CN107881181A - 利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用 - Google Patents

利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107881181A
CN107881181A CN201711335714.8A CN201711335714A CN107881181A CN 107881181 A CN107881181 A CN 107881181A CN 201711335714 A CN201711335714 A CN 201711335714A CN 107881181 A CN107881181 A CN 107881181A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ala
cys
thr
gly
dnak
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711335714.8A
Other languages
English (en)
Inventor
杨何宝
胡美荣
郑翔
高沛汝
牟庆璇
秦艳梅
陶勇
马清河
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HEBEI RESEARCH INSTITUTE OF MICROBIOLOGY
Institute of Microbiology of CAS
Original Assignee
HEBEI RESEARCH INSTITUTE OF MICROBIOLOGY
Institute of Microbiology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HEBEI RESEARCH INSTITUTE OF MICROBIOLOGY, Institute of Microbiology of CAS filed Critical HEBEI RESEARCH INSTITUTE OF MICROBIOLOGY
Priority to CN201711335714.8A priority Critical patent/CN107881181A/zh
Publication of CN107881181A publication Critical patent/CN107881181A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于新基因的制备及工程菌的构建，特别是指一种利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用。本发明运用分子生物学技术，将分子伴侣DnaK与中性蛋白酶基因进行整合，构建了pHT43‑npr‑DnaK重组质粒，最后转化到宿主菌枯草芽孢杆菌WB800N中，构建了一株新的枯草芽孢杆菌工程菌株CGMCC No.14836，使分子伴侣DnaK与中性蛋白酶基因共表达，有效提高了中性蛋白酶的表达水平。

Description

利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆 菌及制备和应用
技术领域
本发明属于新基因的制备及工程菌的构建，特别是指一种利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用。
背景技术
传统的制革工艺会产生大量污染，制革排放的特色四废分别是：废水、污泥、废气和固体废弃物。其中各类污染的排放以水场部分的传统灰碱法脱毛环节为甚，灰碱毁毛脱毛法脱毛效果虽好，但被溶解的毛被、表皮与灰碱等污染物占制革废水总污染物的40％。近年来研究的清洁脱毛工艺主要有酶法脱毛、灰碱法基础上的保毛脱毛、有机胺脱毛、过氧化氢氧化脱毛和其他脱毛方法。
中性蛋白酶(Neutral protease)是在中性pH条件下作用于蛋白质肽键的酶类，能将蛋白质水解成氨基酸、多肽以及游离氨基酸，可广泛用于动植物蛋白水解，皮革脱毛、软化，羊毛丝绸脱胶等。蛋白酶法脱毛制革因脱毛条件温和，对真皮中角蛋白水解少，且毛从表皮分离回收，是目前为止最有可能代替灰碱法实现清洁脱毛工业化的方法。1398、2709蛋白酶制剂在20世纪初期曾作为脱毛酶应用在制革工艺中，但因其酶系中含有水解皮胶原的胶原蛋白酶，在大规模应用中如工艺控制不严会造成松面、烂皮现象；而纯化去除胶原蛋白酶所增加的工艺成本超出了制革厂的负荷，进而限制了蛋白酶制剂在皮革工业中的应用。有研究表明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis S14、Bacillus subtilis P13)及沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis LAU13)等菌株发酵生产的角蛋白酶对胶原蛋白水解能力相对较差，但在脱毛工艺中仍需要严格控制酶用量及脱毛时间，否则依旧会影响成革质量。因此，亟需研制一种理想的脱毛用酶产品，实现制革行业的“节能减排”、“低碳经济”，以促进制革业转型期保持稳定发展。
为了高效表达中性蛋白酶基因，科研工作者做了很多试验。《枯草芽孢杆菌中性蛋白酶基因的克隆与表达》(《基因组学与应用生物学》；2017年03期P906-910)中通过构建大肠杆菌原核表达载体pET30b-nprE，转化大肠杆菌BL21中得到重组工程菌，初步发酵酶活为39U/mL；《枯草芽孢杆菌AS1.398中性蛋白酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达》(《云南师范大学学报》；第25卷第3期P51-P56；2005年5月)中将编码枯草芽孢杆菌AS1.398的中性蛋白酶功能区和包含前导区序列(“pro”序列)在内的全长基因克隆到酵母整合型质粒pPIC9K中，电转化His4缺陷型巴斯德毕赤酵母SMD1168，通过MD-G418平板、PCR方法筛选和鉴定重组子，最后获得发酵酶活为20000U/mL的重组菌株。然而上述方法均存在弊端，转化到大肠杆菌中容易有包涵体的形成，且需要破壁来获得酶，这些不但会降低酶活而且限制了酶的分泌表达；转化到毕赤酵母中需要甲醇来诱导产酶，然而甲醇极易蒸发、难以检测浓度、反复添加不但操作麻烦，而且容易发生污染、另外在大量甲醇存在下会形成火灾隐患，且不宜于食品等蛋白生产。
枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)是目前原核表达系统中分泌表达外源蛋白质较理想的宿主。它是一种安全的表达系统，其安全程度可以达到食品级，这是一般原核表达系统无法比拟的；具有很强的蛋白质分泌功能，蛋白质在细胞内合成后，可以通过特定机制(分泌途径)输出到细胞外培养基中。提取不需要破碎细胞，仅需较简单地处理发酵上清液即可得到较纯的目标蛋白质；没有明显的密码子偏爱性，同时表达产物也不容易形成包涵体；发酵条件简单，产物易于分离纯化。
分子伴侣(molecular chaperones)是细胞中一大类蛋白质，是由不相关的蛋白质组成的一个家系，它们介导其它蛋白质的正确装配，但自己不成为最后功能结构中的组分。研究表明，分子伴侣能够帮助蛋白正确折叠，提高蛋白的可溶性表达，减少包涵体的形成。Pfeffer等在E.coli表达目的蛋白的同时表达分子伴侣蛋白，提高了目的蛋白的可溶性表达比例；张海军等在原核表达体系中加入HG-PGR07分子伴侣质粒与重组质粒pET-32-pfu共表达，使HG-PGR07表达的分子伴侣蛋白能够有效促进Pfu酶的可溶性表达和酶活性提高；万娟等的研究表明，pET-28a-med-ORF8与分子伴侣质粒pTf16共表达后，有效减少了包涵体的形成，提高了可溶性表达量。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因。
本发明的目的之二在于提供一种利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因的制备方法。
本发明的目的之三在于提供一种利用中性蛋白酶基因编码的蛋白。
本发明的目的之四在于提供一种利用中性蛋白酶基因转化的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14836。
本发明的目的之五在于提供一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis在制备中性蛋白酶中的应用。
本发明的整体技术构思是：
利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因，其基因序列为SEQ ID No.1。
利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因的制备方法，包括如下工艺步骤：
A、克隆分子伴侣基因DnaK
以解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGMCC No.1.398基因组为模版，根据已知的解淀粉芽孢杆菌来源的中性蛋白酶编码区序列设计一对上下游引物进行PCR反应，上游引物DnaK-F：5'-gctgttggattgtaacccgggaaaggaggaaggatcagtgagtaaagttatcggaat-3'，其中下划线为SmaI酶切位点；下游引物DnaK-R：5'-cattaggcgggctgccccgggttatttagaactgcttgaag-3'，其中下划线为SmaI酶切位点；
PCR反应体系为20μL：DNA mix 10μL，浓度为10ng/μL的上、下游引物各0.4μl，浓度为10ng/μL的解淀粉芽孢杆菌基因组模版0.2μl，DMSO 0.8μL，灭菌水8.2μL；
PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变形30s，50℃退火1min，72℃延伸10min，循环20次，72℃再延伸20min，4℃保存；反应结束后将PCR产物进行1％琼脂糖电泳；
B、PCR产物回收及纯化
采用NEB公司DNA Gel Extraction Kit柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，按照步骤A中的方法中进行电泳，然后切胶；
C、中性蛋白酶基因的克隆
C1、质粒酶切和新重组质粒的构建
对pHT43-npr质粒进行BamHI和SmaI双酶切，得到pHT43片段和npr片段；再以npr片段和DnaK片段为模板，设计特定引物进行PCR反应，得到npr+DnaK片段；最后采用Gibson连接方法将pHT43片段和npr+DnaK片段进行连接，得到新的重组质粒；pHT43-npr质粒来源于枯草芽孢杆菌BacillussubtilisWB800N/pHT43-npr CGMCCNo.11625；上游引物npr-DnaK-F：5'-ttacaaaaacatcagccgtaggatcccatcagcttaaagaaaacctgac-3'，其中下划线为BamHI酶切位点；下游引物npr-DnaK-R:5'-ctcattaggcgggctgccccgggttattttttgttttggtcgtc-3'，其中下划线为SmaI酶切位点；
C2、大肠杆菌T1转化；
C3、菌液PCR初步鉴定；
C4、重组质粒DNA测序及检验实验的正确性。
利用中性蛋白酶基因编码的蛋白，其序列为SEQ ID No.2。
利用中性蛋白酶基因转化的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，其保藏编号为CGMCC No.14836。
本发明中的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis申请人已于2017年10月26日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.14836，该保藏机构的地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，该保藏机构的简称为CGMCC。
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14836在制备中性蛋白酶中的应用。
本发明的具体技术构思还有：
利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因的制备方法，所述的步骤B中反应步骤及条件为：
B1、将步骤A制备的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外灯光下用刀片切下目的基因条带，再将切下的胶置于1.5mL离心管中，称量其重量，加入等重量的BindingBuffer，放于65℃水浴中至胶完全溶化；
B2、将胶溶液全部移至吸附柱中，静置10min，12000rpm离心lmin；
B3、将离心下来的收集管中液体再次移至吸附柱中，静置5min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体；
B4、向吸附柱中加入700μL SPW Wash Buffer，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱放入同一收集管中，重复此步骤一次；
B5、将空吸附柱于12000rpm离心3min，室温晾干15min；
B6、向空吸附柱中加入30μL超纯水,室温静置5min，12000rpm离心3min；
B7、离心管中的溶液即为回收的DNA片段的水溶液；
B8、取步骤B7中的水溶液3μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，在正确的位置有明显条带，剩余DNA样品于-20℃贮存。
所述的步骤C1中反应步骤及条件为：
双酶切体系：酶各1.5μL，cut smart Buffer 5μL，质粒2μg，水补齐至50μL，37℃，3h；
PCR反应体系20μL：DNA mix 10μL，浓度为10ng/μL的上、下游引物各0.4μl，浓度为10ng/μL的DNA模版0.2μL，DMSO 0.8μL，灭菌水8.2μL；
PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变形30s，55℃退火1min，72℃延伸10min，循环20次，72℃再延伸20min，4℃保存；
Gibson连接体系：酶6μL，载体和片段共4μL，比例为1：3-5，金属浴50℃，1h。
所述的步骤C2中反应步骤及条件为：
将步骤C1中制备的新的重组质粒10μL与100μL的大肠杆菌T1感受态细胞混合，冰浴30min；42℃热激90s，立即重置于冰上2min，再加入LB液体培养基800μL，37℃培养50-60min；涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜；
所述的步骤C3中反应步骤及条件为：
用移液枪挑取转化子单克隆至LB液体培养基中培养6-8h后，进行菌液PCR；其中上游引物pHT-F：5'-ttcagccgactcaaacatca-3'，下游引物pHT-R：5'-ctaataagccgatattagcc-3'；
菌液PCR体系为10μL：酶5μL，上、下游引物各0.5μL，菌液0.5μL，灭菌水3.5μL；
菌液PCR条件：预变性94℃、10min，变性94℃、30s，退火55℃、30s，延伸72℃、2min，再延伸72℃、10min，30个循环，4℃保存；反应结束后将PCR产物进行1％琼脂糖电泳检测验证，验证正确的菌落。
所述的步骤C4中反应步骤及条件为：
将菌落PCR鉴定为阳性克隆的转化子于盛装5mLLB液体的试管中培养12-16h，并送往擎科生物(北京)股份有限公司进行DNA测序；将测序后获得的序列用DNAMAN软件进行比对以验证序列的正确性和该方法的可靠性；测序结果表明，所获得的DNA片段含有中性蛋白酶基因编码区和整合的分子伴侣基因，成功构建的质粒命名为pHT43-npr-DnaK。
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14836在制备中性蛋白酶中的应用，包括如下工艺步骤：
按4％的比例将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14836接种于含有浓度为10μl/mL CmR的50mLLB培养基中，37℃、200rpm培养，当菌体OD600≈0.5时，添加1‰IPTG诱导产酶。
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14836的制备方法，包括如下工艺步骤：
a、pHT43-npr-DnaK质粒小量提取
采用NEB公司Plamid Miniprep Kit试剂盒小量提取质粒，具体操作步骤为：将验证正确的含有pHT43-npr-DnaK质粒的大肠杆菌T1接种到到5mL含有浓度为100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，振荡培养10h左右；取出菌液加到1.5mL离心管中，常温，12000rpm离心lmin，弃尽上清；加入250μL溶液Ⅰ，吹打混匀；加入250μL溶液Ⅱ，上下轻轻颠倒数次，混匀，常温静置2min；加入350μL溶液Ⅲ，上下轻轻颠倒数次，使裂解物分散均匀，常温静置2min，常温12000rpm离心10min；转移上清至吸附柱中，静置5min，常温，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的液体；加入700μL DNA Wash Buffer到吸附柱中，常温12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中，重复此步骤一次；然后将空吸附柱于12000rpm离心2min，室温晾干15min；向空吸附柱中加入30μL超纯水，室温静置5min，12000rpm离心3min；离心管中的溶液即为质粒DNA水溶液；取3μL进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，在正确的位置有明显条带，剩余DNA样品于-20℃贮存。
b、枯草芽孢杆菌WB800N转化
取步骤8中的质粒10μL加入到400μL枯草芽孢杆菌WB800N感受态中，37℃，220rpm培养2h；涂布于含有浓度为10μg/mL氯霉素的LB固体平板，37℃过夜培养。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
1、本发明将分子伴侣DnaK与中性蛋白酶基因进行整合，构建了pHT43-npr-DnaK重组质粒，最后转化到宿主菌枯草芽孢杆菌WB800N中，构建了一株新的枯草芽孢杆菌工程菌株WB800N/pHT43-npr-DnaK，使分子伴侣DnaK与中性蛋白酶基因共表达，有效提高了中性蛋白酶的表达水平。经申请人实验证实，将本发明的枯草芽孢杆菌工程菌接种于基础发酵培养基进行初步发酵，在未对培养基及发酵条件进行充分优化的条件下，酶活比对照提高了33％-53％。
2、本发明使用枯草芽孢杆菌作为宿主菌，具有发酵条件简单、蛋白分泌能力更强、更容易获得纯度较高的目的蛋白等优点。
3、采用了Gibson引物设计方法和Gibson组装，确保了PCR和质粒连接的准确性。
附图说明
本发明的附图有：
图1是本发明中性蛋白酶基因及利用其编码的蛋白的序列表。
图2是克隆分子伴侣DnaK片段电泳图。
图中1和2为克隆分子伴侣DnaK片段的条带，由图2可知，在2000bp-1500bp之间有一条特异性条带，为分子伴侣DnaK片段位置。
图3是本发明中性蛋白酶酶活验证中转化子涂牛奶平板示意图。
由图3可以看出，四个菌落周围均有水解圈生成，说明有中性蛋白酶存在，从而验证了转化的成功。
图4是本发明中性蛋白酶酶活的测定中对照菌株和重组菌株发酵酶活对比示意图。
由图4可知，不同时间点的发酵酶活，重组菌株均高于对照菌株，酶活提高了33％-53％。
图5是重组菌株和对照菌株SDS-PAGE电泳图。
图5中1为对照菌株WB800N/pHT43-npr；2和3为重组菌株。
由图可知，对照菌株和重组菌株在30kDa-40kDa之间均有一条特异性条带，并且重组菌株条带比对照菌株更亮，说明重组菌株的酶活更高。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例作进一步描述，但不作为对本发明的限定。本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范畴。本发明实施例中未注明具体条件的方法，均按照本领域常用的技术手段或厂商所建议的条件进行。
实施例
1、利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因，其基因序列为：
gctgagaatcctcagcttaaagaaaacctgacgaactttgtgccgaagcattctttggtgcaatctgaattgccttcagtcagtgacaaagcaatcaagcaatacttgaaacaaaacggcaaagtcttcaaaggcaacccttctgagagactgaagctaattgaccacacgaccgatgatctcggctacaagcacttccgttatgtgcctgtcgttaacggtgtgcctgtgaaagactcgcaagtcattattcacgtcgataaatccaacaatgtctatgcgattaacggagaattaaacaacgatgcttctgccaaaacggcaaacagcaaaaaattatctgcaaatcaagcgctggatcatgcttttaaagcaatcggcaaatcacctgaagccgtctctaacggcaacgttgcaaacaaaaacaaagccgagctgaaagcagcggccacaaaagacggtaaataccgactcgcctatgatgtaaccatccgctacatcgaaccggaaccagctaactgggaagtaaccgttgatgcggaaacagggaaagtcctgaaaaagcaaaacaaagtggagcatgccgctgcaaccggaacaggtacgactcttaaaggaaaaacggtctcattaaatatttcttctgaaagcggcaaatatgtaatgcgtgatctttctaaacctaccggaacgcaaattattacgtacgatctgcaaaaccgacaatataacctgccgggcacgctcgtatcaagcactacaaaccagttcacaacttcttctcagcgcgctgccgttgatgcgcattacaatctcggcaaagtgtacgattatttctatcagacgtttaaacgcaacagctacgacaataaaggcggcaaaatcgtatcttccgttcattacggcagcaaatacaacaacgcggcctggatcggcgaccaaatgatttacggtgacggtgacggctcattcttctcgcctctttccggttcaatggacgtaacggcccatgaaatgacacacggtgttacacaggaaacagccaacttgaactatgaaaatcaaccgggtgctttaaacgaatccttctctgatgtattcggatacttcaatgatactgaggactgggatatcggtgaagatattacggtcagccagccggctctccgcagtttatccaatccgacaaaatacggacagcccgaccattacaaaaattatcgaaaccttccgaatactgatgccggcgactacggcggcgtgcatacaaacagcggaattccgaacaaagccgcttacaacacgattacaaaaatcggcgtgaaaaaagcggagcagatttactaccatgcactgacggtatatctcactccgtcatcaagctttaaagatgcaaaagcagctttgattcaatcagcgcgggacctttacggctctcaagacgctgcaagcgtagaagcggcctggaatgcagttggattgtaa。
2、利用上述中性蛋白酶基因编码的蛋白，其氨基酸序列为：
GCTGAGAATCCTCAGCTTAAAGAAAACCTGACGAACTTTGTGCCGAAGCATTCTTTGGTGCAATCTGAATTGCCTTCAGTCAGTGACAAAGCAATCAAGCAATACTTGAAACAAAACGGCAAAGTCTTCAAAGGCAACCCTTCTGAGAGACTGAAGCTAATTGACCACACGACCGATGATCTCGGCTACAAGCACTTCCGTTATGTGCCTGTCGTTAACGGTGTGCCTGTGAAAGACTCGCAAGTCATTATTCACGTCGATAAATCCAACAATGTCTATGCGATTAACGGAGAATTAAACAACGATGCTTCTGCCAAAACGGCAAACAGCAAAAAATTATCTGCAAATCAAGCGCTGGATCATGCTTTTAAAGCAATCGGCAAATCACCTGAAGCCGTCTCTAACGGCAACGTTGCAAACAAAAACAAAGCCGAGCTGAAAGCAGCGGCCACAAAAGACGGTAAATACCGACTCGCCTATGATGTAACCATCCGCTACATCGAACCGGAACCAGCTAACTGGGAAGTAACCGTTGATGCGGAAACAGGGAAAGTCCTGAAAAAGCAAAACAAAGTGGAGCATGCCGCTGCAACCGGAACAGGTACGACTCTTAAAGGAAAAACGGTCTCATTAAATATTTCTTCTGAAAGCGGCAAATATGTAATGCGTGATCTTTCTAAACCTACCGGAACGCAAATTATTACGTACGATCTGCAAAACCGACAATATAACCTGCCGGGCACGCTCGTATCAAGCACTACAAACCAGTTCACAACTTCTTCTCAGCGCGCTGCCGTTGATGCGCATTACAATCTCGGCAAAGTGTACGATTATTTCTATCAGACGTTTAAACGCAACAGCTACGACAATAAAGGCGGCAAAATCGTATCTTCCGTTCATTACGGCAGCAAATACAACAACGCGGCCTGGATCGGCGACCAAATGATTTACGGTGACGGTGACGGCTCATTCTTCTCGCCTCTTTCCGGTTCAATGGACGTAACGGCCCATGAAATGACACACGGTGTTACACAGGAAACAGCCAACTTGAACTATGAAAATCAACCGGGTGCTTTAAACGAATCCTTCTCTGATGTATTCGGATACTTCAATGATACTGAGGACTGGGATATCGGTGAAGATATTACGGTCAGCCAGCCGGCTCTCCGCAGTTTATCCAATCCGACAAAATACGGACAGCCCGACCATTACAAAAATTATCGAAACCTTCCGAATACTGATGCCGGCGACTACGGCGGCGTGCATACAAACAGCGGAATTCCGAACAAAGCCGCTTACAACACGATTACAAAAATCGGCGTGAAAAAAGCGGAGCAGATTTACTACCATGCACTGACGGTATATCTCACTCCGTCATCAAGCTTTAAAGATGCAAAAGCAGCTTTGATTCAATCAGCGCGGGACCTTTACGGCTCTCAAGACGCTGCAAGCGTAGAAGCGGCCTGGAATGCAGTTGGATTGTAA。
3、利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因的制备方法，包括如下工艺步骤：
A、克隆分子伴侣基因DnaK
以解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGMCC No.1.398基因组为模版，根据已知的解淀粉芽孢杆菌来源的中性蛋白酶编码区序列设计一对上下游引物进行PCR反应，上游引物DnaK-F：5'-gctgttggattgtaacccgggaaaggaggaaggatcagtgagtaaagttatcggaat-3'，其中下划线为SmaI酶切位点；下游引物DnaK-R：5'-cattaggcgggctgccccgggttatttagaactgcttgaag-3'，其中下划线为SmaI酶切位点；
PCR反应体系为20μL：DNA mix 10μL，浓度为10ng/μL的上、下游引物各0.4μl，浓度为10ng/μL的解淀粉芽孢杆菌基因组模版0.2μl，DMSO 0.8μL，灭菌水8.2μL；
PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变形30s，50℃退火1min，72℃延伸10min，循环20次，72℃再延伸20min，4℃保存；反应结束后将PCR产物进行1％琼脂糖电泳；结果见图2。
B、PCR产物回收及纯化
采用NEB公司DNA Gel Extraction Kit柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，按照步骤A中的方法中进行电泳，然后切胶；其具体步骤为：
B1、将步骤A制备的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外灯光下用刀片切下目的基因条带，再将切下的胶置于1.5mL离心管中，称量其重量，加入等重量的BindingBuffer，放于65℃水浴中至胶完全溶化；
B2、将胶溶液全部移至吸附柱中，静置10min，12000rpm离心lmin；
B3、将离心下来的收集管中液体再次移至吸附柱中，静置5min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体；
B4、向吸附柱中加入700μL SPW Wash Buffer，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱放入同一收集管中，重复此步骤一次；
B5、将空吸附柱于12000rpm离心3min，室温晾干15min；
B6、向空吸附柱中加入30μL超纯水,室温静置5min，12000rpm离心3min；
B7、离心管中的溶液即为回收的DNA片段的水溶液；
B8、取步骤B7中的水溶液3μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，在正确的位置有明显条带，剩余DNA样品于-20℃贮存。
C、中性蛋白酶基因的克隆
C1、质粒酶切和新重组质粒的构建
对pHT43-npr质粒进行BamHI和SmaI双酶切，得到pHT43片段和npr片段；再以npr片段和DnaK片段为模板，设计特定引物进行PCR反应，得到npr+DnaK片段；最后采用Gibson连接方法将pHT43片段和npr+DnaK片段进行连接，得到新的重组质粒；pHT43-npr质粒来源于枯草芽孢杆菌BacillussubtilisWB800N/pHT43-npr CGMCCNo.11625；上游引物npr-DnaK-F：5'-ttacaaaaacatcagccgtaggatcccatcagcttaaagaaaacctgac-3'，其中下划线为BamHI酶切位点；下游引物npr-DnaK-R:5'-ctcattaggcgggctgccccgggttattttttgttttggtcgtc-3'，其中下划线为SmaI酶切位点；
C2、大肠杆菌T1转化；
将步骤C1中制备的新的重组质粒10μL与100μL的大肠杆菌T1感受态细胞混合，冰浴30min；42℃热激90s，立即重置于冰上2min，再加入LB液体培养基800μL，37℃培养50-60min；涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜；
C3、菌液PCR初步鉴定；
用移液枪挑取转化子单克隆至LB液体培养基中培养6-8h后，进行菌液PCR；其中上游引物pHT-F：5'-ttcagccgactcaaacatca-3'，下游引物pHT-R：5'-ctaataagccgatattagcc-3'；
菌液PCR体系为10μL：酶5μL，上、下游引物各0.5μL，菌液0.5μL，灭菌水3.5μL；
菌液PCR条件：预变性94℃、10min，变性94℃、30s，退火55℃、30s，延伸72℃、2min，再延伸72℃、10min，30个循环，4℃保存；反应结束后将PCR产物进行1％琼脂糖电泳检测验证，验证正确的菌落。
C4、重组质粒DNA测序及检验实验的正确性。
将菌落PCR鉴定为阳性克隆的转化子于盛装5mLLB液体的试管中培养12-16h，并送往擎科生物(北京)股份有限公司进行DNA测序；将测序后获得的序列用DNAMAN软件进行比对以验证序列的正确性和该方法的可靠性；测序结果表明，所获得的DNA片段含有中性蛋白酶基因编码区和整合的分子伴侣基因，成功构建的质粒命名为pHT43-npr-DnaK。
4、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.*******的制备方法，包括如下工艺步骤：
a、pHT43-npr-DnaK质粒小量提取
采用NEB公司Plamid Miniprep Kit试剂盒小量提取质粒，具体操作步骤为：将验证正确的含有pHT43-npr-DnaK质粒的大肠杆菌T1接种到5mL含有浓度为100μg/mL的氨苄青霉素的液体LB培养基中，振荡培养10h左右；取出菌液加到1.5mL离心管中，常温，12000rpm离心lmin，弃尽上清；加入250μL溶液Ⅰ，吹打混匀；加入250μL溶液Ⅱ，上下轻轻颠倒数次，混匀，常温静置2min；加入350μL溶液Ⅲ，上下轻轻颠倒数次，使裂解物分散均匀，常温静置2min，常温12000rpm离心10min；转移上清至吸附柱中，静置5min，常温，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的液体；加入700μL DNA Wash Buffer到吸附柱中，常温12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中，重复此步骤一次；然后将空吸附柱于12000rpm离心2min，室温晾干15min；向空吸附柱中加入30μL超纯水，室温静置5min，12000rpm离心3min；离心管中的溶液即为质粒DNA水溶液；取3μL进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，在正确的位置有明显条带，剩余DNA样品于-20℃贮存。
b、枯草芽孢杆菌WB800N转化
取步骤a中的质粒DNA水溶液10μL加入到400μL枯草芽孢杆菌WB800N感受态中，37℃，220rpm培养2h；涂布于含有浓度为10μg/mL氯霉素的LB固体平板，37℃过夜培养。
5、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14836在制备中性蛋白酶中的应用以及中性蛋白酶酶活的验证
(1)用移液枪挑取转化子培养于含10μg/mL氯霉素LB液体培养基中，培养6-8h，吸取5-10μL菌液于牛奶平板验证中性蛋白酶活性，37℃培养1-3h，有水解圈生成的菌落即为阳性转化子。结果见图3。
(2)将对照菌株WB800N/pHT43-npr与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCCNo.14836按4％的比例接种于含有浓度为10μl/mLCmR的50mLLB培养基中，37℃、200r/min培养。当菌体OD600≈0.5时，添加1‰IPTG诱导产酶，诱导24、36、48h后取样，采用Folin-酚法(GB/T 23527-2009)测定中性蛋白酶酶活。结果见图4。
6、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14836与对照菌株表达中性蛋白酶跑蛋白胶验证，结果见图5。
序列表
<110> 河北省微生物研究所
中国科学院微生物研究所
<120> 利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用
<130> 《枯草芽孢杆菌中性蛋白酶基因的克隆与表达》（《基因组学与应用生物学》；2017年03期P906-910）；《枯草芽孢杆菌AS1.398中性蛋白酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达》（《云南师范大学学报》；第25卷第3期P51-P56；2005年5月）
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1485
<212> DNA
<213> An artificial sequence
<400> 1
gctgagaatc ctcagcttaa agaaaacctg acgaactttg tgccgaagca ttctttggtg 60
caatctgaat tgccttcagt cagtgacaaa gcaatcaagc aatacttgaa acaaaacggc 120
aaagtcttca aaggcaaccc ttctgagaga ctgaagctaa ttgaccacac gaccgatgat 180
ctcggctaca agcacttccg ttatgtgcct gtcgttaacg gtgtgcctgt gaaagactcg 240
caagtcatta ttcacgtcga taaatccaac aatgtctatg cgattaacgg agaattaaac 300
aacgatgctt ctgccaaaac ggcaaacagc aaaaaattat ctgcaaatca agcgctggat 360
catgctttta aagcaatcgg caaatcacct gaagccgtct ctaacggcaa cgttgcaaac 420
aaaaacaaag ccgagctgaa agcagcggcc acaaaagacg gtaaataccg actcgcctat 480
gatgtaacca tccgctacat cgaaccggaa ccagctaact gggaagtaac cgttgatgcg 540
gaaacaggga aagtcctgaa aaagcaaaac aaagtggagc atgccgctgc aaccggaaca 600
ggtacgactc ttaaaggaaa aacggtctca ttaaatattt cttctgaaag cggcaaatat 660
gtaatgcgtg atctttctaa acctaccgga acgcaaatta ttacgtacga tctgcaaaac 720
cgacaatata acctgccggg cacgctcgta tcaagcacta caaaccagtt cacaacttct 780
tctcagcgcg ctgccgttga tgcgcattac aatctcggca aagtgtacga ttatttctat 840
cagacgttta aacgcaacag ctacgacaat aaaggcggca aaatcgtatc ttccgttcat 900
tacggcagca aatacaacaa cgcggcctgg atcggcgacc aaatgattta cggtgacggt 960
gacggctcat tcttctcgcc tctttccggt tcaatggacg taacggccca tgaaatgaca 1020
cacggtgtta cacaggaaac agccaacttg aactatgaaa atcaaccggg tgctttaaac 1080
gaatccttct ctgatgtatt cggatacttc aatgatactg aggactggga tatcggtgaa 1140
gatattacgg tcagccagcc ggctctccgc agtttatcca atccgacaaa atacggacag 1200
cccgaccatt acaaaaatta tcgaaacctt ccgaatactg atgccggcga ctacggcggc 1260
gtgcatacaa acagcggaat tccgaacaaa gccgcttaca acacgattac aaaaatcggc 1320
gtgaaaaaag cggagcagat ttactaccat gcactgacgg tatatctcac tccgtcatca 1380
agctttaaag atgcaaaagc agctttgatt caatcagcgc gggaccttta cggctctcaa 1440
gacgctgcaa gcgtagaagc ggcctggaat gcagttggat tgtaa 1485
<210> 2
<211> 1485
<212> PRT
<213> An artificial sequence
<400> 2
Gly Cys Thr Gly Ala Gly Ala Ala Thr Cys Cys Thr Cys Ala Gly Cys
1 5 10 15
Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Cys Cys Thr Gly Ala Cys
20 25 30
Gly Ala Ala Cys Thr Thr Thr Gly Thr Gly Cys Cys Gly Ala Ala Gly
35 40 45
Cys Ala Thr Thr Cys Thr Thr Thr Gly Gly Thr Gly Cys Ala Ala Thr
50 55 60
Cys Thr Gly Ala Ala Thr Thr Gly Cys Cys Thr Thr Cys Ala Gly Thr
65 70 75 80
Cys Ala Gly Thr Gly Ala Cys Ala Ala Ala Gly Cys Ala Ala Thr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Cys Ala Ala Thr Ala Cys Thr Thr Gly Ala Ala Ala Cys
100 105 110
Ala Ala Ala Ala Cys Gly Gly Cys Ala Ala Ala Gly Thr Cys Thr Thr
115 120 125
Cys Ala Ala Ala Gly Gly Cys Ala Ala Cys Cys Cys Thr Thr Cys Thr
130 135 140
Gly Ala Gly Ala Gly Ala Cys Thr Gly Ala Ala Gly Cys Thr Ala Ala
145 150 155 160
Thr Thr Gly Ala Cys Cys Ala Cys Ala Cys Gly Ala Cys Cys Gly Ala
165 170 175
Thr Gly Ala Thr Cys Thr Cys Gly Gly Cys Thr Ala Cys Ala Ala Gly
180 185 190
Cys Ala Cys Thr Thr Cys Cys Gly Thr Thr Ala Thr Gly Thr Gly Cys
195 200 205
Cys Thr Gly Thr Cys Gly Thr Thr Ala Ala Cys Gly Gly Thr Gly Thr
210 215 220
Gly Cys Cys Thr Gly Thr Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Thr Cys Gly
225 230 235 240
Cys Ala Ala Gly Thr Cys Ala Thr Thr Ala Thr Thr Cys Ala Cys Gly
245 250 255
Thr Cys Gly Ala Thr Ala Ala Ala Thr Cys Cys Ala Ala Cys Ala Ala
260 265 270
Thr Gly Thr Cys Thr Ala Thr Gly Cys Gly Ala Thr Thr Ala Ala Cys
275 280 285
Gly Gly Ala Gly Ala Ala Thr Thr Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys Gly
290 295 300
Ala Thr Gly Cys Thr Thr Cys Thr Gly Cys Cys Ala Ala Ala Ala Cys
305 310 315 320
Gly Gly Cys Ala Ala Ala Cys Ala Gly Cys Ala Ala Ala Ala Ala Ala
325 330 335
Thr Thr Ala Thr Cys Thr Gly Cys Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Gly
340 345 350
Cys Gly Cys Thr Gly Gly Ala Thr Cys Ala Thr Gly Cys Thr Thr Thr
355 360 365
Thr Ala Ala Ala Gly Cys Ala Ala Thr Cys Gly Gly Cys Ala Ala Ala
370 375 380
Thr Cys Ala Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly Cys Cys Gly Thr Cys Thr
385 390 395 400
Cys Thr Ala Ala Cys Gly Gly Cys Ala Ala Cys Gly Thr Thr Gly Cys
405 410 415
Ala Ala Ala Cys Ala Ala Ala Ala Ala Cys Ala Ala Ala Gly Cys Cys
420 425 430
Gly Ala Gly Cys Thr Gly Ala Ala Ala Gly Cys Ala Gly Cys Gly Gly
435 440 445
Cys Cys Ala Cys Ala Ala Ala Ala Gly Ala Cys Gly Gly Thr Ala Ala
450 455 460
Ala Thr Ala Cys Cys Gly Ala Cys Thr Cys Gly Cys Cys Thr Ala Thr
465 470 475 480
Gly Ala Thr Gly Thr Ala Ala Cys Cys Ala Thr Cys Cys Gly Cys Thr
485 490 495
Ala Cys Ala Thr Cys Gly Ala Ala Cys Cys Gly Gly Ala Ala Cys Cys
500 505 510
Ala Gly Cys Thr Ala Ala Cys Thr Gly Gly Gly Ala Ala Gly Thr Ala
515 520 525
Ala Cys Cys Gly Thr Thr Gly Ala Thr Gly Cys Gly Gly Ala Ala Ala
530 535 540
Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala Ala Gly Thr Cys Cys Thr Gly Ala Ala
545 550 555 560
Ala Ala Ala Gly Cys Ala Ala Ala Ala Cys Ala Ala Ala Gly Thr Gly
565 570 575
Gly Ala Gly Cys Ala Thr Gly Cys Cys Gly Cys Thr Gly Cys Ala Ala
580 585 590
Cys Cys Gly Gly Ala Ala Cys Ala Gly Gly Thr Ala Cys Gly Ala Cys
595 600 605
Thr Cys Thr Thr Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Cys Gly
610 615 620
Gly Thr Cys Thr Cys Ala Thr Thr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Thr Thr
625 630 635 640
Cys Thr Thr Cys Thr Gly Ala Ala Ala Gly Cys Gly Gly Cys Ala Ala
645 650 655
Ala Thr Ala Thr Gly Thr Ala Ala Thr Gly Cys Gly Thr Gly Ala Thr
660 665 670
Cys Thr Thr Thr Cys Thr Ala Ala Ala Cys Cys Thr Ala Cys Cys Gly
675 680 685
Gly Ala Ala Cys Gly Cys Ala Ala Ala Thr Thr Ala Thr Thr Ala Cys
690 695 700
Gly Thr Ala Cys Gly Ala Thr Cys Thr Gly Cys Ala Ala Ala Ala Cys
705 710 715 720
Cys Gly Ala Cys Ala Ala Thr Ala Thr Ala Ala Cys Cys Thr Gly Cys
725 730 735
Cys Gly Gly Gly Cys Ala Cys Gly Cys Thr Cys Gly Thr Ala Thr Cys
740 745 750
Ala Ala Gly Cys Ala Cys Thr Ala Cys Ala Ala Ala Cys Cys Ala Gly
755 760 765
Thr Thr Cys Ala Cys Ala Ala Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys Thr Cys
770 775 780
Ala Gly Cys Gly Cys Gly Cys Thr Gly Cys Cys Gly Thr Thr Gly Ala
785 790 795 800
Thr Gly Cys Gly Cys Ala Thr Thr Ala Cys Ala Ala Thr Cys Thr Cys
805 810 815
Gly Gly Cys Ala Ala Ala Gly Thr Gly Thr Ala Cys Gly Ala Thr Thr
820 825 830
Ala Thr Thr Thr Cys Thr Ala Thr Cys Ala Gly Ala Cys Gly Thr Thr
835 840 845
Thr Ala Ala Ala Cys Gly Cys Ala Ala Cys Ala Gly Cys Thr Ala Cys
850 855 860
Gly Ala Cys Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly Gly Cys Gly Gly Cys Ala
865 870 875 880
Ala Ala Ala Thr Cys Gly Thr Ala Thr Cys Thr Thr Cys Cys Gly Thr
885 890 895
Thr Cys Ala Thr Thr Ala Cys Gly Gly Cys Ala Gly Cys Ala Ala Ala
900 905 910
Thr Ala Cys Ala Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Gly Gly Cys Cys Thr
915 920 925
Gly Gly Ala Thr Cys Gly Gly Cys Gly Ala Cys Cys Ala Ala Ala Thr
930 935 940
Gly Ala Thr Thr Thr Ala Cys Gly Gly Thr Gly Ala Cys Gly Gly Thr
945 950 955 960
Gly Ala Cys Gly Gly Cys Thr Cys Ala Thr Thr Cys Thr Thr Cys Thr
965 970 975
Cys Gly Cys Cys Thr Cys Thr Thr Thr Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys
980 985 990
Ala Ala Thr Gly Gly Ala Cys Gly Thr Ala Ala Cys Gly Gly Cys Cys
995 1000 1005
Cys Ala Thr Gly Ala Ala Ala Thr Gly Ala Cys Ala Cys Ala Cys Gly
1010 1015 1020
Gly Thr Gly Thr Thr Ala Cys Ala Cys Ala Gly Gly Ala Ala Ala Cys
1025 1030 1035 1040
Ala Gly Cys Cys Ala Ala Cys Thr Thr Gly Ala Ala Cys Thr Ala Thr
1045 1050 1055
Gly Ala Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Cys Cys Gly Gly Gly Thr Gly
1060 1065 1070
Cys Thr Thr Thr Ala Ala Ala Cys Gly Ala Ala Thr Cys Cys Thr Thr
1075 1080 1085
Cys Thr Cys Thr Gly Ala Thr Gly Thr Ala Thr Thr Cys Gly Gly Ala
1090 1095 1100
Thr Ala Cys Thr Thr Cys Ala Ala Thr Gly Ala Thr Ala Cys Thr Gly
1105 1110 1115 1120
Ala Gly Gly Ala Cys Thr Gly Gly Gly Ala Thr Ala Thr Cys Gly Gly
1125 1130 1135
Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Ala Thr Thr Ala Cys Gly Gly Thr Cys
1140 1145 1150
Ala Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys Gly Gly Cys Thr Cys Thr Cys Cys
1155 1160 1165
Gly Cys Ala Gly Thr Thr Thr Ala Thr Cys Cys Ala Ala Thr Cys Cys
1170 1175 1180
Gly Ala Cys Ala Ala Ala Ala Thr Ala Cys Gly Gly Ala Cys Ala Gly
1185 1190 1195 1200
Cys Cys Cys Gly Ala Cys Cys Ala Thr Thr Ala Cys Ala Ala Ala Ala
1205 1210 1215
Ala Thr Thr Ala Thr Cys Gly Ala Ala Ala Cys Cys Thr Thr Cys Cys
1220 1225 1230
Gly Ala Ala Thr Ala Cys Thr Gly Ala Thr Gly Cys Cys Gly Gly Cys
1235 1240 1245
Gly Ala Cys Thr Ala Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Cys
1250 1255 1260
Ala Thr Ala Cys Ala Ala Ala Cys Ala Gly Cys Gly Gly Ala Ala Thr
1265 1270 1275 1280
Thr Cys Cys Gly Ala Ala Cys Ala Ala Ala Gly Cys Cys Gly Cys Thr
1285 1290 1295
Thr Ala Cys Ala Ala Cys Ala Cys Gly Ala Thr Thr Ala Cys Ala Ala
1300 1305 1310
Ala Ala Ala Thr Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala
1315 1320 1325
Ala Gly Cys Gly Gly Ala Gly Cys Ala Gly Ala Thr Thr Thr Ala Cys
1330 1335 1340
Thr Ala Cys Cys Ala Thr Gly Cys Ala Cys Thr Gly Ala Cys Gly Gly
1345 1350 1355 1360
Thr Ala Thr Ala Thr Cys Thr Cys Ala Cys Thr Cys Cys Gly Thr Cys
1365 1370 1375
Ala Thr Cys Ala Ala Gly Cys Thr Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ala Thr
1380 1385 1390
Gly Cys Ala Ala Ala Ala Gly Cys Ala Gly Cys Thr Thr Thr Gly Ala
1395 1400 1405
Thr Thr Cys Ala Ala Thr Cys Ala Gly Cys Gly Cys Gly Gly Gly Ala
1410 1415 1420
Cys Cys Thr Thr Thr Ala Cys Gly Gly Cys Thr Cys Thr Cys Ala Ala
1425 1430 1435 1440
Gly Ala Cys Gly Cys Thr Gly Cys Ala Ala Gly Cys Gly Thr Ala Gly
1445 1450 1455
Ala Ala Gly Cys Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Cys
1460 1465 1470
Ala Gly Thr Thr Gly Gly Ala Thr Thr Gly Thr Ala Ala
1475 1480 1485

Claims (10)

1.利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因，其特征在于其基因序列为SEQ ID No.1。
2.利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因的制备方法，其特征在于包括如下工艺步骤：
A、克隆分子伴侣基因DnaK
以解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGMCC No.1.398基因组为模版，根据已知的解淀粉芽孢杆菌来源的中性蛋白酶编码区序列设计一对上下游引物进行PCR反应，上游引物DnaK-F：5'-gctgttggattgtaacccgggaaaggaggaaggatcagtgagtaaagttatcggaat-3'，其中下划线为SmaI酶切位点；下游引物DnaK-R：5'-cattaggcgggctgccccgggttatttagaactgcttgaag-3'，其中下划线为SmaI酶切位点；
PCR反应体系为20μL：DNA mix 10μL，浓度为10ng/μL的上、下游引物各0.4μl，浓度为10ng/μL的解淀粉芽孢杆菌基因组模版0.2μl，DMSO 0.8μL，灭菌水8.2μL；
PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变形30s，50℃退火1min，72℃延伸10min，循环20次，72℃再延伸20min，4℃保存；反应结束后将PCR产物进行1％琼脂糖电泳；
B、PCR产物回收及纯化
采用NEB公司DNA Gel Extract ion Kit柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，按照步骤A中的方法中进行电泳，然后切胶；
C、中性蛋白酶基因的克隆
C1、质粒酶切和新重组质粒的构建
对pHT43-npr质粒进行BamHI和SmaI双酶切，得到pHT43片段和npr片段；再以npr片段和DnaK片段为模板，设计特定引物进行PCR反应，得到npr+DnaK片段；最后采用Gibson连接方法将pHT43片段和npr+DnaK片段进行连接，得到新的重组质粒；pHT43-npr质粒来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisWB800N/pHT43-npr CGMCCNo.11625；上游引物npr-DnaK-F：5'-ttacaaaaacatcagccgtaggatcccatcagcttaaagaaaacctgac-3'，其中下划线为BamHI酶切位点；下游引物npr-DnaK-R:5'-ctcattaggcgggctgccccgggttattttttgttttggtcgtc-3'，其中下划线为SmaI酶切位点；
C2、大肠杆菌T1转化；
C3、菌液PCR初步鉴定；
C4、重组质粒DNA测序及检验实验的正确性。
3.根据权利要求2所述的利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因的制备方法，其特征在于所述的步骤B中反应步骤及条件为：
B1、将步骤A制备的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外灯光下用刀片切下目的基因条带，再将切下的胶置于1.5mL离心管中，称量其重量，加入等重量的BindingBuffer，放于65℃水浴中至胶完全溶化；
B2、将胶溶液全部移至吸附柱中，静置10min，12000rpm离心lmin；
B3、将离心下来的收集管中液体再次移至吸附柱中，静置5min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体；
B4、向吸附柱中加入700μL SPW Wash Buffer，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱放入同一收集管中，重复此步骤一次；
B5、将空吸附柱于12000rpm离心3min，室温晾干15min；
B6、向空吸附柱中加入30μL超纯水,室温静置5min，12000rpm离心3min；
B7、离心管中的溶液即为回收的DNA片段的水溶液；
B8、取步骤B7中的水溶液3μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，在正确的位置有明显条带，剩余DNA样品于-20℃贮存。
4.根据权利要求2所述的利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因的制备方法，其特征在于所述的步骤C1中反应步骤及条件为：
双酶切体系：酶各1.5μL，cut smart Buffer 5μL，质粒2μg，水补齐至50μL，37℃，3h；
PCR反应体系20μL：DNA mix 10μL，浓度为10ng/μL的上、下游引物各0.4μl，浓度为10ng/μL的DNA模版0.2μL，DMSO 0.8μL，灭菌水8.2μL；
PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变形30s，55℃退火1min，72℃延伸10min，循环20次，72℃再延伸20min，4℃保存；
Gibson连接体系：酶6μL，载体和片段共4μL，比例为1：3-5，金属浴50℃，1h。
5.根据权利要求2或4中任一项所述的利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因的制备方法，其特征在于所述的步骤C2中反应步骤及条件为：
将步骤C1中制备的新的重组质粒10μL与100μL的大肠杆菌T1感受态细胞混合，冰浴30min；42℃热激90s，立即重置于冰上2min，再加入LB液体培养基800μL，37℃培养50-60min；涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜；
所述的步骤C3中反应步骤及条件为：
用移液枪挑取转化子单克隆至LB液体培养基中培养6-8h后，进行菌液PCR；其中上游引物pHT-F：5'-ttcagccgactcaaacatca-3'，下游引物pHT-R：5'-ctaataagccgatattagcc-3'；
菌液PCR体系为10μL：酶5μL，上、下游引物各0.5μL，菌液0.5μL，灭菌水3.5μL；
菌液PCR条件：预变性94℃、10min，变性94℃、30s，退火55℃、30s，延伸72℃、2min，再延伸72℃、10min，30个循环，4℃保存；反应结束后将PCR产物进行1％琼脂糖电泳检测验证，验证正确的菌落。
6.根据权利要求5所述的利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因的制备方法，其特征在于所述的步骤C4中反应步骤及条件为：
将菌落PCR鉴定为阳性克隆的转化子于盛装5mLLB液体的试管中培养12-16h，并送往擎科生物(北京)股份有限公司进行DNA测序；将测序后获得的序列用DNAMAN软件进行比对以验证序列的正确性和该方法的可靠性；测序结果表明，所获得的DNA片段含有中性蛋白酶基因编码区和整合的分子伴侣基因，成功构建的质粒命名为pHT43-npr-DnaK。
7.利用中性蛋白酶基因编码的蛋白，其特征在于其序列为SEQ ID No.2。
8.利用中性蛋白酶基因转化的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，其特征在于其保藏编号为CGMCC No.14836。
9.根据权利要求8所述的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis在制备中性蛋白酶中的应用。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于包括如下工艺步骤：
按4％的比例将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14836接种于含有浓度为10μl/mLCmR的50mLLB培养基中，37℃、200rpm培养，当菌体OD600≈0.5时，添加1‰IPTG诱导产酶。
CN201711335714.8A 2017-12-14 2017-12-14 利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用 Pending CN107881181A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711335714.8A CN107881181A (zh) 2017-12-14 2017-12-14 利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711335714.8A CN107881181A (zh) 2017-12-14 2017-12-14 利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107881181A true CN107881181A (zh) 2018-04-06

Family

ID=61774474

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711335714.8A Pending CN107881181A (zh) 2017-12-14 2017-12-14 利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107881181A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109321556A (zh) * 2018-11-07 2019-02-12 河北省微生物研究所 脱毛酶制剂的制备方法及其在黄牛皮脱毛中的应用
CN109609484A (zh) * 2018-12-06 2019-04-12 河北省微生物研究所 复合脱毛酶制剂的制备方法及其在含小毛进口黄牛皮脱毛中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101113455A (zh) * 2007-05-29 2008-01-30 云南大学 食线虫芽孢杆菌胞外侵染性中性蛋白酶基因及其应用
CN102533838A (zh) * 2012-02-08 2012-07-04 南京农业大学 一种高效分泌表达重组脂肪氧合酶的枯草杆菌表达载体及其应用
CN105420175A (zh) * 2015-12-07 2016-03-23 河北省微生物研究所 枯草工程菌Bacillus subtilis及其构建以及利用其生产脱毛酶制剂的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101113455A (zh) * 2007-05-29 2008-01-30 云南大学 食线虫芽孢杆菌胞外侵染性中性蛋白酶基因及其应用
CN102533838A (zh) * 2012-02-08 2012-07-04 南京农业大学 一种高效分泌表达重组脂肪氧合酶的枯草杆菌表达载体及其应用
CN105420175A (zh) * 2015-12-07 2016-03-23 河北省微生物研究所 枯草工程菌Bacillus subtilis及其构建以及利用其生产脱毛酶制剂的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
宋有涛著: "《分子伴侣与蛋白质错误折叠》", 31 March 2012, 辽宁科学技术出版社 *
陈华友等: "枯草杆菌蛋白Sec分泌体系", 《PROCEEDINGS OF 2011 INTERNATIONAL CONFERENCE ON BIOMEDICINE AND ENGINEERING（ISBE 2011 V1）智能信息技术应用学会会议论文集》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109321556A (zh) * 2018-11-07 2019-02-12 河北省微生物研究所 脱毛酶制剂的制备方法及其在黄牛皮脱毛中的应用
CN109321556B (zh) * 2018-11-07 2022-01-18 河北省微生物研究所有限公司 脱毛酶制剂的制备方法及其在黄牛皮脱毛中的应用
CN109609484A (zh) * 2018-12-06 2019-04-12 河北省微生物研究所 复合脱毛酶制剂的制备方法及其在含小毛进口黄牛皮脱毛中的应用
CN109609484B (zh) * 2018-12-06 2022-06-10 河北省微生物研究所有限公司 复合脱毛酶制剂的制备方法及其在含小毛进口黄牛皮脱毛中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109576244B (zh) 一种新型脂肪酶及其制备与应用
CN108070606A (zh) 利用分子伴侣prsA构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用
CN107828806A (zh) 一种新型耐葡萄糖的β‑葡萄糖苷酶基因及其应用
CN107881181A (zh) 利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用
CN101182527B (zh) 一种碱性内切葡聚糖酶基因及其重组酶和应用
CN106497964B (zh) 细胞表面展示pet分解酶的重组毕赤酵母及构建与应用
CN102628056A (zh) 一种耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因及其应用
CN106801048A (zh) 一种低温碱性蛋白酶及其制备方法
CN109022396A (zh) 一种酶活提高的α-淀粉酶突变体及其应用
CN106635941B (zh) 一种来源于Aquifex aeolicus菌株的嗜热酯酶及其功能验证
CN106632625B (zh) 蛋白质pgr5在调控藻类抗氧化性中的应用
CN100999738A (zh) 一种高效表达甘露聚糖酶的多拷贝基因载体
CN101659962A (zh) 一种生长速度快且耐铀和耐热能力强的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株制备方法和应用
CN111394374A (zh) 一种编码纤维素酶家族GH30的纤维素酶基因gk2691及其应用
CN103103205A (zh) 编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因及其应用
CN101250509A (zh) 一种高温角质酶及其基因序列
CN105112348B (zh) 一种高产普鲁兰酶的重组短小芽孢杆菌及其应用
CN108795891A (zh) 一种葡萄糖氧化酶CnGODA及其基因与应用
CN110106159A (zh) 一种耐高温纤维素酶、编码基因及其制备方法
CN103290039B (zh) 一种来自动物粪便宏基因组的α-淀粉酶及其基因
CN103255072A (zh) 表达热稳定纤维素酶基因融合体61f-eg1的毕赤酵母工程菌株
CN106119272A (zh) 一种高效联产l‑苯甘氨酸及葡萄糖酸的策略
CN106434512B (zh) 一种来源于Aquifex aeolicus菌株的嗜热酯酶及其表达
CN101701196A (zh) 表达嗜热毛壳菌bgl基因的毕赤酵母工程菌株
CN115074303B (zh) 一种可降解羽毛的基因工程菌及其构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180406

RJ01 Rejection of invention patent application after publication