JP7162374B2 - Ｇｄｓｌリパーゼ及び遺伝子改変細菌、並びにそれらの使用 - Google Patents

Description

本発明は、遺伝子工学及びタンパク質工学の分野に関連し、新型ＧＤＳＬリパーゼの遺伝子クローニング及び発現のための方法、並びにビタミンＡパルミテートの酵素合成による生成方法の使用に関連し、産業微生物の技術分野に属する。

アシルグリセロール加水分解酵素としても知られるリパーゼは、天然油をグリセロールと遊離脂肪酸に分解できる酵素の一種で、動物、植物、微生物に広く見られる。微生物は主にリゾプス、アスペルギルス及びカンジダ等を含み、リパーゼの重要な供給源である。様々なリパーゼのアミノ酸配列とそれらの基本的な生物学的特性の分析によると、リパーゼは８つのファミリーに分類でき、そのうちの２番目のファミリーはＧＤＳＬファミリーとしても知られている。ＧＤＳＬ型リパーゼ（ｌｉｐａｓｅ、ＥＣ３．１．１．３）は、チオエステル、アリールエステル、リン脂質、アミノ酸等の様々な基質を加水分解できる加水分解酵素の一種である。ＧＤＳＬリパーゼは新型のリパーゼであるため、その発現と機能に関する研究はほとんどない。ＧＤＳＬリパーゼはエステル加水分解活性を持っているので、それに対する研究はますます深くなっている。

ビタミンＡパルミテートは、正常な視覚機能を維持し、様々な代謝活動に参加して生物の健康を維持するのに役立ち、現在最も一般的に使用されているビタミンＡ誘導体であり、食品、化粧品、医薬品等の業界で広く使用されている。現在、ビタミンＡパルミテートの合成には、主に化学的方法と酵素的方法が含まれている。ビタミンＡパルミテートを合成する化学的方法は、環境汚染とコスト等の問題があることに対し、酵素的方法は、汚染が少なく、時空間収量が高く、コストが低くなる。更に、ビタミンＡパルミテートを生成する酵素が、エステル加水分解活性を持つリパーゼとなっている。

発明の内容
本発明の目的は、ＧＤＳＬリパーゼ及び遺伝子改変細菌、並びにそれらの使用を提供することで、そのリパーゼは、活性が高く、ビタミンＡパルミテートの生成に適用できる。

上記の技術的目的を達成するために、本発明は以下の技術的解決策を採用する。

アミノ酸配列が配列番号２に示される通りのＧＤＳＬリパーゼ。

本発明はまた、上記のＧＤＳＬリパーゼをコードする遺伝子を提供している。

具体的には、前記ＧＤＳＬリパーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１に示される通りとなっている。

上記のＧＤＳＬリパーゼは、ストレプトマイセス ディアスタティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）ＣＳ１８０１に由来し、その菌株は出願人の以前の出願ＣＮ１０９３３７８４３Ａで開示されている。

本発明はまた、ＧＤＳＬリパーゼをコードする遺伝子及び発現ベクターを含む組換えベクターを提供し、前記遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１に示す通りとなっている。前記発現ベクターはｐＥＴ－３２ａ（＋）で、上記の遺伝子は、発現ベクターｐＥＴ－３２ａ（＋）の複数のクローニングサイトの間に挿入される。

本発明はまた、上記の組換えベクターを含む遺伝子改変細菌を提供している。

さらに、前記改変細菌の宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）である。

本発明はまた、以下を含むビタミンＡパルミテートの酵素的生産における上記の改変細菌の使用を提供している：
（１）改変細菌を種子培養用のＬＢ培地に接種する；
（２）種液を発酵培養用の発酵培地に移し、次に誘導剤を加えて酵素の発現を誘導する；
（３）発酵ブロスを遠心分離して上清を取得し、硫酸アンモニウム沈殿と凍結乾燥によって酵素粉末を取得する；
（４）酵素粉末をビタミンＡとパルミチン酸を含む有機相システムに投入して、ビタミンＡパルミテートを生成する。

具体的には、前記方法は、３７℃および２００ｒの条件下、ＬＢ培地中で８～１２時間培養された改変細菌を、５％の接種量として発酵培地に接種する。８～１２時間発酵後、ＩＰＴＧを最終濃度０．４～１ｍｍｏｌ／Ｌになるように投入し、３７℃、２００ｒの条件下、１８～２４時間発酵培養する。４０００ｒ、１０分の条件で遠心分離して発酵ブロスの上清を取得する。酵素タンパク質を５０％硫酸アンモニウム溶液で沈殿させ、凍結乾燥から４８時間後に酵素粉末を取得することを含む。酵素粉末を５％の比率で有機相系（ビタミンＡ：パルミチン酸＝１０ｇ：１０ｇで、１Ｌのｎ－ヘキサンに溶解させる。）に投入して、一定時間変換後にビタミンＡパルミテートの含有量を測定し、変換率を計算する。

さらに、発酵培地の成分は次の通りである：
トリプトン１０ｇ／Ｌ、イーストパウダー５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．５ｇ／Ｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ０．５ｇ／Ｌ、オリーブオイルエマルジョン１２ｍＬ／Ｌ。

さらに、オリーブオイルエマルジョンの調製方法が、オリーブオイル乳化剤ＰＶＡを体積比３：１でオリーブオイルと混合し、超音波で乳化することになっている。

本発明の酵素によって構築された遺伝子改変細菌は、酵素的方法によってビタミンＡパルミテートを生成するために使用され、変換により得られるビタミンＡパルミテートの最大含有量は１６．３５ｍｇ／Ｌとなり、最高の変換効率は８１．７５％となる。そのリパーゼは、ビタミンＡパルミテートの酵素合成の新しい方法を提供し、重要な応用の見通しを持っている。

ＧＤＳＬリパーゼＰＣＲによって増幅されたターゲットバンドを示す。 大腸菌のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。 ＧＤＳＬリパーゼがビタミンＡパルミテートを生成するための変換時間を示す。

実施例１
本実施例は、ストレプトマイセス ディアスタティカスに由来するＧＤＳＬリパーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅法について説明する。

試験管の斜面に保存されているストレプトマイセス ディアスタティカスＣＳ１８０１をプレート活性化のために取り、単一コロニーをＬＢ液体培地に接種し、３０℃で２～３日間培養する。培養液を取り、８０００ｒで２分間遠心分離し、細菌を収集し、細菌ゲノム抽出キットで全ゲノム抽出を行った。抽出手順は、上海バイオエンジニアリング社の細菌ゲノム抽出キットの説明書を参照。

ＧＤＳＬリパーゼ遺伝子増幅プライマーは、以下のように設計されている。
ＧＤＳＬ２－上：５’－GTGGCCGGGCTCACGTCCTC－３’
ＧＤＳＬ２－下：５’－TCATTCCGGCAGGCTCCG－３’

抽出されたストレプトマイセス ディアスタティカスゲノムを鋳型として、上記のプライマー及び上海バイオエンジニアリング社の高ＧＣ含有量のＰＣＲ増幅キットで増幅を行ったが、Ｔａｑ酵素は投入しない。

具体的な増幅手順は以下の通りである。プリ変性が９５℃、１０分間であり、Ｔａｑ酵素を投入する。９５℃で１分間変性し、アニーリング温度は５５℃、アニーリング時間は３０秒、延長温度は７２℃、延長時間は１分で、このプロセスは２９サイクル行われ、最後に７２℃で３０分間延長する。生成物をアガロースゲル電気泳動のために取り、ターゲットバンドをゲル切断、回収後に保管した。ゲルリサイクルキットは上海バイオエンジニアリング社から購入した。

実施例２
本実施例は、酵素切断部位を有するＧＤＳＬリパーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅方法について説明する。

酵素切断部位を有するＧＤＳＬリパーゼ遺伝子増幅プライマーは、以下のように設計されている。
ＧＤＳＬ２－上：５’－CCGGAATTCGTGGCCGGGCTCACGTCCTC－３’
ＧＤＳＬ２－下：５’－CCGCTCGAGTCATTCCGGCAGGCTCCG－３’

実施例１のゲルリサイクル生成物を鋳型として、上記のプライマー及び上海バイオエンジニアリング社の高ＧＣ含有量のＰＣＲ増幅キットで増幅を行った。

具体的な増幅手順は以下の通りである。プリ変性が９５℃、２分であり、９５℃で１分間変性し、アニーリング温度は５５℃、アニーリング時間は３０秒、延長温度は７２℃、延長時間は１分で、このプロセスは２９サイクル行われ、最後に７２℃で３０分間延長した。生成物をアガロースゲル電気泳動のために取り、ターゲットバンドは図１の通りで、ターゲットバンドをゲル切断、回収後、配列測定のために上海バイオエンジニアリング社へ送付し、配列番号１を取得した。

実施例３
本実施例では、ＧＤＳＬリパーゼの組換えクローンベクターの構築方法について説明する。

実施例２のゲルリサイクル生成物をＴベクターに結合させ、ＤＨ－５αに変換した後、陽性クローン単体を選んで検証を行い、プラスミドを抽出した後に配列測定および検証を行った。

実施例４
本実施例は、ＧＤＳＬリパーゼの組換え発現ベクターの構築方法について説明する。

実施例３のプラスミドに対してＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで二重酵素切断を行い、ターゲットバンドを回収すると共に、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩでＰＥＴ３２ａ（＋）ベクターに対して二重酵素切断を行い、ベクター中の大きい断片を回収し、回収されたターゲット遺伝子断片をベクター断片に結合させ、宿主細胞大腸菌ＤＨ－５αに導入して、抵抗性スクリーニング後に、陽性クローン単体を選んで、配列測定および検証を行った。

実施例５
本実施例は、ＧＤＳＬリパーゼ遺伝子改変細菌の構築方法について説明する。

実施例４の配列測定が正しい陽性クローン単体のプラスミドを抽出し、宿主細胞である大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に直接導入して形質転換することによって、ＧＤＳＬリパーゼ遺伝子改変細菌を構築することができ、その発酵中にＩＰＴＧのような誘導剤を投入して、ＧＤＳＬリパーゼタンパク質の効率的な発現を誘導することが必要となる。融合タンパク質発現の成功は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって検証されている。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図を図２に示す。図２より、レーン１は誘導されていない大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＥＴ３２ａ－ＧＤＳＬであり、レーン２、３、及び４はそれぞれ、ＩＰＴＧによって４、８、及び１６時間誘導された組換え大腸菌Ｅ. ｃｏｌｉ ｐＥＴ３２ａ－ＧＤＳＬであり、他のレーンと比べて、分子量が４４ｋＤａの箇所で著しいバンドがあり、プラスミド上に融合、発現されたタンパク質を除去し、予測された標的タンパク質サイズと一致することで、ＧＤＳＬリパーゼが組換え細菌において首尾よく発現されたことを示している。

実施例６
本実施例は、ＧＤＳＬリパーゼ遺伝子改変細菌の、ビタミンＡパルミテートの生成における使用について説明する。

（１）３７℃、２００ｒ、ＬＢ培地で８～１２時間培養された遺伝子改変細菌を、５％の接種量で発酵培地に接種した。
（２）８～１２時間発酵後に、ＩＰＴＧを最終濃度０．４～１ｍｍｏｌ／Ｌまでに投入し、３７℃、２００ｒで１８～２４時間発酵、培養した。
（３）４０００ｒ、１０分間遠心分離して、発酵ブロスの上清を取得した。酵素タンパク質を５０％硫酸アンモニウム溶液で沈殿させ、４８時間凍結乾燥後に酵素粉末を取得し、国家標準ＧＢＴ２３５３５－２００９に従って測定したＧＤＳＬリパーゼ酵素活性は、１．５３Ｕ／ｍｇであった。
（４）酵素粉末を５％（ｗ／ｖ）の投入量で有機相系（ビタミンＡ：パルミチン酸＝１０ｇ：１０ｇで、１Ｌのｎ－ヘキサンに溶解させた。）に投入し、２、４、６、８、１０時間変換後にビタミンＡパルミテートの含有量を測定し、変換率を計算した。図３に示すように、８時間変換後に、ビタミンＡパルミテートの最高含有量は１６．３５ｍｇ／Ｌとなり、変換率は８１．７５％となった。

前記発酵培地の成分は次の通りである：
トリプトン１０ｇ／Ｌ、イーストパウダー５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．５ｇ／Ｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ０．５ｇ／Ｌ、オリーブオイルエマルジョン１２ｍＬ／Ｌ、蒸留水で容量を１Ｌにする。

オリーブオイルエマルジョンの調製方法は、オリーブオイル乳化剤ＰＶＡを、体積比３：１でオリーブオイルと混合し、超音波で乳化することになっている。

前記ビタミンＡパルミテートの測定方法は、高効率液相法で、外部標準法を採用して定量化している。クロマトグラフィー条件としては、クロマトグラフィーカラム：Ａｌｌｔｅｃｈ Ｃ１８（２５０×４．６ｍｍ、４．５μｍ）；移動相：１００％メタノール；検出器：島津１０Ａ ＵＶ検出器；検出波長：３２７ｎｍ；流速：１ｍＬ／ｍｉｎである。

変換率の計算式は次の通りである。

Claims (10)

1. アミノ酸配列が配列番号２に示される通りであることを特徴とする、ＧＤＳＬリパーゼ。
2. 請求項１に記載のＧＤＳＬリパーゼをコードする遺伝子。
3. ヌクレオチド配列が配列番号１に示される通りであることを特徴とする、請求項２に記載の遺伝子。
4. 請求項３に記載の遺伝子を含む、組換えベクター。
5. 発現ベクターがｐＥＴ３２ａ（＋）であることを特徴とする、請求項４に記載の組換えベクター。
6. 請求項５に記載の組換えベクターを含む、改変細菌。
7. 宿主細胞が大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）であることを特徴とする、請求項６に記載の改変細菌。
8. 下記を含む、ビタミンＡパルミテートの生産における請求項６又は７に記載の改変細菌の使用。
   （１）改変細菌を種子培養用のＬＢ培地に接種する；
   （２）種液を発酵培養用の発酵培地に移し、次にインデューサーを加えて酵素の発現を誘導する；
   （３）発酵ブロスを遠心分離して上清を取得し、硫酸アンモニウム沈殿と凍結乾燥によって酵素粉末を取得する；
   （４）酵素粉末をビタミンＡとパルミチン酸を含む有機相システムに投入して、ビタミンＡパルミテートを生成する。
9. 前記発酵培地の成分が下記の通りであることを特徴とする、請求項８に記載の使用：
   トリプトン１０ｇ／Ｌ、イーストパウダー５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．５ｇ／Ｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ０．５ｇ／Ｌ、オリーブオイルエマルジョン１２ｍＬ／Ｌ、蒸留水で容量を１Ｌにする。
10. 前記オリーブオイルエマルジョンが、オリーブオイル乳化剤ＰＶＡを体積比３：１でオリーブオイルと混合し、超音波で乳化する方法により調製されることを特徴とする、請求項９に記載の使用。

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