CN101285078A

CN101285078A - 一种酵母展示脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法

Info

Publication number: CN101285078A
Application number: CNA2008100286319A
Authority: CN
Inventors: 林影; 韩双艳; 潘志友; 郑穗平; 黄登峰
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2008-06-10
Filing date: 2008-06-10
Publication date: 2008-10-15

Abstract

本发明公开了一种酵母展示脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法，该方法包括全细胞酶制剂的生产和己酸乙酯的合成两个步骤，是将脂肪酶基因克隆到毕赤酵母表面展示载体pKFS中构建毕赤酵母表面展示表达载体pKFS－lipase，pKFS－lipase经线性化后转化毕赤酵母宿主菌，筛选获得在毕赤酵母表面展示活性酶蛋白的重组酵母基因工程菌，工程菌经摇瓶发酵，收获菌体真空冷冻干燥24h以上制成全细胞酶制剂；然后采用己酸和乙醇为原料，在表面展示有脂肪酶的毕赤酵母全细胞酶制剂作为生物催化剂的作用下发生酯化反应，得到己酸乙酯产品。该方法反应时间短、产率高、操作稳定性好，且反应后离心收集菌体即可重复利用，大大降低生产成本。

Description

一种酵母展示脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法

技术领域

本发明涉及己酸乙酯的制备方法，特别是涉及一种用全细胞酶制剂高效地催化合成己酸乙酯的新生产工艺。

背景技术

己酸乙酯是酿酒行业常用的调香物质，是浓香型白酒(如五粮液)的主体风味物质，其含量高低直接影响曲酒的品质也是白酒质量的重要指标之一。每年我国用于浓香型曲酒调香的己酸乙酯达3000多吨，价值上亿元。目前这些标着食品级的己酸乙酯的生产采用基本上采用化学合成法，用硫酸或对甲苯磺酸作催化剂，由己酸和乙醇直接酯化反应。化学法合成的己酸乙酯调配白酒时会产生外加香精的“浮香”，残留的催化剂会与加浆用水中的金属离子产生白色混浊或沉淀，直接影响白酒质量，同时副反应容易生成有毒物质。同时由于副反应造成后处理困难，产品质量不高，酸催化后还造成大量废液。现虽有使用其他催化剂的报道，如钛酸四异丙酯、硫酸锆、水合硫酸铁等，但由于催化剂成本、活性、以及产品质量等问题还难以取代酸催化方法。

随着人们对生产环境的关注，对高品质、尤其是对天然品的需求日益增加，用生物技术生产己酸乙酯酯引起了人们的广泛兴趣。本专利提出的微生物酶法合成己酸乙酯是有望取代化学合成法的工艺。微生物酶法不但反应条件温和、能耗低，三废少，反应速率和转化率高，而且产品纯度高，使用微生物酶法合成的己酸乙酯调配白酒时，产品风味柔和、香醇自然。美国联邦法规已确认酶在有机相中催化合成的己酸乙酯是高质量的天然品。和化学合成法相比，微生物酶法具有反应条件温和、转化率高、专一性好、易提取、易控制等优点，被看成是很有希望工业化的新途径。

专利号为03116567.2的中国发明专利公开了一种高转化率的生物催化合成己酸乙酯的工艺方法，该方法采用己酸和乙醇为原料，在生物催化剂脂肪酶的作用下发生酯化反应，得到己酸乙酯产品；在反应过程中，反应产生的水分不断地通过选择性水透过膜被吸水性盐或水合盐吸收，使反应持续地朝酯化合成方向进行，直至反应物接近完全转化。该方法既可以吸收反应的生成水，又可以使反应体系保持微水环境，技术上保证了高效合成己酸乙酯。但该方法是用聚苯乙烯大孔吸附树脂固定脂肪酶，不适用于柱反应系统，酶在固定化过程种难免出现酶活损失，酶固定化也需要一定的条件，传质过程常有扩散限制，重复使用中酶活力逐渐降低，导致产物转化率低。还有采用游离的脂肪酶通过生物催化合成己酸乙酯。由于酶的分离、再生、循环使用很困难，存在反应时间长、特别是生产过程中酶易失活，如选用高活力的脂肪酶如Novo435，价格昂贵，应用于工业化大生产成本过高。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供反应时间短、产率高、操作稳定性好、成本低的全细胞酶制剂催化合成己酸乙酯的方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种酵母展示脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法，在于包括如下步骤：

(1)全细胞酶制剂的生产：将脂肪酶基因克隆到携带酿酒酵母絮凝素基因(pKFS)的毕赤酵母表面展示载体中，构建毕赤酵母表面展示表达载体pKFS-lipase(真核絮凝素脂肪酶融合蛋白表达载体)，pKFS-lipase经线性化后转化毕赤酵母宿主菌，筛选获得在毕赤酵母表面展示活性酶蛋白的重组酵母基因工程菌，工程菌经摇瓶发酵，收获菌体真空冷冻干燥24h以上制成全细胞酶制剂；

(2)己酸乙酯的合成：采用己酸和乙醇为原料，以全细胞酶制剂为催化剂，以能够溶解己酸和乙醇的液态物质为溶剂发生酯化反应，得到己酸乙酯产品，底物中己酸含量为0.2mol/L～1.8mol/L，己酸和乙醇的摩尔比为1∶0.75～1∶5，酯化反应温度为20-90℃；反应物中全细胞酶制剂用量为10-90g/L(反应体系中的浓度)，反应时间12h以上。

相对于现有技术本发明具有如下优点和有益效果：

本发明采用以展示有高活力脂肪酶的毕赤酵母全细胞酶制剂作为催化剂，具有固定化酶的优点，反应时间短、产率高、操作稳定性好。反应后离心收集菌体即可重复利用，大大降低生产成本。酵母具有良好的生物安全性，其取代化学载体固定脂肪酶生产己酸乙酯，完全符合绿色食品的要求。本发明涉及这种毕赤酵母全细胞酶制剂冻干粉在非水相的反应体系中，以有机溶剂为溶剂，能有效的催化己酸和乙醇酯化生成己酸乙酯，反应12h后，己酸的摩尔转化率可超过98％，经过10批次的连续使用，全细胞酶制剂仍然在每批次中使己酸的转化率保持在95％以上，具有良好的操作稳定性。

附图说明

图1是pKFS载体结构示意图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步的说明，需要说明的是，这些实施例并不构成对本发明保护范围的限制。

本发明提供了可用来克隆酶基因的指导脂肪酶展示在毕赤酵母表面携带酿酒酵母絮凝素基因的展示载体pKFS(真核絮凝素脂肪酶融合蛋白表达载体)。如图1所示。此展示载体在pPIC9K(Invitrogen公司真核表达载体)的基础上利用限制性内切酶EcoRI和NotI将原载体上的信号肽部分基因切除，在此基础上用来源于酿酒酵母的絮凝素基因FS替换。该质粒主要包含5’AOX1(醇氧化酶-1基因的启动子)、3’AOX1(醇氧化酶-1基因的转录终止子)、FS(絮凝素基因)、HIS4(组氨酸脱氢酶基因)，以及Amp⁺(氨苄青霉素抗性)、Kna⁺(卡那霉素抗性)等元件，同时包含可用来克隆脂肪酶基因的多克隆位点，包括限制性内切酶酶切位点MluI(来源于Micrococcus luteus，滕黄微球菌)、ApaI(来源于Acetobacter pasteurianus sub.Pasteurianus，巴氏醋杆菌巴氏亚种)、SacII(来源于Streptomyces achromogenes，产色链霉菌)、EcoRI(来源于大肠杆菌RY13)、AvrII(NEB公司)、NotI(来源于Nocardia otitidis-caviarum，珊瑚红诺卡氏菌)。将脂肪酶基因(包含南极假丝酵母脂肪酶B基因、米黑根毛酶的脂肪酶基因以及二者衍生的突变脂肪酶基因)与展示载体pKFS实现体外连接，提供了可指导毕赤酵母表面展示脂肪酶的重组性展示表达载体，pKFS-lipase(真核絮凝素脂肪酶融合蛋白表达载体)。

菌体干粉制备过程如下：首先，针对拟克隆的脂肪酶基因设计引物，以基因组模板或含脂肪酶基因的质粒为模板进行PCR(聚合酶链式反应)扩增，PCR产物与展示载体pKFS经同样的限制性内切酶处理，经T4连接酶体外连接后，转化大肠杆菌感受态，涂布抗性平板，挑选鉴定阳性单克隆。阳性单克隆摇瓶培养提取重组质粒pKFS-lipase。重组质粒pKFS-lipase线性化后转化毕赤酵母宿主菌，转化物涂布抗性平板，28～32℃培养2～3d后，筛选获得重组转化子。重组转化子经BMGY扩大培养24～48h后，采用6000g～10000g离心力室温离心收集菌体，再用同体积的BMMY诱导培养，每隔24h添加甲醇至终浓度为1％。7000g～10000g离心力、4℃离心10～15分钟，弃上清，用去离子水洗涤菌体三次，重悬菌体经真空冷冻干燥24h以上收获菌体干粉。

己酸乙酯的合成：用己酸和乙醇为原料，以全细胞酶制剂为催化剂，以能够溶解己酸和乙醇的液态物质为溶剂，发生酯化反应，得到己酸乙酯产品，底物中己酸含量为0.2mol/L～1.8mol/L，己酸和乙醇的摩尔比为1∶0.75～1∶5，酯化反应温度为20-90℃；反应物中全细胞酶制剂用量为10-90g/L(反应体系中的浓度)，反应时间12h以上，取样10000rpm离心10min。上清与乙酸正丁酯内标物混合溶于正己烷中，振荡混匀，1μL注入气相色谱测定产物中己酸乙酯、己酸的含量。

实施例1

(1)表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(简称calb)的毕赤酵母全细胞酶制剂的生产。

首先，根据南极假丝酵母脂肪酶(calb)基因LF058的核苷酸序列设计引物，以南极假丝酵母基因组DNA为模板进行PCR扩增全长calb，PCR程序如下：94℃预变性5min，以94℃1min、60℃1min、72℃1min进行30个循环，72℃延伸10min。100μL的PCR扩增产物经Eco RI和Not I酶切，同时把20μL质粒pPIC9K-Flop1经Eco RI和Not I酶切，纯化后用T₄DNA连接酶连接，与pMD18-T连接，转化E.coli Top10，筛选阳性转化子。

验证的重组质粒pKFS-CALB经Sac I线性化后用电转移的方转化P.pastorisGS115。涂转化物涂布于G418梯度平板，30℃培养2d。挑取部分抗高浓度G418的转化子接种于5ml YPD培养液，30℃，250r/min培养过夜，碱滴定法检测脂肪酶活力，得到展示高酶活的毕赤酵母工程菌。毕赤酵母工程菌先经YPD培养种子液，经BMGY扩大培养24h后；6000g室温离心收集菌体。再用同体积的BMMY诱导培养，每隔24h添加甲醇至终浓度为1％。30℃、250rpm摇床培养4d。7000rpm、4℃离心10分钟，弃上清，用去离子水洗涤菌体三次，重悬菌体经真空冷冻干燥24h。

(2)非水相酯化反应制备己酸乙酯。试剂都预先用

分子筛充分除水。将无水乙醇和正己酸加入正庚烷中。加入后，无水乙醇的浓度为1.75mol/L，正己酸的浓度为1.4mol/L。取5mL底物(其中正己酸125μL，无水乙醇73μL，正庚烷4800μL，酸醇摩尔比为1∶1.25)混合物于50mL具塞三角瓶中，加入含量为40g/L的步骤(1)所得菌体冻干粉，反应温度40℃，然后于200rpm下振荡反应，0.5h后加入0.6g分子筛，5h后加入0.3g分子筛，反应24h，己酸的转化率达到96.5％。在上述条件下反应后，离心回收菌体，经溶剂正庚烷洗涤，去除产物和残余的微量底物，再加入到含有新鲜底物的反应体系中催化酯化反应，经过10批次的连续使用，毕赤酵母展示CALB仍然在每批次中使己酸的转化率保持在90％以上。

实施例2

(1)表面展示米黑根毛霉脂肪酶(简称RML)的毕赤酵母全细胞酶制剂的生产。

根据GenBank中已报道的米黑根毛霉脂肪酶RML前体序列(P19515，GI：417256)设计引物，以质粒PMD18-T-RML为模板进行PCR扩增。PCR体系为模板1μL；10×TaqDNA聚合酶buffer 5μL(含Mg2+)；2.5mmol/L dNTP 4μL；20μM mol/L的上下游引物各1μL；Taq DNA聚合酶0.75μL，加无菌水至总体积为50μL。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，45℃退火45s，72℃延伸2min，共30个循环；第30个循环72℃延伸10min，将PCR产物和pKFS质粒都用SnaBI和AvrII双酶切，构建重组质粒pPIC9K-RML后用CaCl₂转化法转入E.coli Top10F″，在Amp⁺LB(50mg/mL)平板上涂板，过夜培养。提取阳性转化子质粒进行SnaBI和AvrII双酶切鉴定。

以LiCl法将SalI线性化的重组质粒pKFS-RML转化宿主菌P.pastorisKM71，转化物涂布于MD平板，30℃培养2d。将MD平板上的转化子分别接种于含G4180.5mg/mL，1.0mg/mL，1.5mg/mL，2.0mg/mL，3.0mg/mL的YPD平板上，30℃培养3d，观察结果。将高浓度G418-YPD平板(3.0mg/mL)上出现的转化子接种于MM-罗丹明B平板(MM培养基加5g/L橄榄油和1mg/L罗丹明B)上，培养皿倒置，在盖上加100μL甲醇，30℃诱导培养48h后，选取365nm紫外光下形成较大荧光圈的转化子挑取其对应的单克隆，即为展示高酶活的毕赤酵母工程菌。毕赤酵母工程菌先经YPD培养种子液，经BMGY扩大培养24h后；6000g室温离心收集菌体。再用同体积的BMMY诱导培养，每隔24h添加甲醇至终浓度为1％。30℃、250rpm摇床培养4d。7000rpm、4℃离心10分钟，弃上清，用去离子水洗涤菌体三次，重悬菌体经真空冷冻干燥24h。

(2)非水相酯化反应制备己酸乙酯。试剂都预先用

分子筛充分除水。将无水乙醇和正己酸加入正庚烷中。加入后，无水乙醇的浓度为0.25mol/L，正己酸的浓度为0.2mol/L。取5mL底物(其中正己酸125μL，无水乙醇73μL，正庚烷4800μL，酸醇摩尔比为1∶1.25)混合物于50mL具塞三角瓶中，加入含量为90g/L的菌体冻干粉，反应温度90℃，然后于200rpm下振荡反应，0.5h后加入0.6g分子筛，5h后加入0.3g分子筛，反应12h，己酸的转化率达到96.59％。在上述条件下反应后，离心回收菌体，经溶剂正庚烷洗涤，去除产物和残余的微量底物，再加入到含有新鲜底物的反应体系中催化酯化反应，经过10批次的连续使用，毕赤酵母展示CALB仍然在每批次中使己酸的转化率保持在92％以上。

实施例3

根据GenBank中已报道的米黑根毛霉脂肪酶RML前体序列(P19515，GI：417256)设计引物，以质粒PMD18-T-RML为模板进行PCR扩增。PCR体系为模板1μL；10×TaqDNA聚合酶buffer 5μL(含Mg2+)；2.5mmol/L dNTP 4μL；20μM mol/L的上下游引物各1μL；Taq DNA聚合酶0.75μL，加无菌水至总体积为50μL。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，45℃退火45s，72C延伸2min，共30个循环；第30个循环72℃延伸10min，将PCR产物和pKFS质粒都用SnaBI和AvrII双酶切，构建重组质粒pPIC9K-RML后用CaCl2转化法转入E.coli Top10F″，在Amp⁺LB(50mg/mL)平板上涂板，过夜培养。提取阳性转化子质粒进行SnaBI和AvrII双酶切鉴定。

以LiCl法将SalI线性化的重组质粒pKFS-RML转化宿主菌P.pastorisKM71，转化物涂布于MD平板，30℃培养2d。将MD平板上的转化子分别接种于含G4180.5mg/mL，1.0mg/mL，1.5mg/mL，2.0mg/mL，3.0mg/mL的YPD平板上，30℃培养5d，观察结果。将高浓度G418-YPD平板(3.0mg/mL)上出现的转化子接种于MM-罗丹明B平板(MM培养基加5g/L橄榄油和1mg/L罗丹明B)上，培养皿倒置，在盖上加100μL甲醇，30℃诱导培养48h后，选取365nm紫外光下形成较大荧光圈的转化子挑取其对应的单克隆，即为展示高酶活的毕赤酵母工程菌。毕赤酵母工程菌先经YPD培养种子液，经BMGY扩大培养24h后；6000g室温离心收集菌体。再用同体积的BMMY诱导培养，每隔24h添加甲醇至终浓度为1％。30℃、250rpm摇床培养4d。7000rpm、4℃离心10分钟，弃上清，用去离子水洗涤菌体三次，重悬菌体经真空冷冻干燥24h。

(2)非水相酯化反应制备己酸乙酯。试剂都预先用

分子筛充分除水。将无水乙醇和正己酸加入正庚烷中。加入后，无水乙醇的浓度为0.3mol/L，正己酸的浓度为0.2mol/L。取5mL底物(其中正己酸125μL，无水乙醇87.6μL，正庚烷4787.4μL，酸醇摩尔比为1∶1.5)混合物于50mL具塞三角瓶中，加入含量为60g/L的菌体冻干粉，反应温度20℃，然后于200rpm下振荡反应，0.5h后加入0.6g分子筛，5h后加入0.3g分子筛，反应24h，己酸的转化率能达到98％。在上述条件下反应后，离心回收菌体，经溶剂正庚烷洗涤，去除产物和残余的微量底物，再加入到含有新鲜底物的反应体系中催化酯化反应，经过10批次的连续使用，毕赤酵母展示CALB仍然在每批次中使己酸的转化率保持在92％以上。

Claims

1、一种酵母展示脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)全细胞酶制剂的生产：将脂肪酶基因克隆到携带酿酒酵母絮凝素基因的毕赤酵母表面展示载体(pKFS)中，构建毕赤酵母表面展示表达载体pKFS-lipase(真核絮凝素脂肪酶融合蛋白表达载体)，pKFS-lipase经线性化后转化毕赤酵母宿主菌，筛选获得在毕赤酵母表面展示活性酶蛋白的重组酵母基因工程菌，工程菌经摇瓶发酵，收获菌体真空冷冻干燥24h以上制成全细胞酶制剂；

2、根据权利要求1所述的全细胞酶制剂催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于所述的溶剂选自正己烷、正庚烷、环己烷中的一种或多种。

3、根据权利要求1所述的全细胞酶制剂催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于所述的底物己酸含量为0.5mol/L～1.5mol/L(反应体系中浓度)。

4、根据权利要求1所述的全细胞酶制剂催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于所述的全细胞酶制剂为有脂肪酶的重组酵母菌菌体冻干粉。

5、根据权利要求1所述的全细胞酶制剂催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于所述携带酿酒酵母絮凝素基因的毕赤酵母表面展示载体(pKFS)包含5’AOX1(醇氧化酶-1基因的启动子)、3’AOX1(醇氧化酶-1基因的转录终止子)、FS(絮凝素基因)、HIS4(组氨酸脱氢酶基因)，以及Amp⁺(氨苄青霉素抗性)和Kna⁺(卡那霉素抗性)元件。

6、根据权利要求1或5所述的全细胞酶制剂催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于所述毕赤酵母表面展示载体中含有用来克隆脂肪酶基因的多克隆位点，多克隆位点包括限制性内切酶酶切位点MluI、ApaI、SacII、EcoRI、AvrII和NotI。

7、根据权利要求1所述的全细胞酶制剂催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于所述脂肪酶基因包括南极假丝酵母脂肪酶B基因、米黑根毛酶的脂肪酶基因以及二者衍生的突变脂肪酶基因。