酵罐，形成一发酵体系；

对所述发酵体系进行培养，得到发酵后的菌株。

在另一优选例中，在将所述菌株接种至所述培养基时，同时加入卡那霉素。

在另一优选例中，所述种子的OD值为3～5。

在另一优选例中，所述种子占所述发酵体系的浓度比为5%(v/v)。

在另一优选例中，在所述发酵过程中，对所述发酵罐进行通气。

在另一优选例中，所述的通气量为0.5～2v/v.m。

在另一优选例中，在所述发酵过程中，对所述发酵体系进行搅拌。

在另一优选例中，在发酵开始时，调节所述发酵体系的pH=5～9，较佳地，pH=6～8。

在另一优选例中，所述方法还包括：在发酵过程中，加入乳糖进行诱导。

在另一优选例中，所加入乳糖的浓度为0.1～5%(w/v)，较佳地为0.5～2%(w/v)，以所述发酵体系的总体积计。

在另一优选例中，所述转化的时间为0.05～10h。

在另一优选例中，所述转化的时间为0.1～5h。

在另一优选例中，所述方法还包括：在转化过程中，每隔一定时间对反应体系进行取样，测定转化率。

在另一优选例中，所述的转化率测定方法包括：对所述反应体系进行取样并测定样品旋光度。

在另一优选例中，所述测定旋光度的方法包括：将样品加热沸腾并冷却离心，取上清液测定旋光度。

在另一优选例中，所述方法还包括：对转化完毕后的DL-丙氨酸进行后处理。

在另一优选例中，所述的后处理包括脱色和/或重结晶。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为本发明实施例1中制得的质粒的质粒图谱；

图2为本发明实施例2中制得的质粒的质粒图谱；

图3为本发明实施例3中制得的质粒的质粒图谱；

图4为本发明实施例4中的SDS-PAGE图，图中各泳道的意义如下：

1-3：BL21(DE3)/pET24a-dal诱变株沉淀液、上清液、全细胞；

4-6：BL21(DE3)/pET24a-alr沉淀液、上清液、全细胞；

7-9：BL21(DE3)/pET24a-BacALR沉淀液、上清液、全细胞；

M-蛋白Marker（KDa）。

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，意外地发现，用枯草芽孢杆菌来源的D-丙氨酸消旋酶基因序列构建产生D-丙氨酸消旋酶的工程菌株，具有很高的酶活。所述的工程菌株用于丙氨酸消旋酶法生产DL-丙氨酸工艺，可以高效、低成本地大规模生产DL-丙氨酸。基于上述发现，发明人完成了本发明

生产D-丙氨酸消旋酶的工程菌株及其制备

如本文所用，术语“工程菌株”指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系。特别地，在本发明中，“本发明的工程菌株”指本发明提供的生产D-丙氨酸消旋酶的工程菌株。

本发明提供了一种产生D-丙氨酸消旋酶的工程菌株，所述的菌株为大肠杆菌并且携带表达枯草杆菌D-丙氨酸消旋酶的表达载体。在本发明的一个优选例中，所述菌株是保藏号为CCTCC M2013188的工程菌株。

在另一优选例中，所述的菌株可以通过包括以下步骤的方法进行制备：

(a)提供一表达载体，所述表达载体携带枯草杆菌D-丙氨酸消旋酶的表达盒；

(b)将所述表达载体转入大肠杆菌，从而获得本发明的产生D-丙氨酸消旋酶的工程菌株。

在另一优选例中，所述方法还可以包括步骤：

(c)对步骤(b)所述菌株进行紫外诱变，得到D-丙氨酸消旋酶产量进一步提高的工程菌株。

在另一优选例中，所述枯草杆菌D-丙氨酸消旋酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.:4所示。

在另一优选例中，所述枯草杆菌D-丙氨酸消旋酶的编码序列如SEQ ID NO:3所示。

在另一优选例中，所述的步骤(a)中所述的表达载体是用以下方法制备的：

(i)用如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所述的引物，以枯草杆菌基因组DNA为模板，进行核酸扩增，得到扩增产物；

(ii)用Ndel和BamHI对扩增产物进行酶切，得到酶切产物；和

(iii)将所述酶切产物与用Ndel和BamHI进行酶切的载体质粒用DNA连接酶进行连接，从而形成所述的表达载体。

在另一优选例中，在步骤(ii)中，所述的酶切时间为1-12小时，较佳地为2-10小时。

在另一优选例中，在步骤(ii)中，所述Ndel与酶切体系的体积比为0.5～5:50，较佳地为1～3:50。

在另一优选例中，在步骤(c)中，紫外诱变的时间为1～10min，较佳地为3～5min。

所述工程菌株具有很高的表达和酶活，一般可≥3000U/g，更佳地可≥4000U/g。在另一优选例中，所述工程菌株的酶活可≥7000U/g。

DL-丙氨酸消旋酶的生产

本发明所提供的表达菌株可以高效地应用于DL-丙氨酸的生产。在本发明的一个优选例中，所述DL-丙氨酸的制备方法包括步骤：

用本发明提供的菌株转化原料L-丙氨酸，得到DL-丙氨酸；

或者所述方法包括：用如本发明提供的菌株的发酵液转化原料L-丙氨酸，得到DL-丙氨酸。其中，所述的发酵液是含菌体的发酵液。

在另一优选例中，所述方法包括：在L-丙氨酸存在下，培养本发明所述的菌株。

在另一优选例中，所述L-丙氨酸的转化率为≥95%，较佳地为≥98%，更佳地为≥99%。

在另一优选例中，所述菌株的用量为0.5～5g/l，较佳地为1～3g/l。

在另一优选例中，所述菌株与所述L-丙氨酸的重量比为1:100～300，较佳地为1：150～200。

在另一优选例中，所述发酵液的D-丙氨酸消旋酶的酶活为≥5000U/g，较佳地为≥6000U/g，更佳地为≥7000U/g。

在另一优选例中，所述发酵液是通过包括以下步骤的方法制备：

将所述菌株接种至培养基进行培养，形成种子；

将所述种子接种入发酵罐，形成一发酵体系；

对所述发酵体系进行培养，得到发酵后的菌株。

较佳地，在将所述菌株接种至所述培养基时，可同时加入卡那霉素。

较佳地，所述种子的OD值为3～5。

在另一优选例中，所述种子占所述发酵体系的浓度比为5%。

在另一优选例中，在所述发酵过程中，对所述发酵罐进行通气。

在另一优选例中，所述的通气量为0.5～2v/v.m。

在另一优选例中，在所述发酵过程中，对所述发酵体系进行搅拌。

在另一优选例中，在发酵开始时，调节所述发酵体系的pH=5～9，较佳地，pH=6～8。

在另一优选例中，所述方法还包括：在发酵过程中，加入乳糖进行诱导。

在另一优选例中，所加入乳糖的浓度为0.1～5%(w/v)，较佳地为0.5～2%(w/v)，以所述发酵体系的总体积计。

所述转化过程的时间不限，可以为0.05～10h。在另一优选例中，所述转化的时间为0.1～5h。

在转化过程中可以任选地对反应体系进行监控，如每隔一定时间对反应体系进行取样，测定转化率。在另一优选例中，所述的转化率测定方法包括：对所述反应体系进行取样并测定样品旋光度。

在另一优选例中，所述测定旋光度的方法包括：将样品加热沸腾并冷却离心，取上清液测定旋光度。

转化完毕后得到的DL-丙氨酸可以任选地进行常规的后处理，在另一优选例中，所述的后处理包括脱色和/或重结晶。

本发明的主要优点

1、本发明通过基因工程构建，得到了具有很高丙氨酸消旋酶酶活的大肠杆菌菌种。

2、本发明的菌种可以用于DL-丙氨酸的生产，用非常少量的该菌种发酵菌体，可快速地将L-丙氨酸转化为DL-丙氨酸，生产成本低，条件温和且转化率高，纯化方便，具有巨大的经济效益。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

主要试剂

限制性内切酶（fermentas），T4DNA连接酶，蛋白质分子量标准、4X样品缓冲液（TAKARA），KOD plus DNA聚合酶（TOYOBO），质粒抽提试剂盒和小量胶回收试剂盒（Axygen），细菌基因组DNA抽提试剂盒（上海生工）。

引物合成和测序、全基因合成全部委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

实施例1枯草芽孢杆菌来源D-丙氨酸消旋酶表达菌种的构建

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168接种于LB液体培养基中，30℃220rpm培养24小时。总DNA的提取参照基因组提取试剂盒说明书。

根据已报道的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168来源的D-丙氨酸消旋酶基因dal的基因序列（NCBI登录号：AL009126.3），合成正义引物和反义引物。引物的核苷酸序列分别记录于SEQ ID NO:1（dal-NdeI-F）和SEQ ID NO:2（dal-BamHI-R）。

SEQ ID NO:1dal-NdeI-F

GGAATTCCATATGAGCACAAAACCTTTTTAC

SEQ ID NO:2dal-BamHI-R

CGGGATCCTTAATTGCTTATATTTACCT

对反应溶液进行PCR扩增，50μL反应溶液中含有上述一对引物，其中，每一个引物为50pmol，0.2mM dNTP，100ng总DNA模板，25mM MgSO4，1X KODneo plus buffer，KOD neo plus2U(TOYOBO)。PCR的条件如下：94℃预变性2分钟，后按如下参数循环30次：98℃变性10秒，55℃退火30秒，68℃延伸45秒，最后一个循环68℃延伸10分钟。

PCR反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳进行分析，检测到一条大约1.2kb的特异条带。用胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，用NdeI和BamHI于37℃水浴中双酶切3-6小时，50μL酶切体系包括：dal片段37μL，10X Tango Buffer10μL，NdeI1.5μL，BamHI1.5μL。纯化回收酶切产物，与同样酶切处理的载体质粒pET24a用T4DNA连接酶于16℃连接过夜，用氯化钙法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含Kan的LB平板，37℃培养过夜。从转化平板上挑单克隆接种于LB试管培养，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，用NdeI和BamHI于37℃双酶切验证，若能切出1.2kb片段，(SEQ ID NO:3)则得到正确的重组质粒pET24a-dal（质粒图谱如图1所示）。

将重组质粒pET24a-dal用氯化钙法转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)感受态细胞进行表达。

实施例2恶臭假单胞菌Pseudomonas putida KT2440来源丙氨酸消旋酶表达菌种的构建

全基因合成恶臭假单胞菌Pseudomonas putida KT2440来源丙氨酸消旋酶基因alr（NCBI登录号：NC_002947），获得重组质粒pUC57-alr。

将pUC57-alr用NdeI和BamHI在37℃双酶切3-6小时，酶切体系为：pUC57-alr38μL，10X Buffer Tango10μL，NdeI1μL，BamHI1μL，核酸电泳并用胶回收试剂盒回收1.2kb alr片段。

回收获得的alr片段与同样酶切处理的表达载体pET24a用T4DNA连接酶于16℃连接过夜，用氯化钙法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含Kan的LB平板，37℃培养过夜。挑单克隆接种于LB试管培养，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，用NdeI和BamHI于37℃双酶切验证，若能切出1.2kb片段(SEQ IDNO:5)则为正确，得到pET24a-alr(质粒图谱如图2所示)，转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)感受态细胞进行表达，表达得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

实施例3嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillus stearothermophilus来源丙氨酸消旋酶表达菌种的构建

全基因合成嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillus stearothermophilus来源丙氨酸消旋酶BacALR（NCBI登录号：M19142），获得重组质粒pUC57-BacALR。

将pUC57-BacALR用NdeI和BamHI在37℃双酶切3-6小时，酶切体系为：pUC57-BacALR38μL，10X Buffer Tango10μL，NdeI1μL，BamHI1μL，核酸电泳并用胶回收试剂盒回收1.2kb BacALR片段。

回收获得的BacALR片段与同样酶切处理的表达载体pET24a用T4DNA连接酶于16℃连接过夜，用氯化钙法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含Kan的LB平板，37℃培养过夜。挑单克隆接种于LB试管培养，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，用NdeI和BamHI于37℃双酶切验证，若能切出1.2kb片段(SEQID NO:7)则为正确，得到pET24a-BacALR(质粒图谱如图3所示)，转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)感受态细胞进行表达，表达得到的氨基酸序列如SEQ IDNO:8所示。

实施例4不同来源丙氨酸消旋酶的酶活和表达情况分析

摇瓶发酵：TB培养基（蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油5g/L，KH2PO42.13g/L，K2HPO4·3H2O16.43g/L，pH7.0-7.5）；121℃高温高压灭菌20分钟。摇瓶培养条件：将构建好的菌种分别接种到含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃220rpm培养过夜后，按1%接种量接种到新鲜TB培养基中（含100μg/mL卡那霉素），37℃220rpm培养至OD600=5-6，加入终浓度为0.2mM IPTG，28℃诱导过夜。

发酵酶活比较：按照上述条件进行对表达不同来源丙氨酸消旋酶的重组大肠杆菌进行发酵，每个来源的菌种测试3个平行，发酵后10000rpm，离心取菌体测定酶活。酶活测定方法：取1g菌体溶于100ml0.1M PBS缓冲液（PH8.0）中，搅拌混匀，然后取0.1ml菌悬液加入到1.9ml0.2M L-丙氨酸溶液中（先于水浴中预热5min），37℃水浴摇床180rpm振荡反应10min，加2ml10%HCL溶液终止，HPLC测定D-丙氨酸含量，根据D-丙氨酸含量（S）计算酶活UU=S*40*1000/(89*10*0.01)。

测定结果如下：

蛋白表达情况分析：

取诱导后的菌液超声破胞，分别设置全细胞液（破胞液）、上清液（离心后取上清）、沉淀液（离心后弃上清，加入等体积水重悬沉淀）三份样品，将电泳样品与4X样品缓冲液混合煮沸5分钟，离心后取上清10μL进行SDS-PAGE分析。采用5%浓缩胶和12%分离胶，电泳结束后凝胶用考马斯亮蓝R250染色。结果见图4，从结果来看，只有Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168来源的丙氨酸消旋酶在大肠杆菌中能够高可溶性表达。

实施例5枯草芽孢杆菌来源D-丙氨酸消旋酶表达菌种的紫外诱变育种

以实施例1构建的菌株为出发菌株，活化后接种入装有50mL LB培养基的250mL三角摇瓶中，37℃振荡培养至对数生长期（约6小时），3000rpm离心15分钟，弃上清液，菌体用生理盐水洗涤2次后，制成菌数为10⁸个/mL的单细胞菌悬液。

取5mL菌悬液放于直径9cm的培养皿内，紫外灯预热30分钟，将培养皿置于磁力搅拌器上并使培养皿与15W紫外灯的垂直距离保持为30cm；开启磁力搅拌器，分别照射0、1、2、3、4、5分钟，分别取对照组和不同处理时间的菌液0.5mL进行适当稀释（10^-4,10^-5,10^-6），将这3个稀释浓度倾注于LB固体培养基平板上（每个稀释度做3个重复），37℃避光培养20小时，进行平板活菌计数，用于计算紫外诱变致死率。

致死率（%）=（未经处理的活菌数-经处理的活菌数）/未经处理的活菌数X100%

根据实验结果，选择诱变时间为4分钟，此时致死率为98%左右。选取诱变时间4分钟培养平板上生长良好的菌落，接种于装有50mL TB培养基的250mL三角摇瓶中，接种前在TB培养基中加入100μg/mL卡那霉素，于37℃200rpm摇床培养至OD₆₀₀=5-6，加入0.2mM IPTG于28℃诱导24小时左右，离心后收集菌体用于测定丙氨酸消旋酶活性，总共进行了1213株的初筛，和117株复筛，最后获得活性比出发菌株提高近1倍的诱变株CIBT1.0822（中国典型培养物保藏中心，CCTCC M2013188）。

实施例6突变菌种用于工业生产DL-丙氨酸

菌种的发酵

采用TB培养基作为种子培养基，接种时加入100mg/L的卡那霉素，发酵培养（5L罐）：玉米浆：45g/L，酵母膏：5g/L，葡萄糖：5g/l，NaCl：3g/l，K2HPO4·3H2O：20g/L，用饱和氢氧化钠溶液调PH7.4左右。灭菌：121℃40min。培养条件：种子培养6至8h，OD在5左右时按5%接种量接入发酵罐。发酵罐通气量1.4v/v.m，初始搅拌400rpm，2h后800rpm发酵至pH上升时，加入终浓度1%的乳糖进行诱导，并补加终浓度5g/L的甘油，温度降低至25℃，继续发酵至20h放罐。发酵结果如下

批号	发酵时间	OD	湿重	酶活
					0906-1	17.5h	29.2	270g	7083.15u/g
0906-2	17.5h	26.8	260g	8521.35u/g
					0906-3	17.5h	28.4	270g	8011.24u/g

转化和分离纯化

转化：L-丙氨酸：160g/l，PH调至8.0，37℃，200rpm待L-丙氨酸完全溶解后，再加入丙氨酸消旋酶菌体2g/l，每隔1h取样，样品加热至沸腾，然后冷却离心，取上清测定光，待旋光至零时转化结束。

分离纯化：转化液加热煮沸10min，活性炭脱色，抽滤，真空浓缩结晶即可得到合格的DL-丙氨酸产品。

菌种保藏

大肠杆菌（Escherichia coli）CIBT1.0822，于2013年05月08日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉)，保藏号为CCTCC NO:M2013188。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种产生D-丙氨酸消旋酶的工程菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌并且携带表达枯草杆菌D-丙氨酸消旋酶的表达载体；

且所述工程菌株的酶活为≥3000U/g。

2.如权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述菌株的保藏号为CCTCC NO:M 2013188。

3.一株如权利要求1所述的表达菌株的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(a)提供一表达载体，所述表达载体携带枯草杆菌D-丙氨酸消旋酶的表达盒；

(b)将所述表达载体转入大肠杆菌，从而获得权利要求1所述的产生D-丙氨酸消旋酶的工程菌株。

4.一种如权利要求1所述的表达菌株的用途，其特征在于，用于生产DL-丙氨酸。

5.一种DL-丙氨酸的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

用如权利要求1所述的菌株转化原料L-丙氨酸，得到DL-丙氨酸；

或者所述方法包括：用如权利要求1所述的菌株的发酵液转化原料L-丙氨酸，得到DL-丙氨酸。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的发酵液是含菌体的发酵液。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述发酵液是通过包括以下步骤的方法制备：

将所述菌株接种至培养基进行培养，形成种子；

将所述种子接种入发酵罐，形成一发酵体系；

对所述发酵体系进行培养，得到发酵后的菌株。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转化的时间为0.05～10h。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在转化过程中，每隔一定时间对反应体系进行取样，测定转化率。

10.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括：对转化完毕后的DL-丙氨酸进行后处理。