CN102212601B - 酵母展示脂肪酶催化合成维生素a棕榈酸酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酵母展示脂肪酶催化合成维生素A棕榈酸酯的方法,包括:将维生素A醋酸酯和棕榈酸溶于有机溶剂中,加入酵母展示脂肪酶,无氧条件下于50~60℃反应10~14小时,分离、纯化制得维生素A棕榈酸酯;将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,将所得转化子接种于BMMY培养基中,诱导培养72~144小时后离心收集菌体,菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶;本发明通过将脂肪酶展示在细胞外,利用该酶制剂催化合成维生素A棕榈酸酯,不仅提高了转化效率,而且缩短了反应时间,降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域,尤其涉及一种酵母展示脂肪酶催化合成维生素A棕榈酸酯的方法。
背景技术
维生素A(视黄醇)是一种天然的脂溶性维生素,具有维持正常视觉反应、骨骼发育、上皮组织功能,维护皮肤细胞功能、促进生长发育及清除自由基、提高免疫能力等功效,因此维生素A已经广泛应用于化妆品、保健食品等行业。维生素A系列中最常用的是维生素A和维生素A醋酸酯,但它们在光、空气、氧化剂和高温的条件下极易被氧化,现在已经有大量的研究集中于发展合成性质稳定的维生素A衍生物,尤其是维生素A棕榈酸酯。目前市场上维生素A棕榈酸酯(retinyl palmitate)是用化学合成制得,然而化学法合成不仅存在化学催化剂带来的有毒物质,而且高温、高压条件下很容易发生副反应,产生有毒副作用的产物,同时还有能耗高、对设备和仪器要求高、对环境污染严重等问题,酶法合成可以避免这些问题。目前国内外已有很多利用脂肪酶合成维生素A棕榈酸酯的报道,但是由于脂肪酶(游离酶或固定化)制作复杂、生产成本高而限制了这一生物催化过程的商业化、规模化应用。
发明内容
本发明提供了一种酵母展示脂肪酶催化合成维生素A棕榈酸酯的方法,可显著降低维生素A棕榈酸酯生产成本,同时达到较高的酯化反应效率和产率。
一种酵母展示脂肪酶催化合成维生素A棕榈酸酯的方法,包括:
将维生素A醋酸酯和棕榈酸溶于有机溶剂中,加入酵母展示脂肪酶,无氧条件下于50~60℃反应10~14小时,分离、纯化制得维生素A棕榈酸酯。
优选的,所述的有机溶剂为正己烷。
优选的,每升有机溶剂中维生素A醋酸酯、棕榈酸和酵母展示脂肪酶的加入量分别为20~100g、50~150g、50~100g。
搅拌速率为200~250转/分钟。
所述的分离、纯化为:将反应液离心,取上清液,旋转蒸发除去有机溶剂,水洗后溶于正己烷,重结晶。
所述的酵母展示脂肪酶通过如下方法制备:
将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,将所得转化子接种于BMMY培养基中,诱导培养72~144小时后离心收集菌体,菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶;
所述的重组质粒由原始载体pPIC9K和依次插入原始载体pPIC9K中MFα1信号肽下游的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成。
所述的脂肪酶基因可选用Genbank号为AF229435的序列,毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115为商业化产品,可从Invitrogen公司购得。它的细胞壁α凝集素基因序列的Genbank号为M28164。
载体pPIC9K为商业化产品(如Invitrogen公司),它存在MFα1信号肽序列(Genbank号:M17301),同时该载体内信号肽序列上游存在AOX1启动子(Genbank号:Z46233)。重组质粒线性化处理的目的是为了与胞内基因组发生同源重组,提高表达稳定性。
优选的,所述生物印迹所用配体为油酸,它可以诱导酶结构改变,提高转化率。
本发明通过将脂肪酶基因和细胞壁α凝集素基因导入毕赤酵母细胞GS115,毕赤酵母细胞诱导培养后,脂肪酶表达并分泌到胞外,同时利用细胞壁α凝集素将该脂肪酶固定在细胞表面。利用该酵母展示脂肪酶对酯化反应进行催化,可有效提高操作稳定性、耐热性以及重复性,由于酶反应的特异性该酶能大幅度抑制副反应的发生,终转化率(以维生素A计)在90%以上。
具体实施方式
实施例1 制备酵母展示脂肪酶
通过人工合成的方法,合成米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶基因(Genbank号:AF229435)和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因(Genbank号为M28164),同时在脂肪酶基因C端加上连接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS(linker),连接后得到核苷酸序列pro-ROL-linker-α-agglutinin,同时在序列两端添加EcoR I和Not I酶切位点,其中pro-ROL为脂肪酶基因,α-agglutinin为细胞壁α凝集素基因。
以上述人工合成序列为模板,利用下述引物对,进行PCR扩增,
上游引物:5’-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3’;
下游引物:5’-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3’
PCR反应体系为:模板DNA为1μl,高保真DNA聚合酶0.5μl,dNTP(50mM)0.4μl,上下游引物各0.5μl,10×PCR缓冲液5μl,加水至50μl。
PCR运行条件为:94℃3分钟,35个循环(94℃30秒,60℃1分钟,72℃30秒),72℃10分钟。
用EocR I和Not I同时酶切PCR产物和pPIC9K质粒,并在T4连接酶的作用下过夜连接形成pPIC9K-ROL质粒,通过电泳检验并回收质粒。为使目的基因与毕赤酵母GS115发生His 4单位点置换重组,用Sal I对pPIC9K-ROL质粒进行酶切线性化处理。将酶切线性化处理好的目的基因约15μl加入到事先准备好的毕赤酵母GS115感受态细胞中,转入电转杯中,冰浴15min,然后在1500V,400Ω,25uF条件下电击10ms,并加入约1ml预冷的山梨醇。将上述混匀的电转产物约400μl涂于MD平板上,筛选阳性转化子,然后将阳性转化子涂于不同浓度的G418平板上,根据阳性转化子对G418的抗性筛选出Mut表型的多拷贝阳性重组菌株。
将多拷贝阳性重组菌株接种在BMGY培养基中发酵培养30h,离心收集细胞;再将细胞置于含有0.5%(体积百分比)甲醇的BMMY培养基中诱导培养144h,离心收集细胞,用水冲洗后,接种至YGC培养基中30℃培养120h,然后3000g离心分钟收集菌体,蒸馏水洗涤后再用50mM pH7.0磷酸缓冲液洗涤,然后与2倍体积油酸混合,-80℃下预冻后再经德国Christ真空冷冻干燥机干燥24h,用己烷洗涤除去油酸,再进行再真空干燥去除己烷,即得到经生物印迹处理的酵母展示脂肪酶。
实施例2 酵母展示脂肪酶催化合成维生素A棕榈酸酯
实例1 取维生素A醋酸酯0.328g、棕榈酸1.282g,加入含有10mL正己烷的磨口三角瓶,混合、预热10min,然后加入酵母展示脂肪酶0.5g,充N2密封,置于85-1型磁力搅拌器中搅拌开始反应,转速为250转/分钟,反应温度保持在45℃,反应12h后停止搅拌,离心沉淀除去酵母展示脂肪酶,取上清液进行旋转蒸发除去有机溶剂,水洗3次后加入正己烷于4℃结晶得维生素A棕榈酸酯产品,烘干、粉碎即可。
实例2 取维生素A醋酸酯0.656g、棕榈酸0.7g,加入含有10mL正己烷的磨口三角瓶,混合、预热10min,然后加入酵母展示脂肪酶1g,充N2密封,置于85-1型磁力搅拌器中搅拌开始反应,转速为200转/分钟,反应温度保持在50℃,反应12h后停止搅拌,离心沉淀除去酵母展示脂肪酶,取上清液进行旋转蒸发除去有机溶剂,水洗3次后加入正己烷于4℃结晶得维生素A棕榈酸酯产品,烘干、粉碎即可。
实施例3 采用传统化学法合成维生素A棕榈酸酯
取维生素A醋酸酯0.328g、棕榈酸1.282g,加入含有10mL正己烷的磨口三角瓶,混合、预热10min,充N2密封,置于85-1型磁力搅拌器中搅拌开始反应,转速为250转/分钟,反应温度保持在45℃,反应12h后停止搅拌,取上清液进行旋转蒸发除去有机溶剂,水洗3次后加入正己烷于4℃结晶得维生素A棕榈酸酯产品,烘干、粉碎即可。
实施例4 测定转化产率和转化率
取1mL未分离的反应产物,离心去除催化剂,旋转蒸发溶剂,用100%甲醇准确定容至10mL,该溶液经0.22μm有机滤膜过滤后用高效液相色谱(HPLC)测定溶液各组分浓度。HPLC条件如下:Agilent Technologies 1200系列高效液相色谱液,色谱柱:Grace Prevail Organic Acid 5u150mm×4.6mm,柱温:40℃,流动相:甲醇/水/磷酸(85/15/0.1),流速:1mL/min,进样量:10μL,检测波长:280nm。
转化率计算公式如下:
转化率=C retinyl acetate-C ester/C retinyl acetate×100%。
式中:C ester为HPLC测定样品中维生素A棕榈酸酯的浓度,C retinylacetate为反应前样品中维生素A醋酸酯的浓度。
通过上述方法检测计算,实施例2中,实例1合成维生素A棕榈酸酯的转化率达90%,实例2合成维生素A棕榈酸酯的转化率达89%。而实施例3采用传统化学法合成维生素A棕榈酸酯的转化率仅为54%。
Claims (1)
1.一种酵母展示脂肪酶催化合成维生素A棕榈酸酯的方法,包括:
人工合成米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶基因、毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因,接着在脂肪酶基因C端加上连接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS的基因片段,连接得到核苷酸序列pro-ROL-linker-α-agglutinin,pro-ROL代表脂肪酶基因,Genbank号为:AF229435,α-agglutinin代表细胞壁α凝集素基因,Genbank号为:M28164,linker代表编码连接肽的基因片段;
以上述人工合成序列为模板,利用下述引物对,进行PCR扩增,
上游引物:5’-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3’;
下游引物:5’-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3’;
PCR反应体系为:模板DNA为1μl,DNA聚合酶0.5μl,50mM的dNTP0.4μl,上下游引物各0.5μl,10×PCR缓冲液5μl,加水至50μl;
PCR运行条件为:94℃3分钟;35个循环,每个循环为:94℃30秒,60℃1分钟,72℃30秒;72℃10分钟;
用EocR I和Not I同时酶切PCR产物和pPIC9K质粒,并在T4连接酶的作用下过夜连接形成pPIC9K-ROL质粒,用Sal I对pPIC9K-ROL质粒进行酶切线性化处理,将酶切线性化处理好的目的基因15μl加入到毕赤酵母GS115感受态细胞中,转入电转杯中,冰浴15min,然后在1500V,400Ω,25uF条件下电击10ms,并加入1ml预冷的山梨醇;
将混匀的电转产物400μl涂于MD平板上,筛选阳性转化子,然后将阳性转化子涂于不同浓度的G418平板上,根据阳性转化子对G418的抗性筛选出Mut表型的多拷贝阳性重组菌株;
将多拷贝阳性重组菌株接种在BMGY培养基中发酵培养30h,离心收集细胞;再将细胞置于含有体积百分比为0.5%的甲醇的BMMY培养基中诱导培养144h,离心收集细胞,用水冲洗后,接种至YGC培养基中30℃培养120h,然后3000g离心收集菌体,蒸馏水洗涤后再用50mM pH7.0磷酸缓冲液洗涤,然后与2倍体积油酸混合,-80℃下预冻后再经德国Christ真空冷冻干燥机干燥24h,用己烷洗涤除去油酸,再进行再真空干燥去除己烷,即得到经生物印迹处理的酵母展示脂肪酶;取维生素A醋酸酯 0.328g、棕榈酸1.282g,加入含有10mL正己烷的磨口三角瓶,混合、预热10min,然后加入酵母展示脂肪酶0.5g,充N2密封,置于85-1型磁力搅拌器中搅拌开始反应,转速为250转/分钟,反应温度保持在45℃,反应12h后停止搅拌,离心沉淀除去酵母展示脂肪酶,取上清液进行旋转蒸发除去有机溶剂,水洗3次后加入正己烷于4℃结晶得维生素A棕榈酸酯产品,烘干、粉碎。
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Non-Patent Citations (10)
Title |
---|
刘涛等.脂肪酶催化合成维生素A酯.《现代化工》.2005,第25卷(第2期),37-40. |
固定化脂肪酶合成维生素A棕榈酸酯;李宏亮等;《生物工程学报》;20080525;第24卷(第5期);817-820 * |
外源脂肪酶在毕氏酵母表面展示及发酵过程分析;张溪等;《现代食品科技》;20101231;第26卷(第1期);9-13 * |
张溪等.外源脂肪酶在毕氏酵母表面展示及发酵过程分析.《现代食品科技》.2010,第26卷(第1期),9-13. |
李宏亮等.固定化脂肪酶合成维生素A棕榈酸酯.《生物工程学报》.2008,第24卷(第5期),817-820. |
毕赤酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶B全细胞催化合成葡萄糖月桂酸酯;郑穗平等;《生物工程学报》;20091225;第25卷(第12期);摘要和1934-1935 * |
脂肪酶催化合成维生素A酯;刘涛等;《现代化工》;20050228;第25卷(第2期);摘要 * |
郑穗平等.毕赤酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶B全细胞催化合成葡萄糖月桂酸酯.《生物工程学报》.2009,第25卷(第12期),1933-1939. |
酿酒酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶B的酶学性质研究;黄登峰等;《现代食品科技》;20081231;第24卷(第7期);627-630 * |
黄登峰等.酿酒酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶B的酶学性质研究.《现代食品科技》.2008,第24卷(第7期),627-630. |
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