CN101892250A - 一种高产油酸的浅白隐球酵母工程菌株的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高产油酸的浅白隐球酵母工程菌株的构建方法，提供一种高产油酸的酵母工程菌株，该载体以pCAMBIA2300为基本骨架，含有千年桐VeSAD基因，可以改变产油酵母脂肪酸成分从而提高油酸含量，该方法的步骤如下：(1)含酶切位点千年桐VeSAD基因cDNA编码区全长序列获得；(2)VeSAD正义表达载体构建；(3)重组农杆菌菌株获得；(4)浅白隐球酵母工程菌株的获得。本发明有益的效果是：本发明将从千年桐种子总RNA中分离的VeSAD基因构建到酵母表达载体pCAMBIA2300上，并采用农杆菌介导法将VeSAD基因导入浅白隐球酵母，使植物脂肪酸合成基因在酵母中高效表达，增加了浅白隐球酵母的产油率，特别是提高了油脂中油酸的含量。

Description

一种高产油酸的浅白隐球酵母工程菌株的构建方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，属于基因工程菌株构建方法，具体涉及一种高产油酸的浅白隐球酵母工程菌株的构建方法。

背景技术

为应对愈演愈烈的石油危机，世界各国都在积极制定和实施新的能源发展战略，希望通过各种可能途径寻找到新的石油替代品，生物柴油便是其中之一。目前，生产生物柴油的原料主要依赖于油料作物、木本油料人工林、动物脂肪及废弃油脂等。从油料树木中提取油脂，具有占用耕地面积、周期长、成本高等一系列制约因素。发展动物油脂也同样面临一系列制约因素。因此，开辟新的植物源油脂生产途径，特别是工业化生产途径对满足不断增长的生物柴油的需求具有重要意义。

研究发现，除高等植物和动物能生产油脂外，低等的微生物也能产生油脂，大部分微生物油脂的脂肪酸组成和一般植物油相似。通常情况下微生物细胞仅含油2～3％，但在适宜条件下，某些微生物产生并贮存的油脂占其生物总量的20％以上，在已知细菌、酵母、霉菌和藻类中都发现有产油脂的菌株。酵母是一种繁殖速度很快的生物，利用酵母作为生物反应器生产脂肪酸，为生物柴油原料生产开辟了一条新的技术途径。酵母生产油脂时，具有增殖快，生长周期短，适合工厂化生产，投入较少，收获稳定，不受季节、气候等环境条件影响，且不消耗化学肥料和农药，因而对环境污染减轻。但目前常见的产油酵母存在产油率低，油脂成分组成复杂，与生产优质生物柴油的原料要求仍为较大距离。

运用分子生物学技术，将植物脂肪酸合成相关基因特别是控制产脂量和脂肪酸品质的基因导入酵母中，构建优质“基因工程菌株”，使植物脂肪酸合成酶基因在酵母细胞中的高效表达，增加酵母产油量，提高和控制脂肪酸组成。此种新方式可从根本上解决酵母产脂菌油质差、产油率低的缺陷，又可充分发挥酵母适合于生物反应器发酵以及林源优质脂肪酸合成酶的优点。

Δ9硬脂酰-ACP脱饱和酶(Stearoyl-ACP desaturase，简称：SAD)是目前研究最多、最广泛的Acyl-ACP脱饱和酶。该酶催化的反应是在第9～10碳原子之间形成第一个双键，是不饱和脂肪酸生物合成途径的第一步脱饱和，直接调控膜脂与贮脂中饱和与不饱和脂肪酸的比例，该酶对调节油料作物种子中脂肪酸含量和组分具有非常重要的意义。千年桐是生产生物柴油的理想树种之一，将千年桐的SAD基因(VeSAD)构建在酵母表达载体上并整合到产油酵母中高效表达，使产油酵母的饱和脂肪酸向油酸转化，从而大大提高油脂成分中油酸的含量，为酵母产油符合生物柴油的质量要求奠定基础。

发明内容

本发明要解决上述现有技术的缺点，提供一种高产油酸的浅白隐球酵母工程菌株的构建方法，提供一种高产油酸的酵母工程菌株，该载体以pCAMBIA2300为基本骨架，含有千年桐VeSAD基因，可以改变产油酵母脂肪酸成分从而提高油酸含量，从而提高浅白隐球酵母的油脂含量，该菌株的名称为Cryptococcus albidus VeSAD-1，保存在中国林业科学研究院亚热带林业研究所观赏植物研究组实验室。

用于本发明工程菌株Cryptococcus albidus pCAM2300-sad中表达千年桐VeSAD基因的质粒是pCAM2300-sad，构建过程如图1所示。

本发明解决其技术问题采用的技术方案：这种高产油酸的浅白隐球酵母工程菌株的构建方法，在酵母基因组中含有千年桐VeSAD基因表达盒，该表达盒依次含有CaMV35S启动子、千年桐VeSAD序列、终止密码子，其中所述的酵母是浅白隐球酵母；该方法的步骤如下：

(1)、含酶切位点千年桐VeSAD基因cDNA编码区全长序列获得

根据千年桐VeSAD基因(GenBank登录号为EU072353)核苷酸序列设计引物，以千年桐未成熟种子总RNA为模板，经RT-PCR扩增，在VeSAD上游引入Sal I酶切位点，下游引入Kpn I酶切位点，电泳回收VeSAD基因cDNA片段，克隆到pGEM T-Easy载体，转化大肠杆菌DH5α，测序，命名该载体为pGEM-T-sad；

(2)、VeSAD正义表达载体构建

结合表达载体pCAMBIA2300的限制性酶切位点——Kpn I、Sma I、BamH I、Xba I、SalI、Pst I，选用Sal I、Kpn I两个位置来作为插入目的片段的酶切位点，设计带Sal I、Kpn I酶切位点的引物，以克隆载体质粒pGEM-T-Vesad为模板进行PCR反应；将扩增产物与表达载体pCAM2300一起均用Sal I和Kpn I双酶切；分别回收相应的片段，用T₄DNA连接酶进行连接，转化E.coli DH 5α感受态细胞；提取质粒进行酶切鉴定，表达载体命名为pCAM2300-sad；

(3)重组农杆菌菌株获得

采用冻溶法将重组表达载体pCAM2300-sad农杆菌菌株EHA105、LBA4404、AGL-1；

(4)浅白隐球酵母工程菌株的获得

采用农杆菌介导法，活化含重组表达载体的农杆菌，与浅白隐球酵母菌液共培养，转移到含卡那霉素的筛选培养基上，获得具有卡那霉素抗性的转化子，经PCR和Southern分子鉴定，表明千年桐VeSAD基因已经插入浅白隐球酵母的基因组中。经过油脂成分检测，该菌株的油酸占总含油量的50.21％，比对照提高了14.4％。

本发明有益的效果是：本发明将从千年桐种子总RNA中分离的VeSAD基因构建到酵母表达载体pCAMBIA2300上，并采用农杆菌介导法将VeSAD基因导入浅白隐球酵母，使植物脂肪酸合成基因在酵母中高效表达，增加了浅白隐球酵母的产油率，特别是提高了油脂中油酸的含量，更加适合生物柴油的要求，为生物柴油原料生产提供一种高效产油脂的工程菌株。

附图说明

图1：本发明质粒pCAM2300-sad构建过程示意图；

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：

1实验材料

1.1植物材料

从中国林业科学研究院亚热带林业研究所树木园采取千年桐发育中的果实，将种子剥出在液氮中速冻后-80℃冰箱保存备用。

1.2菌株与质粒

浅白隐球酵母(Cryptococcus albidus)购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，大肠杆菌E.coli DH5α、根癌农杆菌EHA 105、LBA4404、AGL-1为本实验室保存。质粒pCAMBIA2300为本实验室保存，克隆载体pGEM-T Easy购自Promega公司。

1.3主要生化试剂

RNA提取试剂盒购自天泽基因工程有限公司(四川绵阳)；cDNA合成试剂盒、IPTG、X-gal、购自上海生工生物工程技术有限公司；质粒提取试剂盒、DNA胶纯化回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司；大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞、T₄连接酶、限制性内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司。引物合成及菌液测序分别由上海生工生物工程技术有限公司和上海联合基因公司完成，脂肪酸成分测定由亚热带林木培育重点开放性实验室完成。

1.4培养基配制

LB培养基(g·L^-1)：蛋白胨10，酵母膏5，氯化钠10，调pH至7.0。

YPD培养基(组分g·L^-1)：蛋白胨20，酵母膏10，葡萄糖20，自然pH。

SM培养基(选择培养基)(g·L^-1)：酵母氮基6.70，葡萄糖20，调pH至6.0。

MM(组分g·L^-1)：K₂HPO₄ 2.2822，KH₂PO₄ 1.3609，NaCl 0.146，MgSO₄·7H₂O 0.49294，

CaCl₂ 0.077693，FeSO₄·7H2O 0.0025021，(NH₄)₂SO₄ 0.52856，C₆H₂O₆ 1.9817。

IM(诱导培养基)：在MM液体培养基的基础上加入40mM MES，调pH到5.3，然后

加入5％的甘油(W/V)，115℃灭菌30min。固体培养基灭菌前加入琼脂0.8-1％。

YEPD培养基(种子培养基)(g·L^-1)：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，自然pH。

发酵培养基(g·L^-1)：葡萄糖80，(NH₄)₂SO₄ 3.0，MgSO₄·7H₂O 3.0，KH₂PO₄2.0，pH5.5-6.0

2实验方法

2.1千年桐发育中种子总RNA提取

(1)液氮研磨破碎细胞，取约100mg左右的细粉至新离心管中；

(2)加入1mL溶液A振荡混合30s；

(3)加入0.3mL溶液B和0.2mL氯仿，振荡混匀；

(4)室温离心13000g，5min，取上清(约0.8mL)移至新离心管中；

(5)加入0.5mL溶液C和0.2mL氯仿，振荡混匀；

(6)室温离心13000g，3min，取上清(约950mL)移至新管中；

(7)加1/2体积的溶液D，振荡混匀；

(8)室温离心13000g，5min，形成白色沉淀；

(9)加1mL 75％乙醇振荡混匀，离心13000g，3min，弃上清；

(10)重复步骤9，吹干后溶于30uL DEPC处理的纯水中。

(11)取2uL在1.0％的琼脂糖凝胶中快速电泳检测总RNA的完整性。于-80℃保存待用。

溶液A-D是试剂盒中的产品，A：裂解缓冲液，B：第一次分相液，C：第二次分相液，D：RNA沉淀液。

2.2反转录

运用(上海生工)AMV第一链cDNA合成试剂盒，以总RNA为模板，合成cDNA第一链。具体方法如下：

(1)冰浴中加：

总RNA                 3uL

下游特异性引物        1uL

无RNA酶去离子水        3uL

总体积                 7uL

(2)混匀离心3～5s，70℃5min，冰浴30s

(3)冰浴加入：

5×Reaction Buffer     4uL

RNA酶抑制剂(20U/uL)    1uL

dNTP(10mM)             2uL

(4)混匀离心，37℃5min，加入1uLM-MLV RT(20U/uL)，混匀。

(5)37℃60min；最后70℃保温10min。

2.3PCR扩增VeSAD基因含酶切位点cDNA编码区全长

根据在GenBank上登录的VeSAD基因核苷酸和氨基酸序列设计兼并引物，引物序列如下：

Vesad FP：GAT GTC GAC ATG GCA CTC AAG CT

Vesad RP：GAC GGT ACC TAA CAG CTG CAC TT

其中Vesad FP含酶切位点Sal I，Vesad RP含酶切位点Kpn I，以2.2合成的cDNA为模板，PCR扩增千年桐VeSAD基因cDNA编码区。扩增条件为：94℃预变性4min，94℃30S、58℃30S、72℃1min，30个循环，72℃延伸10min。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

2.4扩增产物的克隆和测序

2.4.1PCR产物的回收

将VeSAD cDNA用B型小量DNA片断快速胶回收试剂盒(博大泰克)进行特异性扩增产物的回收纯化，操作步骤如下：

(1)在1.0％的琼脂糖凝胶中电泳，使扩增产物分离形成特异带；

(2)切下目的条带置离心管中；

(3)加700uL溶胶液，55℃溶胶，其间偶尔摇动；装柱，12000rpm，离心30s；去掉废液；

(4)加入500uL漂洗液(wash buffer)漂洗，12000rpm离心30s。重复漂洗一次。倒掉废液后再于12000rpm离心2min；

(5)加入45uL的洗脱缓冲液(Elution buffer)或水，室温放置2min，12000rpm离心。管底溶液即为回收的目的片断。

2.4.2回收产物的连接和转化

回收产物连接到pGEM T-Easy载体上，按照Promega公司pGEM-T Easy连接试剂盒说明书进行操作。转化按照宝生物E.coli DH 5α感受态转化方法进行。

(1)将回收纯化的PCR产物连接到pGEM-T Easy载体上，在离心管中分别加入下列成分：回收产物4uL；T载体1uL；2×T₄ Buffer 5uL；T₄DNA连接酶(3U/uL)1uL；轻轻混匀后离心收集到管底，16℃过夜连接。

(2)从-80℃冰箱中取100uL感受态细胞，室温下解冻后立即置冰上；

(3)加入5uL连接产物，混匀，冰浴30min；

(4)42℃水浴热击90s，迅速置于冰上冷却3～5min；

(5)向管中加入1mL LB液体培养基(不含Amp)，混匀后37℃振荡培养1h，使菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Amp^r)；

(6)将上述菌液摇匀后取200uL加入40uL X-gal及4uL IPTG混合均匀，涂布于含Amp的筛选平板上。37℃倒置过夜培养。

(7)白色菌落为重组子。

2.4.3质粒DNA提取

将5mL含Amp(50mg/L)LB液体培养基加入到50mL小三角瓶中，挑取白色单菌落37^℃振荡过夜。质粒提取按照博大泰克公司试剂盒描述的方法进行。

(1)取1-3mL在LB培养基中过夜培养的菌液，12000rpm离心30s，弃尽上清。

(2)用250uL已加入RNaseA的溶液I均匀悬浮细菌沉淀，室温放置5min；

(3)加入250uL溶液II，温和上下翻转4-6次混匀，使菌体充分裂解；

(4)加入350uL溶液III，上下翻转6-8次混匀，12000rpm离心10min；

(5)吸取离心上清并转移到DNA制备管中，12000rpm离心1min；

(6)将制备管放回离心管，加入500uL的Buffer W1，12000rpm离心1min；弃滤液；

(7)将制备管放回离心管，加入700uL的Buffer W2，12000rpm离心1min；弃滤液；重复洗涤一次。

(8)将制备管移入新的离心管中，在膜正中央加40-60uL水，室温静置1min；12000rpm离心1min。将收获的重组质粒于-20℃保存。

2.4.4质粒的酶切鉴定

根据pGEM T-Easy载体的图谱，选用EcoR I限制性内切酶对提取的质粒进行鉴定。将酶切鉴定的阳性克隆对应的菌液，送往上海联合基因集团公司联众基因科技研究院测序部进行测序。命名该载体为pGEM-T-SKSAD，在添加Amp的液体LB培养基中繁殖含该载体的大肠杆菌E.coli DH 5α然后提取质粒就能大量生产该载体。

2.5含VeSAD基因的表达载体构建

将pGEM-T-SKSAD与表达载体pCAM2300用Sal I和Kpn I双酶切。分别回收相应的片段，用T₄ DNA连接酶进行连接，转化E.coli DH 5α感受态细胞。将菌液涂布在含Kan的LB平板上，37℃倒置培养过夜。碱法提取质粒DNA，双酶切质粒来验证目的片段插入是否正确，结果如图2。表达载体命名为pCAM2300-sad，全长9933bp，其特征在于所含VeSAD基因能在植物、真菌中表达，在添加Kan的液体LB培养基中繁殖含该载体的大肠杆菌E.coliDH 5α然后提取质粒就能大量生产该载体。

2.6表达载体转化农杆菌

采用冻融法，将表达载体pCAM2300-sad导入根癌农杆菌EHA105、LBA4404、AGL-1中。

(1)取200uL EHA 105感受态细胞，加入10uL表达载体质粒，冰浴30min；

(2)液氮中速冻5min，迅速置于37℃水浴5min；

(3)冰浴5min后，加入800uL LB液体培养基，180rpm 28℃培养3h后涂布在含有相应抗生素的LB固体平板上，28℃培养1-2天。

(4)挑选单菌落于含有相应抗生素的LB液体培养基中过夜培养，碱法提取农杆菌质粒DNA。

(5)以相应的菌液和质粒DNA为模板，进行PCR鉴定，判断目的片段是否插入到表达载体上。PCR反应条件参照2.3。

经电泳检测表明3个农杆菌均已导入表达载体质粒pCAM2300-sad。

2.7农杆菌转化浅白隐球酵母

将含有质粒pCAM2300-sad的根癌农杆菌在LB平板培养基(含50μg/mL卡那霉素，50μg/mL利福平)上划线活化，挑取农杆菌单克隆接种于10mL液体LB培养基中(含50μg/mL卡那霉素，50μg/mL利福平)，28℃，180r/min振荡培养18h，离心收集菌体，用IM培养基重悬(含50μg/mL卡那霉素，50μg/mL利福平)，稀释至OD600至0.15左右，继续培养5-6h至OD600为0.4-0.6；接种浅白隐球酵母于10mL YPD培养基中，28℃，180r/min振荡培养18h后，按1∶5稀释到YPD新鲜培养基中，培养5-6h。分别离心收集酵母和根癌农杆菌菌体，用无菌水清洗一次，用IM培养基重悬菌体，农杆菌浓度稀释至OD600为0.5左右(约1010个细胞/mL)，酵母稀释至OD660为0.7左右(约108个细胞/mL)，各取50μL加入10mL IM培养基(含AS 200μmol/L)中，25℃，180r/min培养过夜后，取100μL培养液涂布铺有微孔滤膜的IM(含AS 200μmol/L)平板上，25℃倒置遮光培养2d。

2.8转化子的筛选

将微孔滤膜转接到SM I培养基(含100μg·mL^-1卡那霉素，200μg·mL^-1头孢呋辛那)上培养3-5d，将初筛得到的转化子和野生型浅白隐球酵母同时在SMII培养基平板(含150μg·mL^-1卡那霉素，300μg·mL^-1头孢呋辛那)上划线，倒置培养3-5d，观察其生长情况，能够正常生长的可以初步认为是阳性转化子。

2.9转化子基因组DNA的提取及PCR鉴定

采用玻璃珠法提取阳性转化子基因组DNA，以DNA为模板，以Vesad FP和VesadRP为引物，进行PCR扩增，反应条件参照2.3。PCR扩增产物采用0.8％(W/V)的琼脂糖凝胶电泳检测。

2.10转化子的PCR-Southern鉴定

PCR扩增同2.3，回收纯化VeSAD扩增产物，以未转化的野生菌作为阴性对照，表达载体质粒pCAM2300-sad作为阳性对照，进行琼脂糖凝胶电泳。按Roche公司的DIG High Prime DNALabeling and Detection Starter Kit II操作步骤探针标记、转膜、杂交，最后进行显影分析。杂交结果表明千年桐VeVeSAD基因已整合到浅白隐球酵母基因组中。

2.11转基因产油脂酵母的发酵培养

挑取保存于斜面的酵母细胞，于PDA斜面培养基上28℃活化培养2d，用接种环挑取活化后的酵母细胞分别接入到50ml的液体种子培养基中，于28℃，180r/min振荡培养24h。然后将种子液按10％的比例接种到装有发酵培养基的250ml三角瓶中，三角瓶装液量均为为100ml，在28℃，180r/min振荡培养144h。

2.12油脂提取及脂肪酸成分测定

油脂提取利用酸热法提取油脂，脂肪甲酯化采用氢氧化钾-甲醇室温酯化法，油脂脂肪酸组成及相对含量的气相色谱分析在Agilent 6890N气相色谱仪上测定。

测定结果表明，转千年桐VeSAD基因的少根根霉菌株的油酸含量明显高于未转化的野生型菌株，油酸含量为50.21％，比对照提高了14.4％。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>中国林业科学研究院亚热带林业研究所

 

<120>一种高产油酸的浅白隐球酵母工程菌株的构建方法

 

<130>无

 

<140>

<141>

 

<160>2

 

<210>1

<211>23

<212>DNA    

<213>人工序列

 

<221>misc_feature

<223>引物

 

<400>1

GATGTCGACATGGCACTCAAGCT

 

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

 

<221>misc_feature

<223>引物

 

<400>2

GATGTCGACATGGCACTCAAGCT

Claims (3)

1.一种高产油酸的浅白隐球酵母工程菌株的构建方法，其特征是：在酵母基因组中含有千年桐VeSAD基因表达盒，该表达盒依次含有CaMV35S启动子、千年桐VeSAD序列、终止密码子，其中所述的酵母是浅白隐球酵母；该方法的步骤如下：

(1)、含酶切位点千年桐VeSAD基因cDNA编码区全长序列获得

根据千年桐VeSAD基因核苷酸序列设计引物，以千年桐未成熟种子总RNA为模板，经RT-PCR扩增，在VeSAD上游引入Sal I酶切位点，下游引入Kpn I酶切位点，电泳回收VeSAD基因cDNA片段，克隆到pGEM T-Easy载体，转化大肠杆菌DH5α，测序，命名该载体为pGEM-T-sad；

(2)、VeSAD正义表达载体构建

结合表达载体pCAMBIA2300的限制性酶切位点——Kpn I、Sma I、BamH I、Xba I、SalI、Pst I，选用Sal I、Kpn I两个位置来作为插入目的片段的酶切位点，设计带Sal I、Kpn I酶切位点的引物，以克隆载体质粒pGEM-T-Vesad为模板进行PCR反应；将扩增产物与表达载体pCAM2300一起均用Sal I和Kpn I双酶切；分别回收相应的片段，用T₄DNA连接酶进行连接，转化E.coli DH 5α感受态细胞；提取质粒进行酶切鉴定，表达载体命名为pCAM2300-sad；

(3)重组农杆菌菌株获得

采用冻溶法将重组表达载体pCAM2300-sad农杆菌菌株EHA105、LBA4404、AGL-1；

(4)浅白隐球酵母工程菌株的获得

采用农杆菌介导法，活化含重组表达载体的农杆菌，与浅白隐球酵母菌液共培养，转移到含卡那霉素的筛选培养基上，获得具有卡那霉素抗性的转化子，经PCR和Southern分子鉴定，表明千年桐VeSAD基因已经插入浅白隐球酵母的基因组中。

2.根据权利要求1所述的高产油酸的浅白隐球酵母工程菌株的构建方法，其特征是：PCR扩增VeSAD基因含酶切位点cDNA编码区全长，根据在GenBank上登录的VeSAD基因核苷酸和氨基酸序列设计兼并引物，引物序列如下：

Vesad FP：GAT GTC GAC ATG GCA CTC AAG CT

Vesad RP：GAC GGT ACC TAA CAG CTG CAC TT

其中Vesad FP含酶切位点Sal I，Vesad RP含酶切位点Kpn I，以cDNA为模板，PCR扩增千年桐VeSAD基因cDNA编码区，扩增条件为：94℃预变性4min，94℃30S、58℃30S、72℃1min，30个循环，72℃延伸10min；扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

3.根据权利要求1所述的高产油酸的浅白隐球酵母工程菌株的构建方法，其特征是：所述的产油酵母表达载体pCAM2300-sad含有千年桐VeSAD基因。