CN103320333B - 携带染色体分散整合木糖基因的工业酿酒酵母重组菌株 - Google Patents
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Abstract
一株携带染色体分散整合木糖基因的工业酿酒酵母重组菌株，是不含任何筛选标记基因的工业酿酒酵母菌株ZQ3，属于微生物生物技术领域。该菌株分类命名为Saccharomyces cerevisiae，菌株的登记入册编号为CGMCC No：7509，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2013年4月22日。本发明还公开了重组菌株ZQ3的基因工程构建方法，包括三个外源木糖初始利用基因的获得，染色体整合载体的构建，以及菌株的混合糖生长实验。重组菌株ZQ3可以利用木糖作为碳源生长，且自身不携带任何抗生素筛选标记基因，故适合用于工业生产中。
Description
技术领域
本发明属于微生物生物技术领域，特别涉及一株具有木糖利用能力，且不含有任何筛选标记基因的工业酿酒酵母菌株。
背景技术
随着经济的快速发展，我国能源短缺问题不断突出。第二代生物乙醇以纤维素原材料，包括农作物秸秆，林业废弃物等发酵生产乙醇。与第一代生物乙醇不同之处在于，纤维素乙醇避免了与人争粮，与粮征地的弊端。我国拥有大量闲置的纤维素原材料，如果能够充分有效地利用这笔天然资源，变废为宝，既可以保护环境，保持农业的可持续发展，同时也可以降低我国对于进口石油能源的依赖和消耗。
木质纤维素原材料基本结构含有三个部分：纤维素，半纤维素和木质素，由复杂的多糖结构交织而成。纤维素水解液成分是葡萄糖，半纤维素水解液主要含有木糖。酿酒酵母作为工业乙醇发酵的首选出发菌株，具有较强的葡萄糖发酵能力，但是却不能利用木糖生长和发酵。因此，需要从天然木糖利用菌,包括细菌，假丝酵母和丝状真菌中克隆木糖代谢途径的相关基因，再利用基因工程手段将基因转入酿酒酵母，构建出可利用木糖作为碳源的木糖重组菌。常用的代谢工程改造方法是在酿酒酵母中表达毕赤酵母的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因，所获得的重组酵母菌可将木糖在NADPH依赖的木糖还原酶作用下还原为木糖醇，再经过NAD+依赖的木糖醇脱氢酶氧化下转为木酮糖，经过木酮糖激酶磷酸化形成5-磷酸木酮糖，进入酿酒酵母代谢。
国内外很多研究者几十年来专注于木糖重组菌构建的研究，但多采用多拷贝载体提高木糖代谢途径的酶活表达，也有选择整合载体以单一拷贝数结合于染色体上，前者载体大都为游离质粒载体，需要抗生素筛选，稳定性较差，且易丢失拷贝，不能在工业上稳定应用；后者因无法选择多个合适的筛选标记，所以一次性插入几个基因串联表达盒子来实现木糖的代谢，但是这种引入大片段外源基因的方式对宿主生长代谢产生较大影响。本发明利用pAUR135整合载体，该载体特点是完成染色体整合后自动删除抗性片段，只保留外源片段在染色体组上，不仅避免了利用抗生素选择，可稳定遗传，因此可以分别多次转入三个木糖初始利用基因，分别插入染色体的三个不同位点，这样得到的木糖重组菌相对过去的单一位点插入方式而言，可以尽量维持原宿主细胞的代谢平衡不受到影响，而且得到的木糖代谢酵母除了三个来自酵母的木糖代谢基因外，不带有任何其他外源片段，更适合用于大规模工业生产。
发明内容
本发明的目的在于构建一株可以利用木糖作为碳源的重组工业酿酒酵母菌株，从而可利用纤维素原料水解液中的木糖作为碳源。
本发明涉及一株携带染色体分散整合木糖基因的工业酿酒酵母重组菌株ZQ3，该菌株的登记入册编号为CGMCCNo：7509，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2013年4月 22日。含有木糖代谢途径的工业酿酒酵母菌株ZQ3，所述的菌株含有三个木糖利用基因：木糖还原酶基因PsXR，木糖脱氢酶PsXDH，木酮糖激酶基因ScXK，基因序列的GenBank登录号分别为X59465，AF127801.1，NM_001181323。PGK1启动子序列GenBank登录号为FJ415226.1，CYC1终止子序列GenBank登录号为EF210198.1。采用酿酒酵母第十六条染色体YPRCdelta15，YPRCtau3位点和第九条染色体YIRCdelta6位点整合，选择其上游500 bp-800 bp的序列作为同源臂进行同源整合。
本发明采用宝生物（大连）公司pAUR135载体（货号D3604）进行木糖代谢基因的整合表达，pAUR135 DNA可以利用载体本身的DNA序列将酿酒酵母转化子中的载体部分序列包括抗生素选择标记AUR1-C基因（赋予酵母菌金担子素Aureobasidin A，AbA抗性）去除，从而实现抗生素标记的循环利用。该载体上带有的GIN11M86基因在Gal10 启动子和半乳糖作用下过量表达，可以使用宿主致死，因此可用于载体除去型重组体的筛选，获得AbA敏感型的克隆（只含目的基因，完全没有任何外源其他片段）。
本发明的有益成果是：这株携带染色体分散整合木糖基因的工业酿酒酵母重组菌株ZQ3，该菌株含有三个木糖利用基因：木糖还原酶基因PsXR，木糖脱氢酶PsXDH，木酮糖激酶基因ScXK。采用酿酒酵母第十六条染色体YPRCdelta15，LTR(Long Tandem Repeat)位点整合，第十六条染色体YPRCtau3位点，第九染色体YIRCdelta6上下游500 bp-800 bp序列作为同源臂进行同源整合。该酿酒酵母木糖重组菌ZQ3可以利用木糖为碳源生长。
附图说明
图1、2、3是 pZQ3各个片段PCR扩增。
图4是木糖重组菌ZQ3串联载体构建。
图5、6、7是阳性转化子PCR鉴定。
图8是木糖重组菌ZQ3在25 g/l木糖、50 g/l葡萄糖中发酵结果。
具体实施方式
实施例1：含木糖初始代谢途径基因的工业酿酒酵母的构建和转化
本发明涉及的三个木糖初始利用基因序列来自于NCBI公共数据库，其中PsXR基因（EC: 1.1.1.2）的登录号是X59465； PsXDH基因（EC1.1.1.9）的登录号是AF127801.1； ScXK基因（EC 2.7.1.17）的登录号是NM_001181323。 PsXR和PsXDH基因的启动子都用PGK1启动子，ScXK使用ADH1启动子，三个基因都是用CYC1终止子作为终止子，并且三个基因分散连接在三个不同染色体整合载体上，载体分别如下：pAUR-20up-PGK1p-PsXR-CYC1t-20down，pAUR-21up-PGK1p-PsXDH
-CYC1t-21down，pAUR-12up-ADH1p-ScXK-CYC1t-12down，三个基因盒的每个片段之间分别以不同限制性内切酶位点连在一起，分别插入酵母第十六染色体YPRCdelta15位点，酵母第十六染色体YPRCtau3，酵母第九染色体YIRCdelta6。三个整合载体的抗生素选择性标记为氨苄青霉素（大肠杆菌）和金担子素（酿酒酵母），当将线性化载体电转入酿酒酵母S. cerevisiae 6525后，金担子素筛选标记基因会自动被删除，故在重组的ZQ3的染色体上无任何抗生素筛选标记基因存在。
1.1酿酒酵母基因组DNA提取
（1）将过夜培养的酵母菌液离心，12000 rpm，2 min，去上清；
（2）向沉淀加入480μL TE溶液（pH 8.0），20μL lysozyme（2mg/mL），震荡混匀后放入37℃摇床1.5小时；
（3）加入适量RNase A，再次放入37℃摇床0.5小时；
（4）从摇床中拿出，加入50μL 20%SDS溶液，5μL蛋白酶K（PK浓度为20μg/mL）混合震荡，55℃水浴锅中放置1h以上；
（5）离心将管盖上附着的液体收集到管底；加入500μL 苯酚:氯仿:乙戊醇（25: 24: 1），震荡混匀后，12000 rpm离心10分钟，取上清液，转新管；
（6）加入等体积异丙醇，放入-20℃冰箱1小时以上，沉淀DNA；
（7）12000 rpm 离心10分钟，去上清液, 加入1mL 70%乙醇，洗沉淀1—2次，12000 rpm离心8分钟,弃上清；
（8）37℃干燥后加入TE（pH 8.0） 50 μL溶解DNA，-20℃保存备用。
1.2 PCR扩增目标基因条带
以Pichia stipitis JCM 10742 基因组DNA作为模板扩增PsXR和PsXDH，以S. cerevisiae S288c 基因组DNA作为模板扩增ScXK，以S. cerevisiae 6525 的基因组DNA作为模板扩增上下游同源臂序列。引物序列和所扩增的序列如下表1所示。扩增后的片段通过引物上加的酶切位点，利用酶切连接方法连接，获得包含20up-PGK1p-PsXR-CYC1t-20down，21up-PGK1p-PsXDH-CYC1t-21down，12up-ADH1p-ScXK-CYC1t-12down，的三个基因盒的片段，并分别与载体pAUR135连接。
表 1 基因扩增引物信息
PCR反应体系如下（50μL）：
PCR 反应程序设置：
PCR结束后，产物用琼脂糖凝胶电泳检测片断大小是否符合。
1.3 目标片断纯化
Phusion高保真酶扩增片断为平末端，需要加上polyA才能和T 载体相连，所以片断纯化后再加polyA尾，以免加入的polyA尾被高保真酶切下。纯化反应用Omega试剂盒和TIANGEN试剂盒进行。
1.4目标片断加A尾（20 μL体系）
放在72℃水浴锅内反应20-30 min后拿出，试剂盒纯化后与载体连接
1.5与载体连接（10μL）
在连接仪中反应时间2-8小时，反应温度为22℃
1.6连接产物在大肠杆菌DH5α中转化
1.6.1大肠杆菌感受态细胞制备
（1）接种大肠杆菌DH5α于10 mL LB液体培养基中，37℃，220 rpm培养过夜；
（2）按1:100的比例转接过夜培养的菌液至50 mL 新鲜LB液体培养基中，37℃，220 rpm培养3-4 h，至OD600约等于0.6；
（3）将菌液转入在冰上预冷的50 mL离心管中，冰上放置30 min，4℃，4000 rpm离心5 min；
（4）弃上清，用预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液15 mL悬浮细胞，冰上放置30 min，4℃，4000 rpm离心5 min；
（5）重复上述步骤；
（6）用预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液2 mL悬浮细胞，加入2 mL预冷的30%甘油，轻轻混匀，分装成200 μL的小份，-76℃冻存。
1.6.2 连接产物的转化
（1） 从-76℃冰箱中取200 μL感受态细胞，冰上融化；
（2） 将连接产物全部加入感受态细胞中手指轻弹管底部,冰上放置30 min；
（3） 将细胞置于42℃水浴锅中热击90秒后迅速置于冰上冷却1.5min，然后再热击90秒，冰上冷却10 min；
（4） 向管中加入500 μL LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃ 振荡培养45 分钟到1小时；
（5） 4000 rpm离心5 min，去上清，将剩余溶液涂布于含相应抗生素的筛选平板上（氨苄青霉素终浓度100 mg/mL），正面向上放置半小时，待菌液完全晾干后倒置培养皿，37℃ 培养16-18小时；
（6） 挑菌落进行鉴定。
1.6.3 转化子质粒提取（所用溶液配制方法来源于Takara（大连）网站）
（1） 挑取转化平板上的克隆到添加有相应抗生素（氨苄青霉素终浓度100 mg/mL）的新鲜LB培养基中，37℃，220 rpm培养过夜；
（2） 取3 ml菌液于l.5 mL Eppendof管中，12000 rpm离心lmin，弃上清，收集沉淀菌体；
（3） 将沉淀重悬于100 μL冰上预冷的溶液Solution I中，涡旋震荡；
（4） 加入200 μl Solution II，轻轻颠倒离心管5次，使溶液混匀；
（5） 加入150 μL冰上预冷的溶液Solution III，上下颠倒数次，将离心管置于冰上，放置5 min；
（6） 4℃，12000 rpm离心10 min，留上清；
（7） 加入等体积（约500 μL）酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），充分震荡，12000 rpm离心10 min，将上清转移到新管中；
（8） 加入等体积预冷的异丙醇，上下颠倒充分混匀，于 -20℃放置30 min，12000 rpm离心10 min，弃上清；
（9） 用1 mL 70%乙醇洗涤沉淀，12000 rpm离心2 min，去除上清液，可以再重复一遍该洗涤过程，然后放置在室温中挥发剩余酒精；
（10） 加入适量含有RNaseA的蒸馏水或TE溶液溶解质粒DNA，37℃消化，-20℃冻存或直接用于后续实验。
1.6.4 酶切鉴定阳性转化子
扩增片断两端的限制性内切酶进行转化子的双酶切鉴定。双酶切体系来源可参考TARAKA与NEB网站。
1.7 片断拼接
因为基因片断都在克隆载体pMD-19T上，利用酶切将目标片断逐次连接起来，最后与在pAUR135整合载体相连。结果见图1,2,3,4。
实施例2：含木糖初始代谢途径基因的工业酿酒酵母的转化
酿酒酵母细胞转化方法如下：
2.1 酿酒酵母电转化感受态细胞的制备
（1）酵母接种YPD培养基，30℃，150 rpm培养12-14小时，然后转接新的YPD培养基（1%接种）过夜培养；
（2）次日，将培养瓶放在冰上至少15 min，让菌体停止生长。将50mL离心管，超纯水，1 M的山梨醇溶液都放在冰上预冷，处于低温状态；
（3）离心收集菌体，用等体积的超纯水将菌体轻轻混匀（上下颠倒晃动，不要用移液枪吹打），3000 g，5 min，4℃离心收集菌体，弃上清，重复此步骤两次；
（4）用20 mL预冷的1 M山梨醇溶液清洗菌体沉淀4次，最后一次用0.5 mL，1 M山梨醇溶液重悬酵母细胞，即为酵母感受态细胞，
2.2 电转法获得转化子
(1) 将感受态细胞分装至1.5 ml EP离心管中，加入3-5 ul 线性化质粒，用手指轻弹管底部混匀，放置冰上；
(2) 将40 ul感受态细胞和线性化质粒混合液加入0.2的电转杯中，冰浴5-10分钟;
(3) 设置酵母参数“fungi”，“Sc02”，点击Pulse；
(4) 取出电转杯，迅速加入1 ml 冰浴的山梨醇，用枪轻轻吹打，再转移至5 ml灭菌离心管中，30℃静置，孵育3 h；
（5）3000 g离心5分钟；
（6）浓缩，涂布含有2.5 ug/mL的YPD-Aba+平板。
（7）将平板于30℃培养箱培养，至酵母转化子克隆长出。
（8）第二轮筛选用YPGal平板，用牙签将首轮平板上的菌落挑到YPGal上，然后30℃培养16小时，能够长出的克隆则为已经整合到酵母染色体基因组上的阳性克隆。
（9）随机挑取12个菌落重新培养在YPD液体培养基中（不含任何抗生素），然后提基因组DNA，PCR验证基因的整合情况。结果见图5, 6,7。
实施例3：木糖重组菌ZQ3在不同木糖和葡萄糖浓度下发酵结果
野生型酵母S. cerevisiae 6525不消耗任何木糖，故只列出了ZQ3在25 g/L木糖和50 g/L葡萄糖浓度下的发酵结果。如图8所示，ZQ3可以在12天之内消耗完所有的木糖，表明其具有良好的木糖代谢能力。实验室的另一株重组菌ZQ1（携带串联整合载体）在25 g/L木糖和50g/L葡萄糖浓度下发酵时，在12天之内木糖只消耗了不到一半，说明分散整合方式得到的重组菌种发酵能力远远高于串联整合方式。
<110> 赵心清，左颀，白凤武
<120> 携带染色体分散整合木糖基因的工业酿酒酵母重组菌株
<141> 2013－07－03
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Claims (2)
1.一株携带染色体分散整合木糖基因的工业酿酒酵母重组菌株（Saccharomyces cerevisiae），其特征在于：所述菌株是不带有任何筛选标记基因的工业酿酒酵母菌株ZQ3，该菌株的登记入册编号为CGMCCNo：7509，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2013年4月22 日。
2.根据权利要求1所述的一株携带染色体分散整合木糖基因的工业酿酒酵母重组菌株应用于木糖生长。
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