CN101481695B - 一种改良的米黑根毛霉脂肪酶基因及其在酵母展示中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种改良的米黑根毛霉脂肪酶基因及其在酵母展示中的应用。改良的米黑根毛霉脂肪酶基因序列为SEQ.ID.NO2。含有所述基因的重组载体pMD18-T-RML，RML是指脂肪酶基因；携带该质粒的菌株Escherichia coli TOP10/pMD18-T-RML保藏号为：CCTCC M208136。本发明将该基因转入到毕赤酵母宿主菌中，实现米黑根毛霉脂肪酶在毕赤酵母中的展示表达，提供的毕赤酵母菌能有效展示米黑根毛霉脂肪酶，该脂肪酶能广泛应用于制造脂肪酸甲酯、己酸乙酯、具有不同熔点且不含各式脂肪酸的三甘酯以及一些“重构脂”等。

Description

一种改良的米黑根毛霉脂肪酶基因及其在酵母展示中的应用

技术领域

本发明涉及一种能在毕赤巴斯德酵母中高效表达米黑根毛霉脂肪酶的脂肪酶基因序列和展示有高活力脂肪酶的酵母菌，以及从该重组酵母中得到的基因工程脂肪酶。

背景技术

脂肪酶(Lipase EC3.1.1.3)即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业，是重要的工业酶制剂之一，其催化活性仅仅取决于它的蛋白质结构，因而不同来源的脂肪酶具有不同的催化特性和催化活力。

米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶(RML)的工业应用较广泛。Brady等人已将该酶的高级结构阐述清楚，表明其具有优良的Sn-1立体特异性，对中长链脂肪酸酯较适合，可用于制造人造黄油和具有不同熔点且不含各式脂肪酸的三甘酯以及一些“重构脂”。天然的米黑根毛霉脂肪酶产量低下、成分不稳定，存在较大的缺陷，使得其应用成本偏高和应用受到限制。目前，米黑根毛霉脂肪酶的酶学性质研究较深入，如Zacharis等以米黑根毛霉脂肪酶的转酯化和酯化反应为模型，针对特定的反应底物、反应介质、酶催化剂，选择合适的水合盐对调控水活度，提高了非水相催化效率。但就如何提高米黑根毛霉脂肪酶产量和获得高酶活，国内外鲜有报道，利用传统发酵条件优化显著提高RML酶活力已经是无能为力。

酵母表面展示系统是继噬菌体展示技术创立后发展起来的真核展示系统，酵母的蛋白质折叠和分泌机制与哺乳动物细胞非常相似，对人的蛋白质表达和展示更具优越性。在酵母细胞表面展示的酶，可直接进行活性分析，避免了在大肠杆菌表达时的复杂纯化步骤。表面展示有酶的酵母，经简单的离心富集后可作为全细胞催化剂，直接应用于催化反应，具有固定化酶的优点，并且能实现酶的反复利用，大大降低了成本，有利于工业化生产。人们早期开发的是酿酒酵母表面展示系统，而毕赤酵母表面展示系统是近来研发的。

毕赤酵母具有受甲醇调控的AOX1基因强启动子，能够稳定展示糖基化和二硫键异构化等修饰的真核蛋白，较酿酒酵母而言，更具有表达量高，胞外表达本底蛋白少等优点。 毕赤酵母展示与酿酒酵母展示相比，毕赤酵母展示的比酶活有可能比酿酒酵母展示的比酶活低，但是毕赤酵母更易实现高密度培养，因此一般可获得高于酿酒酵母的酶产量。目前报道毕赤酵母表面展示的脂肪酶较少，这与毕赤酵母表面展示系统开发较晚，载体系统不成熟，展示能力不稳定有关。具体到米黑根毛霉脂肪酶的展示，发明人已将未修饰的原始RML基因在酿酒酵母表面展示，酶活力为182U/g干细胞，产量低，大大限制了其作为全细胞催化剂的应用和米黑根毛霉脂肪酶酶制剂的开发(Wei-GuoZhang，Shuang-YanHan，eta1，Functional display of Rhizomucor miehei lipase on surface of Saccharomyces cerevisiae withhigher activity and its practical properties；Journal of Chemical Technology and Biotechnology2008，83：329-335)。因而急需在增加酶的展示量、寻找更合适的展示宿主，以及改良展示载体等方面的研究完善，为其应用奠定基础。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种能在毕赤酵母表面高效展示的米黑根毛霉脂肪酶(RML)的基因序列。

本发明的第二个目的是提供上述基因序列克隆的载体。

本发明的第三个目的是提供指导脂肪酶展示表达在毕赤酵母细胞表面的重组质粒载体。

本发明的第四个目的是提供具有上述基因序列的能展示高活力脂肪酶的毕赤酵母工程菌。

本发明的目的是通过以下技术方案实现：

(1)能在毕赤酵母中高效表达的改良的米黑根毛霉脂肪酶基因：米黑根毛霉脂肪酶的氨基酸序列为SEQ.ID.NO1，利用毕赤巴斯德酵母菌的偏好密码子置换出原米黑根毛霉脂肪酶基因中酵母不常用的密码子，具体序列如SEQ.ID.NO2。接着通过PCR合成的方法来获得基因片段。具体方法：首先根据已设计好的脂肪酶基因设计46条引物，均以阿拉伯数字命名，其中1、3、5……45等单数为正向引物，2、4、6……46为反向引物，如SEQ.ID.NO3所示。将不同的引物采用二步PCR法(DNA聚合酶链式反应法)扩增获得全长改良脂肪酶基因。

本发明中引物的合成、PCR法合成改良脂肪酶基因工作可以通过专门的生物技术公司或机构来完成。

(2)具有上述基因序列克隆的载体的构建

利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，将获得的改良脂肪酶基因PCR产物与T载体在连接酶作用下实现体外连接，转化大肠杆菌感受态，涂平板培养过夜，进行蓝白斑筛选，挑选的阳性克隆提质粒经测序验证。克隆脂肪酶基因用的T载体可以是市售通用的任意T载体，如pUCm-TVector、pGEM-T载体、PMD18-T、PMD19-T等。我们选用了PMD18-T，获得了携带改良脂肪酶基因的质粒载体pMD18-T-RML。

本发明所述基因的重组载体PMD18-T-RML，其中RML是指脂肪酶基因序列；携带该质粒的菌株大肠杆菌TOP10F/PMD18-T-RML Escherichia coli TOP10F/pMD18-T-RML于2008年9月24日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC NO：M 208136。保藏地址为湖北省武汉市武汉大学(430072)。

(3)脂肪酶展示表达到酵母细胞外的重组质粒载体的构建

为实现改良脂肪酶基因在毕赤巴斯德酵母中的展示表达，采用pKFS(已申请专利，申请号200810028631.9，此展示载体在pPIC9K(Invitrogen公司真核表达载体)的基础上利用限制性内切酶EcoRI和NotI将原载体上的信号肽部分基因切除，在此基础上用来源于酿酒酵母的絮凝素基因FS替换。该质粒主要包含5’AOX1、3’AOX、FS(絮凝素基因)、HIS4，以及Amp⁺、Kna⁺等元件，同时包含可用来克隆脂肪酶基因的多克隆位点，包括限制性内切酶酶切位点MluI、ApaI、SacII、EcoRI、AvrII、NotI)为克隆表达载体。去除了RML上游编码自身信号肽的24个氨基酸对应的序列，以利用pKFS的絮凝素基因FS展示外源蛋白。根据GenBank中已报道的米黑根毛霉脂肪酶RML前体序列(P19515，GI：417256)，设计引物克隆成熟的米黑根毛霉脂肪酶基因，上游引物RMLp1：5‘-5′-GCAGGCGAATTCGTTCCAATTAAGAGACAATCTAAC-3’，含EcoRI酶切位点(以下划线示出)以及保护碱基；下游引物RMLp2：5‘-GCCAGCCCTAGGAGTACACAAACCAGTGTTAATACC-3’，含AvrII酶切位点(以下划线示出)以及保护碱基。

以质粒PMD18-T-RML为模板，RMLp1和RMLp2为引物进行PCR扩增。将PCR产物和pKFS质粒都用EcoRI和AvrII双酶切，体外连接构建重组质粒pKFS-RML。

(4)提供具有上述基因序列的能表达高活力脂肪酶的毕赤酵母工程菌

以LiCl法将Sal I线性化的重组质粒pKFS-RML转化毕赤巴斯德酵母宿主菌GS115或KM71，转化物涂布于MD平板，培养2-3d。将MD平板上的转化子分别接种于含不同浓度的G418抗性YPD平板上，培养3-5d。将高浓度G418-YPD平板上出现的转化子挑取其对应的单克隆，按Invitrogen操作指南提取酵母基因组DNA作为模板，进行酵母基因组 PCR鉴定，获得重组转化子。

重组转化子先接种于BMGY培养基中，培养至OD₆₀₀到2-6。离心收集菌体，再将其悬浮于BMMY培养基中，稀释至OD₆₀₀为1，继续振荡培养，每隔24h向BMMY培养基中补加甲醇至终浓度为1.0％进行诱导表达，发酵上清液中脂肪酶活力高达468.8U/g酵母干细胞。

相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：

本发明采用酵母表面展示系统表达酶，在保持酶高活力、高催化性能的同时，相比游离酶或固定化酶省略了纯化分离的繁琐步骤，更具有固定化酶的优点，可以反复使用，操作稳定性强。同其他表达系统一样，酵母表达非同种、非同属的外源基因时，也表现出来了产量不高，表达能力降低的问题。本发明针对酵母表达系统合成适合其表达的RML基因，有效了解决了上述问题，实现了酶的高表达，表达活力高达468.8U/g酵母干细胞，为现有报道的最高水平。

附图说明

图1是经PCR拼接合成基因的引物示意图；

图2是米黑根毛霉脂肪酶基因的PCR合成鉴定电泳图；

图3是pMD18-T-RML送上海生工生物工程有限公司测序图；

具体实施方式

下面结合幅图与实施例对本发明做进一步的说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。

实施例1：改良米黑根毛霉脂肪酶基因的合成

现有的米黑根毛霉脂肪酶基因如SEQ.ID.NO4所示，该基因来源为米黑根毛霉，与酵母不同属，这可能是该基因在毕赤酵母中的表达量不高的主要原因。

本发明是在米黑根毛霉脂肪酶(RML)氨基酸序列(SEQ.ID.NO1)的基础上，采用毕赤巴斯德酵母偏好的密码子替换RML在酵母中使用频率低的密码子，设计出在毕赤巴斯德酵母中使用频率高的基因序列，形成以下具体的基因序列，如SEQ.ID.NO2，从而提高米黑根毛霉脂肪酶在酵母中的表达量。

本发明设计的基因可以通过PCR人工合成，步骤如下：

首先合成46条引物，引物如SEQ.ID.NO3所示。如图1所示，引物包括正向引物23条(奇数序，正向箭头)，反向引物23条(偶数序，反相箭头)，正向引物与反相引物彼此配对互补。将46条寡核苷酸(引物)以200nmol/L的终浓度加入PCR反应体系，反应 体系中加入10×Taq DNA聚合酶buffer 5μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，无菌双蒸水补充至50μL，进行第一轮PCR反应：94℃变性10s，50℃退火30s，72℃延伸45s，共35cycles。将此PCR产物稀释100倍后取2μL作为模板，加入上下游两末端的核苷酸(即P1和P22)至终浓度200nmol/，PCR体系同上。94℃变性5min后，94℃变性45s，50℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环；第30个循环72℃延伸10min，将第二轮PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图2所示。由图可知道，二次PCR产物在对应DNA Marker分子量为1000的位置上出现了明显的特异性扩增带，同设计的RML片段大小相符。初步证实获得了改良的RML基因。

实施例2：

PMD18-T-RML质粒的构建

上步获得的全长PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，切取约1092bp大小的目的条带，按QIAGEN的PCR凝胶回收试剂盒说明书纯化目的产物，取回收产物25.5μL，加入25mM浓度的dATP 1μL，10XPCRbuffer3μL，Taq酶0.5μL，72℃保温30min。

加A后的产物(A是腺嘌呤)，用pMD18-T simple vector试剂盒进行TA克隆，按照说明书进行操作。10μL体积反应体系如下：T载体1μL(50ng)，加入加A后的PCR产物3μL，含ATP的10×Buffer 1μL，T4DNA连接酶1μL，用ddH2O补足至10μL。稍加离心，16℃水浴连接夜。连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布到含0.5mM IPTG，40μg/ml X-Gal指示平板上，过夜培养，挑选白斑提取质粒酶切鉴定后，将重组质粒PMD18-T-RML送上海生工生物工程有限公司测序，测序结果如图3所示，表明克隆的基因与我们设计基因一致。

实施例3：

重组质粒pKFS-RML的构建

以质粒PMD18-T-RML为模板，RMLp1和RMLp2为引物进行PCR扩增。体系为模板1μL；10×Taq DNA聚合酶buffer 5μL(含Mg²⁺)；2.5mmol/L dNTP 4μL；20μM mol/L的上下游引物各1μL；Taq DNA聚合酶0.75μL，加无菌水至总体积为50μL。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，45℃退火45s，72℃延伸2min，共30个循环；第30个循环72℃延伸10min，PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化。

将PCR产物和pKFS质粒都用EcoRI和AvrII双酶切，构建重组质粒pKFS-RML后用CaCl₂转化法转入E.coli Top10F，在Amp⁺LB(50mg/mL)平板上涂板，过夜培养。提取阳性转化子质粒进行EcoRI和AvrII双酶切鉴定。鉴定正确后，同样委托上海生工生物工程有 限公司进行测序。

实施例4

表达高活力脂肪酶的毕赤酵母工程菌的培养

以LiCl法将SalI线性化的重组质粒pKFS-RML转化宿主菌GS115，转化物涂布于MD平板，30℃培养2d。将MD平板上的转化子分别接种于含G418 0.5mg/mL，1.0mg/mL，1.5mg/mL，2.0mg/mL，3.0mg/mL的YPD平板上，30℃培养3d。将高浓度G418-YPD平板(3.0mg/mL)上出现的转化子挑取单克隆。按Invitrogen操作指南提取酵母基因组DNA作为模板，利用目的基因序列的PCR引物进行酵母基因组PCR鉴定，总反应体积为20μL，Taq酶量为2U，取2μLPCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

鉴定正确的重组转化子GS115/pKFS-RML接种于20mLBMGY培养基中，30℃，200r/min振荡培养160h至OD₆₀₀到3。离心收集菌体，再将其悬浮于BMMY培养基中，稀释至OD600为1，继续振荡培养，每隔24h向BMMY培养基中补加甲醇至终浓度为1.0％进行诱导表达，发酵4天。发酵液在7000rpm、4℃离心10分钟，弃上清，用去离子水洗涤菌体三次，重悬菌体经真空冷冻干燥24h，得菌体冻干粉。利用橄榄油做底物进行NaOH法滴定测定脂肪酶水解活力，结果显示该脂肪酶活力高达468.8U/g酵母干细胞，比现有技术(Functional display of Rhizomucor miehei lipase on surface of Saccharomyces cerevisiae withhigher activity and its practical properties)报道的酿酒酵母展示的米黑根毛霉脂肪酶的酶活力182U/g酵母干细胞提高近3倍。

在一定的反应条件下，每克重组脂肪酶干细胞每分钟与底物反应生成1μmol对硝基苯酚(游离脂肪酸)定义为1个酶活单位(U)。

实施例5脂肪酸甲酯的合成

采用大豆油(或三油酸甘油酯)和甲醇为原料，使用有机溶剂，在毕赤酵母细胞表面展示的米黑根毛霉脂肪酶作用下发生转酯化反应，得到脂肪酸甲酯产品。

有机溶剂石油醚预先用 分子筛充分除水。取约2.5mL底物(其中大豆油0.965g，甲醇0.035g，石油醚2.5ml，醇油摩尔比为1∶1)混合物于25mL具塞三角瓶中，在40度下预热20min，然后加入0.2g(约17.296U)实施例4的毕赤酵母工程菌菌体冻干粉，反应温度40℃，然后于180rpm下振荡反应，在反应24h和48h后分别加入0.035g甲醇(最终醇油摩尔比为3∶1)，反应72h，反应完成后离心取上清，然后上气相色谱分析(气相色谱：安捷伦7890C；检测器：氢离子检测器；柱子：DB-FFAP毛细管柱)，最终脂肪酸甲酯的含量为1.5036g。

实施例6非水相酯化反应制备己酸乙酯

试剂都预先用 

分子筛充分除水。将无水乙醇和正己酸加入正庚烷中。加入后，无水乙醇的浓度为0.3mol/L，正己酸的浓度为0.2mol/L。取5mL底物(其中正己酸125μL，无水乙醇87.6μL，正庚烷4787.4μL，酸醇摩尔比为1∶1.5)混合物于50mL具塞三角瓶中，加入含量为40g/L的实施例4的毕赤酵母工程菌菌体冻干粉，反应温度40℃，然后于200rpm下振荡反应，0.5h后加入0.5g分子筛，5h后加入0.3g分子筛，反应12h，己酸的转化率能达到98％。在上述条件下反应后，离心回收菌体，经溶剂正庚烷洗涤，去除产物和残余的微量底物，再加入到含有新鲜底物的反应体系中催化酯化反应，经过10批次的连续使用，毕赤酵母展示CALB仍然在每批次中使己酸的转化率保持在95％以上。

由实施例5、6可见，应用实施例4制备的毕赤酵母工程菌菌体冻干粉均能有效催化脂肪酸甲酯和己酸乙酯的合成，由于该菌体冻干粉作为催化剂，与游离酶和固定化酶相比，省去了分离纯化的繁琐步骤，易于制备，生产周期短，操作稳定性强，有利于降低生产成本，并实现规模化应用。

序列列表

SEQ.ID.NO1：

SEQ.ID.NO2：

SEQ.ID.NO3：

SEQ.ID.NO4：

Claims (4)

1.一种改良的米黑根毛霉脂肪酶基因，其特征在于，其完整全基因序列为SEQ.ID.NO2。

2.一种含有权利要求1所述基因的重组载体pMD18-T-RML，其中RML是指权利要求1所述的脂肪酶基因序列；携带该质粒的菌株Escherichia coli TOP10/pMD18-T-RML保藏号为：CCTCC M 208136。

3.一种含有权利要求1所述基因序列的重组载体pKFS-RML，其中RML是指权利要求1所述的脂肪酶基因；所述pKFS是在pPIC9K的基础上利用限制性内切酶EcoRI和NotI将原载体上的信号肽部分基因切除，用来源于酿酒酵母的絮凝素基因FS替换后获得；以质粒pMD18-T-RML为模板，RMLp1和RMLp2分别为上、下游引物，进行PCR扩增；将PCR产物和pKFS质粒都用EcoRI和AvrII双酶切，体外连接构建重组质粒pKFS-RML；

上游引物RMLp 1：5‘5′-GCAGGCGAATTCGTTCCAATTAAGAGACAATCTAAC-3’；下游引物RMLp2：5‘GCCAGCCCTAGGAGTACACAAACCAGTGTTAATACC-3’。

4.一种由权利要求3所述的重组载体所转化的毕赤酵母菌，其特征在于，将表达载体pKFS-RML转化入毕赤巴斯德酵母。 

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