CN105602862B

CN105602862B - 一株高乙醇耐受性基因工程菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN105602862B
Application number: CN201610166254.XA
Authority: CN
Inventors: 应汉杰; 郑诚; 陈勇
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2016-03-22
Filing date: 2016-03-22
Publication date: 2019-11-26
Anticipated expiration: 2036-03-22
Also published as: CN105602862A

Abstract

本发明公开了一株高乙醇耐受性基因工程菌，它是过表达转录调控因子Mig1基因的酿酒酵母菌，所述的Mig1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1中所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述的酿酒酵母菌为Saccharomyces cerevisiae S288c。本发明还公开了上述高乙醇耐受性基因工程菌的构建方法及应用。本发明构建的高乙醇耐受性基因工程菌在固定化发酵生产乙醇过程中能耐受15％浓度的乙醇，耗糖速率是原始菌株的1.30倍，提高了生物膜反应器中菌体的乙醇耐受性，适宜工业乙醇生产。

Description

一株高乙醇耐受性基因工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株高乙醇耐受性的基因工程酵母菌及其构建方法与应用。

背景技术

能源是现代经济发展的血液，而目前能源的主体是不可再生的化石资源。随着现在经济的飞速发展，能源消耗越来越大，进而促进经济发展的化石资源被大量的开采和利用。然而全球化石资源储量日益减少，此外，化石资源的开发利用的负面影响非常大，如环境污染严重，全球气候变暖等。因此，新能源的开发迫在眉睫。用生物质能源替代化石能源不失为解决能源危机和环境压力的一种很好的途径。使用廉价的生物质作为能源，可以有效的降低石油资源对世界经济发展的制约和化石能源消耗所造成的环境污染问题，从长远战略上看，生物质能源将成为可再生资源的重要组成部分，是化石能源与新能源之间的过度。生物燃料是可替代汽油的可再生清洁能源，主要有生物柴油，生物乙醇和生物丁醇。

酵母发酵产乙醇是工业发酵生产乙醇的主要途径之一，而利用细胞表面固定化技术的生物膜反应器生产乙醇是当前工业上乙醇生产的一种优秀形式。生物膜反应器相比于传统的游离发酵的优势在于其优秀的抗逆性，不仅能够耐受较高的初糖浓度，并且能在较高的乙醇产物浓度中生长。这在工业发酵应用上有着重大的意义。传统游离发酵中，适合发酵的乙醇浓度一般在10％(v/v)左右，而在固定化发酵中，酵母菌能在超过15％(v/v)的乙醇浓度下生长。生物膜反应器是基于生物膜的应用，研究表明，生物膜的形成能力与乙醇耐受性有很大的联系。因此，对生物膜形成的机制研究，及通过基因工程技术构建高乙醇耐受性的酵母菌株，对于工业乙醇的发酵生产有着重大的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一株高乙醇耐受性的酵母基因工程菌。

本发明还要解决的技术问题是，提供上述高乙醇耐受性的酵母基因工程菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是，提供上述高乙醇耐受性的酵母基因工程菌在乙醇发酵中的应用。

为解决上述技术问题，提供如下技术方案：

一株高乙醇耐受性基因工程菌，它是过表达转录调控因子锌指蛋白(Mig1)基因的酿酒酵母菌。锌指蛋白通过结合粘附素蛋白Flo11的启动子，来调控此粘附素蛋白的转录。粘附素蛋白在生物膜形成中起决定性作用。因此调控锌指蛋白能够调控生物膜形成，从而影响菌株乙醇耐受性。

所述的锌指蛋白Mig1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1中所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述的酿酒酵母菌为Saccharomyces cerevisiae S288c。

上述高乙醇耐受性基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)提取酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288c的基因组DNA；

(2)以步骤(1)得到的该基因组DNA为模板，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列为引物，PCR得Mig1基因；

(3)将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列克隆到表达质粒pYX-AurR中，得到重组质粒；

(4)将步骤(3)得到的重组质粒转化宿主菌，所述的宿主菌为Saccharomycescerevisiae S288c，即得到表达转录调控因子Mig1的基因工程菌。

上述高乙醇耐受性基因工程菌在乙醇发酵生产中的应用在本发明的保护范围之中。

利用上述高乙醇耐受性基因工程菌发酵生产乙醇的方法，包括如下步骤：

(1a)将酿酒酵母接种到培养基中，培养，得到种子液；

(2a)将步骤(1a)中得到的种子液接种到含固定化载体的摇瓶中，固定化长膜；

(3a)将步骤(2a)中得到的已成膜完全的固定化载体，添加到培养基中，发酵，得乙醇。

步骤(1a)中，所述的培养基，其组成如下：150～200g/L葡萄糖，15-20g/L多聚蛋白胨，15-20g/L(NH₄)₂SO₄，10-15g/L酵母提取物,2-3g/L KH₂PO₄，2～3g/L MgSO₄·7H₂O，30-50mg/L FeSO₄·7H₂O，30～50mg/L ZnSO₄·7H₂O，溶剂为水。

步骤(1a)中，所述的培养，其培养温度为30℃，培养时间为12～18h，转速为200～250rpm。

步骤(2a)中，所述的固定化长膜，其培养温度为35℃，培养时间为60～72h，转速为200～250rpm，每20～24h换一次培养基。

步骤(2a)中，所述的固定化载体为棉纤维。

步骤(3a)中，所述的发酵，其培养温度为35℃，培养时间为20～24h，转速为200～250rpm。

有益效果：

本发明具有如下突出的效果：

本发明通过构建重组表达质粒载体pYXAurR-Mig1,，获得酿酒酵母工程菌，与原始菌株相比提高了乙醇耐受性。在15％浓度的乙醇下固定化发酵过程中，耗糖速率是原始菌株的1.30倍，提高了生物膜反应器中菌体的乙醇耐受性，能够更好的用于工业乙醇生产。

附图说明

图1pYXAurR-Mig1质粒图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

除非另外指明，以下各实施例中所使用的生物材料、载体、菌株、试剂、试剂盒等均可通过常规商购途径获得，其中涉及的生物基因工程操作技术，如质粒提取、酶切消化、片段回收、核酸片段与质粒载体连接反应及克隆和筛选等，均为本领域内的常规操作或参照相应产品的说明书进行操作。

实施例1：Mig1基因表达载体的构建

(1)酿酒酵母基因组提取：

将酿酒酵母接种于YPD液体培养基(YPD培养基组成如下:20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物和20g/L葡萄糖)，30℃培养至对数生长期，使用酵母基因组提取试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司)提取基因组。

(2)Mig1基因表达载体构建：

根据NCBI数据库中己有酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288c中Mig1编码基因，设计合成了引物Mig1-pYX-F和Mig1-pYX-R(如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示)，以基因组总DNA为模板进行PCR扩增。

PCR反应参数为：95℃变性5min；然后95℃变性30sec，65℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后；72℃保温10min。

得到长度约为1500bp片段，凝胶电泳分离纯化此片段并进行胶回收。将胶回收产物连接到pYX-AurR(SEQ ID NO:7)，连接产物转化采用氯化钙法制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于氨苄抗性平板。

挑取LB平板上的单菌落，接种到装有5mLLB液体培养基的20mL试管中，30℃，220rpm下培养12小时。利用质粒提取试剂盒(购自上海申能博彩生物科技有限公司)提取质粒，并委托金唯智科技(南京)有限公司测序，测得序列长度为2550bp，其核酸序列见SEQ IDNO：1中所示。

实施例2：高乙醇耐受性的酿酒酵母菌株获得。

利用质粒提取试剂盒提取测序正确的质粒，采用山梨醇法转化酿酒酵母感受态细胞，涂布担子菌素Aur抗性平板。具体方式如下：取100μL感受态，加入10μL质粒，轻轻混匀后吸入电击杯冰浴10min后，1500V电击转化。随即加入500μL 1M山梨醇和500μL YPD，30℃放置1h后，4500rpm，离心5min收集菌体，用100μL YPD重悬菌体，取100μL均匀涂布在Aur浓度为0.4μL/mL的抗性平板上,30℃培养48h左右，长出转化子。

挑取转化子进行菌落PCR验证。具体方式如下：挑取少量转化菌落，加入25μL0.02M NaOH溶液。95℃水浴10min后，冰上冷却10min。取1μL加入PCR体系。PCR反应使用引物为seqMig1-pYX-F和seqMig1-pYX-R(SEQ ID NO:5,6)，琼脂糖电泳显示扩增条带，表明转化成功。

实施例3：重组菌株乙醇耐受性发酵实验。

将酿酒酵母接种到YPD培养基中，培养约12h，得到种子液。将种子液以2％接种到含固定化载体的摇瓶中，固定化长膜。培养温度为35℃，培养时间为60～72h，转速为200～250rpm，每20～24h换一次培养基。之后将得到的已成膜完全的固定化载体，添加培养基及不同浓度的乙醇(5％，10％，15％)开始发酵。每隔4h左右取样1mL，采用DNS法测定糖耗，以反映生长情况，从而评估乙醇耐受性。

发酵培养基组成如下：150～200g/L葡萄糖、15-20g/L多聚蛋白胨、15-20g/L(NH₄)₂SO₄、10-15g/L酵母提取物、2-3g/L KH₂PO₄、2～3g/L MgSO₄·7H₂O,30～50mg/L FeSO₄·7H₂O、30～50mg/L ZnSO₄·7H₂O，溶剂为水。

DNS测糖法采用二硝基水杨酸，与还原糖反应生成棕红色物质，在540nm波长下测量吸光率，通过吸光率-糖浓度标曲测出反应液中残糖浓度。具体方法如下：取500μL发酵液，加入500μL DNS溶液混匀，沸水浴10min后冷却。加入8mL水混匀后，540nm下测吸光值。

表1 原始菌株与重组菌株于5％乙醇浓度下发酵糖耗比对(单位：g/L)

菌株	4h	9h	13h	16h	21h	25h
							重组菌株	93.20	73.21	63.66	41.29	7.77	0.00
原始菌株	98.07	82.04	74.25	57.04	32.10	0.00

表1中，25h时发酵液中的糖已经消耗完，所以25h时糖耗为0。

表2 原始菌株与重组菌株于10％乙醇浓度下发酵糖耗比对(单位：g/L)

菌株	4h	9h	13h	16h	21h	25h
							重组菌株	103.97	97.53	53.05	27.27	9.06	1.15
原始菌株	109.06	103.51	60.46	34.12	21.04	10.31

表3 原始菌株与重组菌株于15％乙醇浓度下发酵糖耗比对(单位：g/L)

菌株	4h	9h	13h	16h	21h	25h
							重组菌株	157.72	138.88	113.21	108.91	95.28	83.28
原始菌株	158.67	147.27	122.04	116.86	108.82	97.82

实施例4：重组菌株发酵产乙醇实验

将酿酒酵母接种到5mL YPD培养基中，培养约12h，得到种子液。

将种子液以2％接种到含固定化载体的摇瓶中，固定化长膜。所用培养基为100mL发酵培养基。培养温度为35℃，培养时间为60～72h，转速为200～250rpm，每20～24h换一次发酵培养基。

更换培养基3次后，再加入100mL发酵培养基开始发酵产醇。使用气相色谱(GC)法测定最终发酵液中乙醇含量。经3次重复批次发酵测定数据，重组菌株发酵乙醇平均产量为61.35g/L，原始菌株发酵乙醇平均产量为55.28g/L。

Claims

1.高乙醇耐受性基因工程菌在乙醇发酵生产中的应用；

所述高乙醇耐受性基因工程菌，它是过表达转录调控因子锌指蛋白Mig1基因的酿酒酵母菌；

所述的锌指蛋白Mig1基因，其核苷酸序列如 SEQ ID NO：1 中所示；

所述的酿酒酵母菌为Saccharomyces cerevisiae S288c；

包括如下步骤：

(1a) 将过表达转录调控因子Mig1的酿酒酵母基因工程菌接种到培养基中，培养，得到种子液，所述的培养基，其组成如下：2g/L 葡萄糖，2g/L蛋白胨，1g/L酵母提取物；

(2a) 将步骤(1a)中得到的种子液接种到含固定化载体的摇瓶中，固定化长膜；

(3a) 将步骤(2a)中得到的已成膜完全的固定化载体，添加到培养基中，发酵，得乙醇；

所述的培养基，其组成如下：200~250g/L葡萄糖，15~20g/L多聚蛋白胨，15~20g/L(NH₄)₂SO₄，10~15g/L酵母提取物， 2~3g/L KH₂PO₄，2~3g/L MgSO₄·7H₂O，30-50mg/L FeSO₄·7H₂O，30~50mg/L ZnSO₄·7H₂O，溶剂为水；

步骤(1a)中，所述的培养，其培养温度为30℃，培养时间为12~18h，转速为200~250rpm；

步骤(2a)中，所述的固定化长膜，其培养温度为35℃，培养时间为60~72h，转速为200~250rpm，每20~24h换一次培养基；

步骤(2a)中，所述的固定化载体为棉纤维；

步骤(3a)中，所述的发酵，其培养温度为35℃，培养时间为20~24h，转速为200~250rpm。