CN104974945B

CN104974945B - 一种过表达mig1基因的酿酒酵母及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN104974945B
Application number: CN201510363139.7A
Authority: CN
Inventors: 胡世洋; 赵心清; 徐友海; 许建韧; 岳军; 程诚; 王继艳; 熊亮; 白凤武
Original assignee: Dalian University of Technology; Petrochina Co Ltd
Current assignee: Dalian University of Technology; Petrochina Co Ltd
Priority date: 2015-06-26
Filing date: 2015-06-26
Publication date: 2018-05-04
Anticipated expiration: 2035-06-26
Also published as: CN104974945A

Abstract

本发明提供了一种过表达MIG1基因的酿酒酵母及其制备方法与应用，本发明主要是利用基因工程技术在工业酿酒酵母中转入糖代谢转录因子制备得到一种过表达MIG1基因的木糖代谢工程菌，其具有在纯木糖培养基中发酵产生乙醇的能力，可以提高葡萄糖和木糖混合糖发酵生产燃料乙醇过程中乙醇收率。

Description

一种过表达MIG1基因的酿酒酵母及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种过表达MIG1基因的酿酒酵母及其制备方法与应用，主要是利用基因工程技术在工业酿酒酵母中转入糖代谢转录因子制备一种木糖代谢工程菌，以达到提高葡萄糖和木糖混合糖发酵生产燃料乙醇过程中乙醇收率的效果。

背景技术

利用生物技术对来源丰富、价格低廉的生物质进行生物转化，生产生物燃料和生物基化学品，具有环境友好、资源节约、可再生等特点，一直受到国内外研究者的普遍关注。生物质包括植物的茎、枝干、叶等木质纤维素类物质，农业废弃物(玉米秸秆、稻草、麦秸等)，甜菜等专门栽培作物，和各种城市废弃物等，其主要成分是纤维素和半纤维素等，这两者水解产生的发酵糖可通过微生物的生物转化生产燃料乙醇和多种生物基化学品。

木质纤维素水解的五碳糖和六碳糖主要是木糖和葡萄糖，而酿酒酵母体内没有代谢五碳糖的途径，所以不能充分利用木质纤维素水解液中的糖类，不适用于木质纤维素乙醇五碳糖六碳糖共发酵，通过基因工程手段可以导入木糖乙醇转化代谢途径：木糖还原酶-木糖醇脱氢酶途径和木糖异构酶途径，可以构建重组菌株，但仍然存在木糖不能有效利用、乙醇产量低等诸多问题，通过蛋白质工程、基因工程、进化工程等多种手段疏通木糖代谢途径，改善菌株发酵性能，从而达到木质纤维素水解产物有效转化成乙醇，已经成为第二代生物乙醇的研究重点。

酿酒酵母由于乙醇发酵性能好，具有生物安全性、容易进行菌种改良等很多优点，已成为生物燃料生产的首选菌种。木质纤维素乙醇发酵过程中，生产菌株对多种环境胁迫的耐受性对菌株的发酵性能具有重要的影响。同步糖化发酵和联合生物加工等均需要高温条件以达到较高的酶解效率，但较高温度对酿酒酵母细胞生长产生抑制，而且影响乙醇发酵性能。因此，提高菌株的耐高温性能，有利于菌株在高温下具有良好的发酵活性。

MIG1基因是负责葡萄糖阻遏的转录因子，在葡萄糖存在条件下，该基因的编码产物可结合在目标基因的启动子区域，在葡萄糖没有被利用完之前，其他糖类如甘露糖、蔗糖、半乳糖和木糖代谢的基因的表达就一直被阻遏，这些甘露糖、蔗糖、半乳糖和木糖就不能被利用。有研究者比较了重组酿酒酵母TMB3001的MIG1基因敲除的突变体与野生型菌株的乙醇发酵性能，发现在分批式发酵过程中二者没有明显差别，但在连续发酵过程中，MIG1基因敲除突变体比对照菌株木糖消耗速率提高了25％，乙醇产率从对照菌的0.475g/L·h提高到MIG1基因敲除突变体的0.6g/L·h。但过表达该基因的突变体对混合糖发酵的性能还未见报道。

发明内容

本案发明人基于在絮凝酵母SPSC01中发现的MIG1基因，发现了该基因过表达可影响木糖利用、乙醇收率及副产物甘油、木糖醇和乙酸的产量。

一方面，本发明提供了一种过表达MIG1基因的酿酒酵母。

根据本发明的具体实施方案，本发明以工业自絮凝酵母菌株SPSC01来源的MIG1基因为基础，构建了MIG1基因过表达的酿酒酵母。来自工业自絮凝酵母菌株SPSC01的葡萄糖阻遏转录因子基因MIG1具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列，其编码的蛋白氨基酸序列参见SEQ ID No.2。

本发明的相关实验证明，在酿酒酵母中过表达具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的MIG1基因，可以提高酿酒酵母在葡萄糖和木糖混合糖发酵生产乙醇过程中乙醇收率，降低副产物乙酸和甘油产量；还可以使酿酒酵母具备在糖类主要为木糖的培养基中发酵产生乙醇的能力，同时可提高其在纯木糖培养基中发酵产生的木糖醇的得率。本发明的过表达MIG1基因的酿酒酵母为木糖代谢工程菌。

在本发明的一具体实施方式中，本发明以工业自絮凝酵母菌株SPSC01为出发菌株，通过基因工程技术的链式聚合酶反应(PCR技术)扩增工业自絮凝酵母菌株SPSC01的葡萄糖阻遏转录因子基因MIG1(所述MIG1基因具有如SEQ ID No.1所示序列，其编码的蛋白氨基酸序列参见SEQ ID No.2)，并将其连接到酵母HO基础整合载体的PGK1强启动子和CYC1终止子之间构建携带MIG1基因的质粒(HO-MIG1-SPSC01表达载体，参见实施例1)，构建的质粒经过感受态细胞DH5α转化与质粒的线性化后电转导入到木糖代谢工程菌ZQ5中构建成过表达MIG1基因的木糖代谢工程菌ZQ5(本发明中将过表达MIG1基因的ZQ5命名为ZQ5-OE035)，在工程菌ZQ5的基因组HO基因位点(Yeast,1997,13：1563～1573)上整合过表达木糖代谢途径。其中，所述ZQ5菌株为染色体整合表达木糖代谢途径的专利菌株(参见ZL201310164960.7)，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.7463，保藏日期为2013年4月11日。本发明通过在重组酿酒酵母ZQ5中过表达所述具有如SEQ ID No.1所示序列的葡萄糖阻遏转录因子MIG1，可使酿酒酵母具有耐高温和木糖利用优势。特别是，本发明所获得的ZQ5-OE035具有更为显著的耐热胁迫和代谢木糖的生长优势，并在混合糖发酵条件下，可改善发酵产物代谢流走向和提高乙醇得率。本发明的工程菌ZQ5-OE035已于2014年5月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号：CGMCC No.9259；分类命名：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae。

在本发明的具体实施方式中，本发明还构建了过表达所述MIG1基因的自絮凝酿酒酵母SPSC(本发明中将过表达MIG1基因的SPSC命名为SPSC-OE035)，该过表达MIG1基因的自絮凝酿酒酵母SPSC同样的表现出了优异的在糖类以木糖为主的培养基中发酵生产乙醇的能力，且同时可提高酿酒酵母在糖类以木糖为主的培养基中发酵产生的木糖醇的得率。

本发明中，所述的糖类以木糖为主的培养基是指培养基中的糖类(特别是五碳糖和六碳糖)以木糖为主，例如木糖含量占培养基中五碳糖和六碳糖总和的50％以上，优选是70％以上，进一步优选是80％以上，更优选是90％以上甚至95％以上。

从而，另一方面，本发明还提供了所述的过表达MIG1基因的酿酒酵母的制备方法，该方法包括：

构建携带MIG1基因的表达载体，转化至酿酒酵母感受态细胞中，构建成过表达MIG1基因的酿酒酵母。

根据本发明的具体实施方案，本发明的过表达MIG1基因的酿酒酵母的制备方法包括：

(1)构建HO-MIG1-SPSC01表达载体：提取自絮凝酵母SPSC01(CGMCC No.0587)基因组的DNA，扩增聚合酶链式MIG1-SPSC01基因，目的基因片段与HO载体骨架酶切和连接，得到HO-MIG1-SPSC01表达载体；进一步，可将连接产物转化感受态细胞到大肠杆菌DH5α，验证阳性克隆；

(2)构建过表达MIG1-SPSC01基因的酿酒酵母：Not I酶线性化HO-MIG1-SPSC01表达载体，转化至酿酒酵母感受态细胞中，培养，挑选酵母阳性转化子，得到过表达MIG1基因的酿酒酵母。

本发明还提供了一种携带MIG1基因的表达载体，其是将具有如SEQ ID No.1所示序列的MIG1基因连接到酵母HO基础整合载体的PGK1强启动子和CYC1终止子之间而制备得到的。

由于本发明所获得的过表达MIG1基因的酿酒酵母具有更为显著的耐热胁迫和代谢木糖的生长优势，并在混合糖发酵条件下，可改善发酵产物代谢流走向和提高乙醇得率，据此，本发明还提供了所述的过表达MIG1基因的酿酒酵母在代谢木糖中的应用，例如其在代谢木糖生产乙醇和/或木糖醇中的应用；还提供了所述的过表达MIG1基因的酿酒酵母在混合糖发酵生产乙醇中的应用。具体应用时，所述混合糖可包括葡萄糖和木糖，优选地，发酵培养基中，初始葡萄糖与木糖含量比例为1:1～5:1，更优选为2:1～3:1。更优选地，发酵培养基中，初始木糖浓度为10g/L～40g/L，优选为15g/L～30g/L，更优选为20g/L～30g/L。发酵培养基中除糖类外的其他组分可参照现有技术确定。

根据本发明的一具体实施方案，本发明利用所述的木糖代谢工程菌ZQ5-OE035改造酿酒酵母与对照菌株相比，在葡萄糖和木糖比例为2:1和3:1的发酵培养基中，在温度30℃，150rpm下进行乙醇发酵，ZQ5-OE035的乙醇收率分别为44％和46％，乙醇得率提高了4.76％和6.98％，乙酸产量分别下降95％和97％，甘油产量分别下降95％和30％，ZQ5-OE035菌株生长良好。利用纯木糖培养基，ZQ5-OE035改造酿酒酵母与对照菌株相比，具有良好的高温耐性和细胞生长能力，同时在木糖乙醇发酵(30℃，150rpm)中，能够产出乙醇，自絮凝工业酿酒酵母SPSC01的空载和MIG1基因过表达菌株(SPSC01-OE035)重复了这一结果(见表2)。

本发明的有益效果：

在木糖途径改造的工程菌中，过表达葡萄糖阻遏转录因子MIG1，使其能够提高木糖工程菌株ZQ5在42℃的耐热性和在20g/L纯木糖平板上生长。在混合糖发酵中，过表达MIG1基因的工程菌ZQ5的副产物乙酸和甘油产量均明显下降，改变了木糖工程菌株的代谢流，在72h发酵周期内，过表达MIG1基因的工程菌ZQ5在不同比例混合糖摇瓶发酵中乙醇收率均高于对照菌株。过表达MIG1基因的自絮凝工业酿酒酵母SPSC也表现出了良好的利用木糖发酵产出乙醇的技术效果。

附图说明

图1：目的基因电泳图片。其中，M：1kb DNA分子量标准；泳道1：MIG1基因条带。

图2：携带目的基因MIG1的质粒构建图。

图3：不同来源的MIG1基因位点比较图。

图4：目的基因整合位点示意图。

图5：目的基因线性化电泳图片。其中，M：1kb DNA分子量标准；泳道1：MIG1整合验证条带。

图6：空载质粒电泳图片。其中，M：1kb DNA分子量标准；泳道1：HO空载骨架整合验证条带。

图7：ZQ5空载对照菌株和木糖代谢工程菌ZQ5-OE035在高温平板和纯木糖平板的生长比较。其中，图片(1:)：30℃，正常YPD固体培养基；图片(2:)：42℃，正常YPD固体培养基；图片(3:)：30℃，纯木糖固体培养基；图片(4:)：41℃，纯木糖固体培养基。

图8：在不同混合糖比例下ZQ5空载对照菌株和木糖代谢工程菌ZQ5-OE035其发酵过程中甘油产量情况。

图9：在不同混合糖比例下ZQ5空载对照菌株和木糖代谢工程菌ZQ5-OE035其发酵过程中乙酸产量情况。

图10：在纯木糖发酵培养中对照与过表达O035突变体在纯木糖的乙醇产量情况。

用于专利程序的微生物保存：

保藏日期：2014年05月30日；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101

保藏编号：CGMCC No.9259；

分类命名：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步详细说明本发明的木糖代谢工程菌及其特点和应用中所具有的技术效果，但本发明并不因此而受到任何限制。

实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。

实施例1、一种木糖代谢工程菌ZQ5-OE035的制备

步骤1构建HO-MIG1-SPSC01表达载体

1.1自絮凝酵母SPSC01基因组DNA提取

(1)将YPD培养基过夜培养(30℃，150rpm)的SPSC01菌(CGMCC No.0587，大连理工大学生命学院生物过程工程实验室)菌液离心(12000rpm，5min)，收集细胞。

(2)加入0.1mol/L的柠檬酸钠缓冲液解絮SPSC01菌，摇晃均匀。

(3)无菌水清洗细胞两遍，离心(12000rpm,5min)，收集细胞。

(4)用适量裂解液(0.1mol/LTris-盐酸，pH 8.0；50mmol/L乙二胺四乙酸，pH 8.0；1％十二烷基硫酸钠)再次悬浮细胞，随后加入干净0.5毫米规格的玻璃珠和25μL(5mol/L浓度)NaCl溶液。

(5)美国SI Vortex-Genie2涡旋振荡器2000rpm高速震荡10min，12000rpm，离心5min。

(6)转移上清至洁净离心管中，加入500μL苯酚，充分震荡，12000rpm，离心5min。

(7)转移上清至洁净离心管中，加入500μL苯酚、氯仿、异戊醇混合液，其中苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1(体积比)，充分震荡，离心，取上清。

(8)加入1mL预冷的无水乙醇，-20℃沉淀1h，12000rpm，离心5min，弃上清。

(9)加入1mL 70％乙醇，-20℃沉淀20min，12000rpm，离心5min，弃上清。

(10)自然风干，加入30μL TE缓冲液(10mmol/L Tris-盐酸,pH 8.0；1mmol/L乙二胺四乙酸)，充分溶解。

(11)加入适量RNA酶，37℃，水浴30min；得到提取好的自絮凝酵母SPSC01的基因组DNA，-20℃保存备用。

1.2聚合酶链式扩增MIG1-SPSC01基因

(1)引物设计：

依据酵母基因组数据库中实验室酵母菌株S288c的MIG1基因序列(GenBank登录号51013768)，设计扩增引物，在上下游引物的5’端分别引入Xma I和Pac I酶切位点。

引物序列如下：

MIG1-上游引物：5’-AAACCCGGGATGCAAAGCCCATATCCAATG-3’(SEQ ID No.3)；

MIG1-下游引物：5’-CCCTTAATTAATCAGTCCATGTGTGGGAAG-3’(SEQ ID No.4)；

带有下划线的引物序列为限制性酶切位点。

(2)以前述提取的自絮凝酵母SPSC01的基因组DNA为模板，扩增MIG1基因。

聚合酶链式反应体系如下：

聚合酶链式反应条件如下：

94℃预变性5min；

94℃变性45s，

55℃复性45s，

72℃延伸1min 50s，共30个循环；

最后72℃延伸10min。

将聚合酶链式产物用DNA纯化试剂盒进行纯化，结果见图1，得到预计大小的扩增产物。

1.3目的基因片段与HO载体骨架酶切和连接

本实验中，是将前述扩增得到的MIG1基因连接到酵母HO基础整合载体(NCBI：#AF324728，美国Utah大学David J.Stillman；“Yeast vectors for integration at theHO locus”Nucleic acids research，2001,29：e59)的PGK1强启动子和CYC1终止子之间，构建携带MIG1基因的质粒载体。其中：

酶切反应体系如下：

37℃温育反应2h。Omega D2500-02凝胶回收试剂盒纯化DNA片段。

连接反应体系如下：

16℃过夜反应(12h以上)，构建得到MIG1基因与HO载体的连接产物，即携带MIG1基因的质粒载体(见图2)。反应结束后，连接产物立即放置-20℃冰箱冷冻保存。

1.4连接产物转化感受态细胞大肠杆菌DH5α

感受态细胞制备：

(1)将冻存的大肠杆菌DH5α甘油菌(购自大连宝生物公司)，在LB平板培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉2％)上划线，37℃，过夜培养。

(2)挑取LB平板上的大肠杆菌DH5α单菌落，转接LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L)，在37℃，200rpm，过夜培养。

(3)取1mL过夜培养的菌液，接种于100mL LB培养基中，在37℃、250rpm，剧烈振荡培养3h左右，以波长620nm下的吸光值达到0.4～0.6。

(4)将菌液置于冰上冷却15min，使菌体停止生长。

(5)取40mL菌液至冰上预冷的50mL离心管中，4℃，5000rpm，离心10min，弃上清，将离心管倒置1min，去除残留的培养基。

(6)加入30mL冰预冷的0.1mol/L的氯化钙溶液重悬菌体，在冰上放置20min。

(7)在4℃，5000rpm离心10min，弃上清，倒置1min，去除残留的液体。

(8)加入2mL冰预冷的0.1mol/L的氯化钙溶液，用移液枪轻轻混匀重悬菌体。

(9)菌体悬液可立即用于转化实验，或者添加甘油(终浓度为20％)，每管200μL分装，-70℃冻存。

热激转化：

(1)取200μL冻存的大肠杆菌DH5α感受态细胞放置冰上融解，加入10μL前述制备得到的MIG1基因与酿酒酵母整合载体的连接产物，用移液枪轻轻混匀，在冰上放置30min。

(2)然后将感受态细胞放入42℃的水浴中热激90s。注意控制好热激的温度和时间。

(3)快速把感受态细胞放入冰浴中，冷却2min。

(4)加入800μL LB培养基，在37℃振荡培养1h，使菌体细胞复苏，表达质粒编码的抗生素抗性基因。

(5)取适量转化后的感受态细胞，涂布在含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，待液体全部吸收之后，在37℃倒置培养12h～16h，可以观察到菌落。

1.5阳性克隆的验证

转化子质粒提取：

(1)将平板上的单菌落接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃、200rpm的条件下过夜培养。

(2)取4mL菌液，12000rpm离心1min收集菌体，弃上清，加入100μL的溶液一(25mmol/L Tris-盐酸，pH 8.0；10mmol/L乙二胺四乙酸；50mmol/L葡萄糖)，剧烈振荡使菌体充分悬浮。

(3)加入200μL的溶液二(200mmol/L的氢氧化钠；1％十二烷基硫酸钠)，上下颠倒5次～7次，充分裂解菌体。

(4)加入150μL预冷的溶液三(3mol/L的乙酸钾；5mmol/L的乙酸)，出现白色沉淀，上下颠倒5次～7次，混合均匀，冰上静置10min。

(5)在4℃，12000rpm，离心10min，将上清转移至干净的离心管中，加入等体积的苯酚、氯仿、异戊醇混合液，其中苯酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1(体积比)，充分振荡混匀。

(6)在4℃，12000rpm，离心10min，用移液枪将上清转移至干净的离心管中，不要吸到中间层的白色沉淀。

(7)加入2倍体积预冷的无水乙醇，混合均匀，在-20℃放置20min，沉淀DNA。

(8)在4℃，12000rpm，离心10min，弃上清，用70％的乙醇漂洗沉淀2次。

(9)室温放置5min使乙醇挥发，用50μL TE缓冲液溶解质粒。

(10)加入1μL 10mg/mL RNA酶，在37℃温育30min，消化RNA，-20℃保存。

质粒聚合酶链式鉴定阳性转化子：

验证引物与扩增引物相同，模板替换成所提取的质粒。

聚合酶链式反应体系如下：

聚合酶链式反应条件如下：

94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min 45s，共30个循环；最后72℃延伸10min。

DNA凝胶电泳检测，显示有预计大小的目的片段。

1.6两个氨基酸位点差异

经测序，与模式酵母S288c的MIG1基因相比，SPSC01来源的MIG1基因(本发明中亦将SPSC01来源的MIG1基因称为MIG1-SPSC01基因)具有三处碱基差异(参见SEQ ID No.1，第212位碱基由C变为T；第409位碱基由C变为T；第1196位碱基由T变为C)，从而具有两处氨基酸差异(参见SEQ ID No.2，71位：脯氨酸变为亮氨酸；399位：苯丙氨酸变为丝氨酸)。见图3。

步骤2构建过表达MIG1-SPSC01基因的酿酒酵母

2.1Not I酶线性化HO-MIG1-SPSC01表达载体

将步骤“1.3目的基因片段与HO载体骨架酶切和连接”制得的连接产物用Not I酶切使其线性化，切胶回收含SPSC01 MIG1基因的整合表达片段(图4)。

酶切反应体系如下：

37℃水浴反应2h。Omega D2500-02凝胶回收试剂盒纯化DNA片段，得到待转化的线性化HO-MIG1-SPSC01表达载体。

2.2酿酒酵母感受态制备和转化

酵母感受态细胞的制备：

(1)取酿酒酵母ZQ5斜面菌种适量，接种于YPD培养基中，在30℃，150rpm，振荡过夜培养。

(2)取活化后的酵母菌种5mL，转接入装有100mL YPD培养基的500mL摇瓶中，在30℃，250rpm，振荡培养，使每毫升的细胞密度达到10⁸左右。

(3)将酵母菌液置于冰上冷却15min，使其停止生长。

(4)用预冷的50mL离心管，在4℃，5000rpm，离心5min，分两次收集80mL的酵母细胞，将培养基去除干净，置于冰上。

(5)用冰预冷的40mL超纯水重悬菌体，4℃，5000rpm，离心5min，弃上清，重复上述操作。

(6)加入20mL无菌的冰预冷山梨醇(1mol/L)，4℃，5000rpm，离心5min，弃上清，重复操作。

(7)加入700μL冰冷的山梨醇(1mol/L)，用移液枪轻轻混匀，置于冰上，迅速进行转化。

美国伯乐公司电转仪的酵母转化：

(1)在制备电感受态细胞之前，将电转杯超声洗净，用超纯水漂洗后，加入无水乙醇，把剩余的水分去除，最后用紫外照射15min并通风吹干。

(2)取一定量的酵母电感受态细胞，加入步骤2.1事先制备纯化好的待转化的线性化DNA片段(0.2cm电转杯，细胞40μL，DNA 5μL；0.4cm电转杯，细胞80μL，DNA 10μL)，用移液枪轻轻混匀，冰上放置5min。

(3)然后加入到预冷的电转杯中，选择对应的程序进行电击操作。

(4)立刻加入1mL冰预冷山梨醇(1mol/L)冲洗电转杯，将酵母细胞悬液转移到1.5mL的离心管中，在30℃静置温育2h。

(5)将酵母细胞离心浓缩，涂布于YPD平板上(G418 300μg/mL，山梨醇1mol/L)，在30℃培养48h，可以看到转化的菌落。

2.3酵母阳性转化子验证

挑选平板上的菌落进行PCR反应，然后进行DNA凝胶电泳验证目的片段。

验证引物如下：

验证-MIG1-上游引物：5’-TCATAGACGGTCCTGAACAGAAACAACT-3’(SEQ ID No.5)；

验证-MIG1-下游引物：5’-GAAAGAAGAACCTCAGTGGCAAATC-3’(SEQ ID No.6)；

空载验证上游引物：5’-GAATACCCTCCTTGACAGTCTTGAC-3’(SEQ ID No.7)；

空载验证下游引物：5’-ATAGCGACCAGCATTCACATACGAT-3’(SEQ ID No.8)。

菌落基因组DNA提取：

(1)用灭菌的牙签挑取单菌落进行YPD液体过夜培养。

(2)取20μL菌液，12000rpm，离心2min，收集细胞。

(3)弃上清，加50μL灭菌水悬浮，同上离心，进行洗涤。

(4)加入20μL灭菌水，充分悬浮，99℃，煮沸10min。

(5)4℃，12000rpm，离心5min，取上清4μL做聚合酶链式反应。

聚合酶链式反应体系如下：

聚合酶链式反应条件如下：

94℃预变性5min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸1min 30s，共30个循环；最后72℃延伸10min。

DNA凝胶电泳检测目的片段大小。

结果见图5(通过MIG1基因整合的验证引物扩增出特异性的DNA条带，如图中箭头所示，这种特异性的PCR反应不能从没有整合目的基因的对照菌株中获得，从而证明转化子为阳性)和图6(通过HO空载骨架整合的验证引物扩增出特异性的DNA条带，如图中箭头所示，证明转化子为阳性)。

本发明中，将其中一株酵母阳性转化子命名为工程菌ZQ5-OE035，并于2014年5月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号：CGMCC No.9259；分类命名：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae。

本发明中，还参照上述构建ZQ5-OE035的方法，将酿酒酵母ZQ5替换为SPSC01菌(CGMCC No.0587，大连理工大学生命学院生物过程工程实验室)，构建了过表达所述MIG1基因的自絮凝酿酒酵母SPSC(本发明中将过表达MIG1基因的SPSC命名为SPSC-OE035)。

实施例2、木糖代谢工程菌ZQ5-OE035能够提高木糖菌株的耐热性和在纯木糖平板的生长状况

ZQ5空载对照菌株和木糖代谢工程菌ZQ5-OE035在高温平板的生长比较

(1)将ZQ5空载对照菌株与过表达MIG1菌株ZQ5-OE035接种在添加有G418 100μg/mL的YPD液体培养基(10g/L酵母浸粉，20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨)中，过夜培养，30℃，150rpm。

(2)同上(同实施例2的步骤(1))，10％体积转接继续培养，扩大至30mLYPD液体培养基中，保证连续培养，保持细胞活力。

(3)测定并用新鲜YPD液体培养基在波长620nm下的吸光值为零点，以10％的接种量分别转接至新鲜YPD培养基中，继续培养4h～5h，在波长620nm下吸光值达到0.8～1.3左右。

(4)在波长620nm下分别取1mL菌液，用0.1mol/L的柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0)调节菌液使其吸光值达到0.5。

(5)使用0.1mol/L的柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0)进行5倍梯度稀释。

(6)2μL点样于YPD固体平板上(10g/L酵母浸粉，20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，20g/L琼脂粉)。

(7)30℃和42℃培养箱中倒置培养，待菌落长出后观察并拍照如图7所示。

ZQ5空载对照菌株和木糖代谢工程菌ZQ5-OE035在纯木糖平板的生长比较

采用常规的生长比较方法，通过梯度稀释比较生长的差异，菌落中细胞浓的表示生长好。具体操作为：

(1)前5步同上述“ZQ5空载对照菌株和木糖代谢工程菌ZQ5-OE035在高温平板的生长比较”中的(1)，(2)，(3)，(4)，(5)。

(2)2μL点样于YP-木糖固体平板上(10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，20g/L木糖，20g/L琼脂粉)。

(3)30℃倒置培养，待菌落长出后观察并拍照如图7所示。

在正常条件下(30℃，YPD固体平板)，ZQ5空载对照菌株与木糖代谢工程菌ZQ5-OE035没有差异，能够正常生长，见图7中的图片(1)。在高温(42℃，YPD固体平板)胁迫条件下，木糖代谢工程菌ZQ5-OE035的生长好于ZQ5空载对照菌株，见图7中的图片(2)。在纯木糖平板(30℃，YP-木糖固体平板)培养条件下，木糖代谢工程菌ZQ5-OE035明显好于ZQ5空载对照菌株，见图7中的图片(3)。在高温(41℃，YP-木糖固体平板)胁迫条件下，木糖代谢工程菌ZQ5-OE035的生长好于ZQ5空载对照菌株，见图7中的图片(4)。

实施例3、空载对照菌株与木糖代谢工程菌在混合糖和纯木糖中的摇瓶发酵性能对比

1、ZQ5空载对照菌株与木糖代谢工程菌ZQ5-OE035在混合糖中的发酵性能对比

(1)将ZQ5空载对照菌株与过表达MIG1菌株ZQ5-OE035接种在添加有G418 100μg/mL的5mL的YPD种子培养基(10g/L酵母浸粉，20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨)中，过夜培养，30℃，150rpm。

(2)同1，扩大至150mLYPD液体培养基中。

(3)测定并用新鲜YPD液体培养基在波长620nm下的吸光值(OD值)为零点，以10％的接种量分别转接至新鲜YPD培养基中，继续培养6h，使菌株的生长保持良好状态。

(4)用灭菌的50mL离心管，10000rpm,5min，收集菌体。

(5)用灭菌超纯水洗涤细胞3遍～5遍，用枪头吸取多余上清，称湿重，保证每管3.0克湿菌体。

(6)将湿菌体接种于混合糖(葡萄糖:木糖)2:1和3:1的发酵培养基中，其中混合糖2:1发酵培养基组成为：酵母浸粉4g/L，蛋白胨3g/L，葡萄糖40g/L，木糖20g/L；混合糖3:1发酵配养基组成为：酵母浸粉4g/L，蛋白胨3g/L，葡萄糖90g/L，木糖30g/L；纯木糖发酵培养基中，碳源只有木糖20g/L，其他成分与混合糖发酵培养基相同。在温度30℃，150rpm下进行发酵。

与对照菌株相比，重组酵母在混合糖培养基中的细胞生长略好，OD值最大提高约0.3。重组酵母和对照菌株均在6h消耗净所有的葡萄糖，而木糖消耗速率较慢，在初始木糖浓度分别为20g/L和30g/L的条件下，两株酵母的发酵情况见表1。

表1ZQ5与ZQ5～OE035在不同比例混合糖发酵中的糖消耗和产物得率情况

注：乙醇收率＝[EtOH]_max/[sugar]_consumed，式中[EtOH]_max为发酵过程中最大乙醇含量，[sugar]_consumed为发酵所消耗的总糖。消耗木糖、木糖醇产量和乙酸、甘油产量均为发酵结束(72h)时的数值。

图8显示在不同混合糖比例下ZQ5空载对照菌株和木糖代谢工程菌ZQ5-OE035其发酵过程中甘油产量情况。图9显示在不同混合糖比例下ZQ5空载对照菌株和木糖代谢工程菌ZQ5-OE035其发酵过程中乙酸产量情况。

本发明利用所述的木糖代谢工程菌ZQ5-OE035改造酿酒酵母与对照菌株相比，在葡萄糖和木糖比例为2:1和3:1的发酵培养基中，乙醇得率分别提高了4.76％和6.98％，副产物乙酸产量分别下降95％和97％，甘油产量分别下降95％和30％。

2、空载对照菌株与木糖代谢工程菌在纯木糖中的发酵性能对比

本发明利用所述的木糖代谢工程菌ZQ5-OE035和SPSC-OE035改造酿酒酵母与对照菌株ZQ5、SPSC相比，在纯木糖培养基中培养，其他培养条件同上述本实施例中的混合糖发酵条件。各菌株60h发酵性能比较参见表2。另，图10显示了ZQ5与ZQ5-OE035在纯木糖发酵培养72h过程中乙醇产量情况。

表2对照与过表达MIG1基因酿酒酵母在纯木糖的发酵性能比较

从表2结果可以看出，本发明利用所述过表达MIG1基因的改造酿酒酵母与对照菌株相比，在纯木糖培养基中可产生乙醇，而对照菌株乙醇未检测到，再次证明该过表达MIG1基因的重组菌株利用木糖能力的有利结果。

Claims

1.一种过表达MIG1基因的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其是保藏编号为CGMCC No.9259的木糖代谢工程菌。

2.权利要求1所述的过表达MIG1基因的酿酒酵母的制备方法，该方法包括：

构建携带MIG1基因的表达载体，转化至酿酒酵母ZQ5感受态细胞中，构建成过表达MIG1基因的酿酒酵母。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述携带MIG1基因的表达载体是将如SEQ IDNo.1所示序列的MIG1基因连接到酵母HO基础整合载体的PGK1强启动子和CYC1终止子之间而制备得到的。

4.权利要求1所述的过表达MIG1基因的酿酒酵母在代谢木糖生产乙醇和/或木糖醇中的应用。

5.权利要求1所述的过表达MIG1基因的酿酒酵母在混合糖发酵生产乙醇中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述混合糖是葡萄糖和木糖，葡萄糖与木糖比例为1:1～5:1。

7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述葡萄糖与木糖比例为2:1～3:1。

8.根据权利要求4～7任一项所述的应用，其中，发酵培养基中，初始木糖浓度为10g/L～40g/L。

9.根据权利要求8所述的应用，其中，发酵培养基中，初始木糖浓度为15g/L～30g/L。