CN106497964B - 细胞表面展示pet分解酶的重组毕赤酵母及构建与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母及构建与应用，其构建为：(1)化学合成SEQ ID No.1所示的改良过的PET分解酶的核苷酸序列；从毕赤酵母GS115基因组中克隆出锚定蛋白基因的核苷酸序列；(2)利用OverlapPCR将锚定蛋白基因的核苷酸序列和改良过的PET分解酶基因的核苷酸序列连接得到融合序列；(3)将融合序列连接到毕赤酵母表达载体上，得到重组表达载体；(4)将重组表达载体转入宿主毕赤酵母中，得到细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母。本发明可以将PET分解酶锚定到细胞表面，固定化后的酶可做全细胞催化剂，相比于野生型稳定性高、回收方便、易控制、可反复利用。

Description

细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母及构建与应用
技术领域
本发明涉及酶的基因工程领域，尤其涉及一种细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母及构建与应用。
背景技术
白色污染是全球所有城市都存在的一种环境污染，主要是指人们在日常生活中随意丢弃的塑料垃圾对环境造成的破坏，包括常见的塑料杯、一次性饭盒、塑料袋等。而白色污染物的很大一部分是PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)制品。目前，世界上PET的年产量达到了2700多万吨，虽然PET不会直接对环境造成危害，但其废弃物对大气和微生物的抵抗性很强，在自然环境中的存在周期为16-48年，而且随着PET产业的快速发展，其废弃物的数量极其巨大，从环境行为和生态效应考虑，PET废弃物已成为全球性的环境污染有机物。
目前降解PET的方法主要有化学降解和生物降解两大类，在实际应用中PET的化学分解法主要有水解法和醇解法，此外还有氨解、胺解和热解等。但是这些方法通常成本较高、效率较低并且不环保，避免不了降解PET后给环境带来二次污染；而生物降解方法相对化学降解工艺更简单、更节能环保、且不会造成二次污染。因此生物降解将是从根本上解决废弃PET污染的最好方法。
PET分解酶是目前发现的唯一在细菌中发现的能降解PET的酶，分子量约为32KD，能将PET降解为单(2-羟乙基)对苯二甲酸或对苯二甲酸，其最大的优势是，与其他能降解PET的真菌中的酶LCC、TfH、FsC相比，其在低温段(20～40℃)的酶活显著高于其他酶，这意味着在实际应用中较容易达到适宜的反应条件，工业应用前景较好。但是该PET分解酶对PET的分解效率不高，分离纯化困难，不利用其大规模工业化应用。
参考文献：
[1]Shosuke Yoshida,Kazumi Hiraga,Toshihiko Takehana,Ikuo Taniguchi，Hironao Yamaji,Yasuhito Maeda,Kiyotsuna Toyohara,Kenji Miyamoto,YoshiharuKimura,Kohei Oda.A bacterium that degrades and assimilates poly(ethyleneterephthalate)[J].science，2016(351)：1196-1199.
发明内容
本发明的目的是克服现有PET分解酶对PET的分解效率不高，分离纯化困难，不利用其大规模工业化应用的不足，提供一种分解效率高，分离容易的细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母。
本发明的第二个目的是提供一种细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母的构建。
本发明的第三个目的是提供一种细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母的用途。
本发明的技术方案概述如下：
细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母的构建，包括如下步骤：
(1)化学合成SEQ ID No.1所示的改良过的PET分解酶的核苷酸序列；从毕赤酵母GS115基因组中克隆出锚定蛋白基因的核苷酸序列；
(2)利用OverlapPCR将锚定蛋白基因的核苷酸序列和改良过的PET分解酶基因的核苷酸序列连接得到融合序列；
(3)将融合序列连接到毕赤酵母表达载体上，得到重组表达载体；
(4)将重组表达载体转入宿主毕赤酵母中，得到细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母。
所述锚定蛋白基因为SEQ ID NO.2所述的GCW21、SEQ ID No.3所示的GCW51或SEQID No.4所述GCW61。
所述毕赤酵母表达载体为pPIC9。
上述构建构建的细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母。
上述细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母在全细胞催化分解PET的用途。
有益效果
野生菌株产酶能力有限、生长周期长、蛋白纯化过程复杂、易变性不易保存、生产成本高，限制了其推广应用。而毕赤酵母细胞表面展示技术可以将PET分解酶锚定到细胞表面，固定化后的酶可做全细胞催化剂，相比于野生型稳定性高、回收方便、易控制、可反复利用，适合工业大规模生产应用。
附图说明
图1为重组毕赤酵母PETase-GCW21、PETase-GCW51、PETase-GCW51全细胞催化酶活测定与野生型比较结果
图2为重组毕赤酵母细胞的免疫荧光显微照片；
图2-1为重组毕赤酵母PETase-GCW21免疫荧光结果；
图2-2为重组毕赤酵母PETase-GCW51免疫荧光结果；
图2-3为重组毕赤酵母PETase-GCW61免疫荧光结果。
具体实施方式
原PET分解酶基因Genbank登录号为NZ_BBYR01000074.1。
pPIC9质粒市售。
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。
实施例1细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母的构建及应用，包括如下步骤：
化学合成SEQ ID No.1所示的改良过的PET分解酶的核苷酸序列；
根据SEQ ID No.1序列设计上游引物P-F和下游引物P-R；
P-F：5’-3’CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGCAAACCAATCCTTATGCCCGTG
P-R：5’-3’ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGCTACAGTTGGCGGTACGAA
进行PCR,PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因片段，得PET分解酶基因。
根据GCW21(NCBI Reference Sequence:XM_002491407)，预测其信号肽后，设计上游引物21-F和下游引物21-R；
21-F：5’-3’GGTGGTGGAGGTAGTGGAGGAGGTGGTAGTGACCAGCGAATCTCTGTCAC
21-R：5’-3’CCGGAATTCTTATAACAAAGCAGCGGCGGCAATT
以毕赤酵母GS115菌株基因组DNA为模板，进行PCR，扩增得到锚定蛋白基因GCW21的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示扩增目的基因片段呈现亮带，回收目的基因片段，得GCW21基因。
利用OverlapPCR将锚定蛋白GCW21基因和改良过的PET分解酶基因的核苷酸序列通过SEQ ID No.5所示的linker连接得到融合序列；
根据锚定蛋白GCW21基因和改良过的PET分解酶基因，设计上游引物P-21/51/61-F和下游引物P-21-R；
P-21/51/61-F：5’-3’CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGG
P-21-R：5’-3’CCGGAATTCTTATAACAAAGCAGCG
进行PCR，扩增序列如SEQ ID NO.6的PETase-linker-GCW21。
将PETase-linker-GCW21基因和pPIC9载体同时用Xho I和EcoR I双酶切后，将得到的PETase-linker-GCW21酶切基因片段连接到双酶切后的pPIC9载体上；将上述连接产物转化到感受态细胞E.coli DH5α中，并挑取阳性克隆，在LB液体培养基上扩增后提取质粒，得到重组表达载体p9P21。
在上述步骤中，所述的目的基因片段与载体的连接采用thermo公司的T4DNA连接酶进行连接。
将获得的重组表达载体p9P21转入表达宿主大肠杆菌DH5α中，扩增重组质粒。
在上述步骤中，所述的连接产物的大肠杆菌的转化，按如下方法进行：
1)取一管感受态细胞E.coli DH5α于冰上缓慢溶解，加入要转化的质粒或连接产物(10μL)，轻混后冰浴30min；
2)42℃热激90s后，迅速冰浴5min；
3)加入900μL，37℃温浴的LB培养基，37℃摇床培养1h；
4)取200微升涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB选择平板上，37℃倒置培养12-16h；
5)挑取单克隆，进行后续质粒提取以及验证实验。
在上述步骤中，所述的连接产物阳性克隆验证，按如下方法进行：
1)从筛选平板上挑取p9P21转化子，接入5mL LB液体培养基中(含100μg/mL氨苄青霉素)，
37℃摇床培养12-16h；
2)取5mL菌液，用质粒小量提取试剂盒提取质粒；
3)取1μL质粒提取液进行Nanodrop检测，检测提取的质粒浓度；
4)将提取的质粒进行双酶切，验证基因片段与载体的连接效果；
5)将酶切验证正确的重组质粒进行测序或者进行其他实验，测序委托金唯智生物公司完成。
将扩增得到的质粒经过线性化，转入毕赤酵母GS115菌株基因组中，得到细胞表面展示重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW21。
电击法转化毕赤酵母GS115菌株细胞感受态制备
1)从新鲜的毕赤酵母GS115(His-)平板上挑取单菌落，转接至5mL YPD试管培养基中，30℃，250rpm培养过夜；
2)第二天从试管培养物中取0.1-0.5ml过夜培养物，接种至含500ml新鲜YPD培养基的2L摇瓶，过夜生长至OD600约为1.3-1.5；
3)从摇床上取酵母培养物，4℃，1500g离心5分钟以收集细胞，之后在100mLYPD-HEPES-DTT(100ml YPD中加入20ml pH 8.0的HEPES缓冲液，再加入2.5ml新鲜配制的1M的DTT)培养基中重新悬浮细胞，30℃在摇床上培养15分钟；从摇床上取下细胞，冰浴半小时；
4)从摇床上取下细胞，冰浴半小时；4℃，1500g离心5分钟以收集细胞，再用250ml预冷的灭菌水悬浮细胞；
5)如上离心，再用20ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞；
6)如上离心，用1ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5ml；如上离心，用500μL冷超纯水重新悬浮细胞，冰浴中备用。
电击法转化与转化子验证
1)取80μL上述细胞与5-20ug线性化的p9P21载体，转入预冷的0.2cm电转杯中，在冰上放置5min；
2)擦干电转杯外壁水滴，放在电转仪上；
3)设置酵母参数“fungi”，“pic”，点击Pulse；
4)取出电转杯，立即加入600微升L冰预冷1mol/L山梨醇，用枪轻轻吹打，在温和转移至1.5mL离心管中，30℃静置培养1h后加入600微升YPD培养基，30℃，200rpm摇床分别培养1h、3h后分成200-600μL等份，涂于MD平板上(设置感受态中不加入载体的对照组)；30℃避光培养48h后挑取单菌落于MD平板上进行筛选；
5)提取转化子的基因组DNA，进行PCR验证，比较电泳条带位置是否与阳性对照相同，PCR采用的引物为AOX上下游引物、目的基因扩增产物；
6)对细胞表面展示重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW21进行甘油保菌。
将细胞表面展示重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW21接种于BMM培养基中经甲醇诱导进行培养，培养24～120小时后离心收集菌体，用于PET降解，进行酶活测定。
进行重组酵母的诱导表达实验。
1)挑选细胞表面展示重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW21阳性转化子一个，从保存的甘油菌中挑取30uL置于5mL YPD试管培养基中，30℃/260～280rpm培养至OD600＝2-6。
2)转接入装有MGY、BMG或BMGY培养基的摇瓶中，于30℃/260～280rpm培养至OD600＝2-6(～16-18h)。
3)离心以收集菌体(或者室温放置沉淀以防止离心操作过程增加染菌几率)；用BMM培养基重悬菌体，使OD600＝1.0左右；将上步所得的菌液置于摇瓶中，用封口膜封口，放置于30℃/260～280rpm的摇床上继续生长.
4)每24h向培养基中添加1％甲醇,按时间点分别取菌液样品，取至120小时。
实施高效液相色谱仪(HPLC)检测酶活实验。
配置酶活反应所用到的一系列缓冲液。
1)PBS缓冲液：
用800ml双蒸水溶解8g NaCl,0.2g KCl,1.44g Na2HPO4,0.24g KH2PO4
用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水至1L，抽滤除菌。
2)甘氨酸/氢氧化钠缓冲液
3)磷酸磷酸二氢钠缓冲液pH＝2.50：配制0.02M H3PO4 1L，0.02M NaH2PO4，1L，大约1：3混合至pH＝2.50，抽滤。
4)甲醇：将甲醇用有机滤纸抽滤到丝口瓶中
5)终止液：90mL PBS中加入10mL DMSO。
制取进行测量酶活的样品。
1)取适量菌液于EP管，离心去上清。
2)加入适量甘氨酸/氢氧化钠缓冲液(pH＝9.0)重悬菌液，离心去上清，重复一次。
3)在恒温摇床里孵育反应。
4)反应结束后，离心，取上清，加入终止液。
5)加热灭活适宜时间。
6)实施HPLC测试酶活，从图1即可看到关于细胞表面展示重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW21降解PET的酶活数据。
将所述的细胞表面展示重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW21进行免疫荧光检测。
1)取反应液于4℃，12000rpm，离心1min，保留菌体。
2)PBS缓冲液对重组酵母细胞进行重悬，于4℃，12000rpm，离心1min，弃上清留菌体。
3)利用BSA的PBS缓冲液重悬菌体，于室温下反应1h，期间应使菌体上下混匀，于4℃，12000rpm，离心1min，保留菌体。
4)利用含Flag一抗的200uL的含BSA的PBS缓冲液重悬菌体，于4℃过夜处理，期间应使菌体上下混匀。次日于4℃，12000rpm，离心1min，保留菌体。
5)PBS缓冲液对重组酵母细胞进行重悬，室温处理10min，于4℃，12000rpm，离心1min，弃上清留菌体。
6)步骤(5)重复两次。
7)利用含1uLFlag二抗的200uL的PBS缓冲液重悬菌体，避光室温处理1h，期间应使菌体上下混匀，于4℃，12000rpm，离心1min，保留菌体。
8)PBS缓冲液对重组酵母细胞进行重悬，避光室温处理5min，期间应使菌体上下混匀，于4℃，12000rpm，离心1min，弃上清留菌体。
9)步骤(8)重复一次。
10)用PBS缓冲液重悬，每次取10uL于洁静载玻片制片，图2-1即可得到关于PETase-linker-GCW21序列在毕赤酵母中的表达情况。
实施例2细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母的构建及应用，包括如下步骤：
化学合成SEQ ID No.1所示的改良过的PET分解酶的核苷酸序列；
根据SEQ ID No.1序列设计上游引物P-F和下游引物P-R；
P-F：5’-3’CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGCAAACCAATCCTTATGCCCGTG
P-R：5’-3’ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGCTACAGTTGGCGGTACGAA
进行PCR,PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因片段，得PET分解酶基因。
根据GCW51(NCBI Reference Sequence:XP_002493782)，预测其信号肽后，设计上游引物51-F和下游引物51-R；
51-F：5’-3’GGTGGTGGAGGTAGTGGAGGAGGTGGTAGTGATGACGATGACTCATTAC
51-R：5’-3’CCGGAATTCCTAGATCAATAGGGCAATGG
以毕赤酵母GS115菌株基因组DNA为模板，进行PCR，扩增得到锚定蛋白基因GCW51的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示扩增目的基因片段呈现亮带，回收目的基因片段，得GCW51基因。
利用OverlapPCR将锚定蛋白GCW51基因和改良过的PET分解酶基因的核苷酸序列通过SEQ ID No.5所示的linker连接得到融合序列；
根据锚定蛋白GCW51基因和改良过的PET分解酶基因，设计上游引物P-21/51/61-F和下游引物51-R；
P-21/51/61-F：5’-3’CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGG
51-R：5’-3’CCGGAATTCCTAGATCAATAGGGCAATGG
进行PCR，扩增序列如SEQ ID NO.7的PETase-linker-GCW51。
将PETase-linker-GCW51基因和pPIC9载体同时用Xho I和EcoR I双酶切后，将得到的PETase-linker-GCW51酶切基因片段连接到双酶切后的pPIC9载体上；将上述连接产物转化到感受态细胞E.coli DH5α中，并挑取阳性克隆，在LB液体培养基上扩增后提取质粒，得到重组表达载体p9P51。
在上述步骤中，所述的目的基因片段与载体的连接采用thermo公司的T4DNA连接酶进行连接。
将获得的重组表达载体p9P51转入表达宿主大肠杆菌DH5α中，扩增重组质粒。
在上述步骤中，所述的连接产物的大肠杆菌的转化，按如下方法进行：
1)取一管感受态细胞E.coli DH5α于冰上缓慢溶解，加入要转化的质粒或连接产物(10μL)，轻混后冰浴30min；
2)42℃热激90s后，迅速冰浴5min；
3)加入900μL，37℃温浴的LB培养基，37℃摇床培养1h；
4)取200微升涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB选择平板上，37℃倒置培养12-16h；
5)挑取单克隆，进行后续质粒提取以及验证实验。
在上述步骤中，所述的连接产物阳性克隆验证，按如下方法进行：
1)从筛选平板上挑取p9P51转化子，接入5mL LB液体培养基中(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃摇床培养12-16h；
2)取5mL菌液，用质粒小量提取试剂盒提取质粒；
3)取1μL质粒提取液进行Nanodrop检测，检测提取的质粒浓度；
4)将提取的质粒进行双酶切，验证基因片段与载体的连接效果；
5)将酶切验证正确的重组质粒进行测序或者进行其他实验，测序委托金唯智生物公司完成。
将扩增得到的质粒经过线性化，转入毕赤酵母GS115菌株基因组中，得到细胞表面展示重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW51。
电击法转化毕赤酵母GS115菌株细胞感受态制备
1)从新鲜的毕赤酵母GS115(His-)平板上挑取单菌落，转接至5mL YPD试管培养基中，30℃，250rpm培养过夜；
2)第二天从试管培养物中取0.1-0.5ml过夜培养物，接种至含500ml新鲜YPD培养基的2L摇瓶，过夜生长至OD600约为1.3-1.5；
3)从摇床上取酵母培养物，4℃，1500g离心5分钟以收集细胞，之后在100mLYPD-HEPES-DTT(100ml YPD中加入20ml pH 8.0的HEPES缓冲液，再加入2.5ml新鲜配制的1M的DTT)培养基中重新悬浮细胞，30℃在摇床上培养15分钟；从摇床上取下细胞，冰浴半小时；
4)从摇床上取下细胞，冰浴半小时；4℃，1500g离心5分钟以收集细胞，再用250ml预冷的灭菌水悬浮细胞；
5)如上离心，再用20ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞；
6)如上离心，用1ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5ml；如上离心，用500μL冷超纯水重新悬浮细胞，冰浴中备用。
电击法转化与转化子验证
1)取80μL上述细胞与5-20ug线性化的p9P51载体，转入预冷的0.2cm电转杯中，在冰上放置5min；
2)擦干电转杯外壁水滴，放在电转仪上；
3)设置酵母参数“fungi”，“pic”，点击Pulse；
4)取出电转杯，立即加入600微升L冰预冷1mol/L山梨醇，用枪轻轻吹打，在温和转移至1.5mL离心管中，30℃静置培养1h后加入600微升YPD培养基，30℃，200rpm摇床分别培养1h、3h后分成200-600μL等份，涂于MD平板上(设置感受态中不加入载体的对照组)；30℃避光培养48h后挑取单菌落于MD平板上进行筛选；
5)提取转化子的基因组DNA，进行PCR验证，比较电泳条带位置是否与阳性对照相同，PCR采用的引物为AOX上下游引物、目的基因扩增产物；
6)对细胞表面展示重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW51进行甘油保菌。
将细胞表面展示重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW51接种于BMM培养基中经甲醇诱导进行培养，培养24～120小时后离心收集菌体，用于PET降解，进行酶活测定。
进行重组酵母的诱导表达实验。
1)挑选细胞表面展示重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW51阳性转化子一个，从保存的甘油菌中挑取30uL置于5mL YPD试管培养基中，30℃/260～280rpm培养至OD600＝2-6。
2)转接入装有MGY、BMG或BMGY培养基的摇瓶中，于30℃/260～280rpm培养至OD600＝2-6(16-18h)。
3)离心以收集菌体(或者室温放置沉淀以防止离心操作过程增加染菌几率)；用BMM培养基重悬菌体，使OD600＝1.0左右；将上步所得的菌液置于摇瓶中，用封口膜封口，放置于30℃/260～280rpm的摇床上继续生长.
4)每24h向培养基中添加1％甲醇,按时间点分别取菌液样品，取至120小时。
实施高效液相色谱仪(HPLC)检测酶活实验。
配置酶活反应所用到的一系列缓冲液。
1)PBS缓冲液：
用800ml双蒸水溶解8g NaCl,0.2g KCl,1.44g Na2HPO4,0.24g KH2PO4
用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水至1L，抽滤除菌。
2)甘氨酸/氢氧化钠缓冲液
3)磷酸磷酸二氢钠缓冲液pH＝2.50：配制0.02M H3PO4 1L，0.02M NaH2PO4，1L，大约1：3混合至pH＝2.50，抽滤。
4)甲醇：将甲醇用有机滤纸抽滤到丝口瓶中
5)终止液：90mL PBS中加入10mL DMSO。
制取进行测量酶活的样品。
1)取适量菌液于EP管，离心去上清。
2)加入适量甘氨酸/氢氧化钠缓冲液(pH＝9.0)重悬菌液，离心去上清，重复一次。
3)在恒温摇床里孵育反应。
4)反应结束后，离心，取上清，加入终止液。
5)加热灭活适宜时间。
6)实施HPLC测试酶活，从图1即可看到关于细胞表面展示重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW51降解PET的酶活数据。
将所述的细胞表面展示重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW51进行免疫荧光检测。
1)取反应液于4℃，12000rpm，离心1min，保留菌体。
2)PBS缓冲液对重组酵母细胞进行重悬，于4℃，12000rpm，离心1min，弃上清留菌体。
3)利用BSA的PBS缓冲液重悬菌体，于室温下反应1h，期间应使菌体上下混匀，于4℃，12000rpm，离心1min，保留菌体。
4)利用含Flag一抗的200uL的含BSA的PBS缓冲液重悬菌体，于4℃过夜处理，期间应使菌体上下混匀。次日于4℃，12000rpm，离心1min，保留菌体。
5)PBS缓冲液对重组酵母细胞进行重悬，室温处理10min，于4℃，12000rpm，离心1min，弃上清留菌体。
6)步骤(5)重复两次。
7)利用含1uLFlag二抗的200uL的PBS缓冲液重悬菌体，避光室温处理1h，期间应使菌体上下混匀，于4℃，12000rpm，离心1min，保留菌体。
8)PBS缓冲液对重组酵母细胞进行重悬，避光室温处理5min，期间应使菌体上下混匀，于4℃，12000rpm，离心1min，弃上清留菌体。
9)步骤(8)重复一次。
10)用PBS缓冲液重悬，每次取10uL于洁静载玻片制片，图2-2即可得到关于PETase-linker-GCW51序列在毕赤酵母中的表达情况。
实施例3细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母的构建及应用，包括如下步骤：
化学合成SEQ ID No.1所示的改良过的PET分解酶的核苷酸序列；
根据SEQ ID No.1序列设计上游引物P-F和下游引物P-R；
P-F：5’-3’CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGCAAACCAATCCTTATGCCCGTG
P-R：5’-3’ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGCTACAGTTGGCGGTACGAA
进行PCR,PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因片段，得PET分解酶基因。
根据GCW61(NCBI Reference Sequence:XP_002494322)，预测其信号肽后，设计上游引物61-F和下游引物61-R；
61-F：5’-3’GGTGGTGGAGGTAGTGGAGGAGGTGGTAGTAACAACCTATCAAACGAGAGT
61-R：5’-3’ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATCAATAGAGCAACACCGGC
以毕赤酵母GS115菌株基因组DNA为模板，进行PCR，扩增得到锚定蛋白基因GCW61的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示扩增目的基因片段呈现亮带，回收目的基因片段，得GCW61基因。
利用OverlapPCR将锚定蛋白GCW61基因和改良过的PET分解酶基因的核苷酸序列通过SEQ ID No.5所示的linker连接得到融合序列；
根据锚定蛋白GCW21基因和改良过的PET分解酶基因，设计上游引物P-21/51/61-F和下游引物61-R；
P-21/51/61-F：5’-3’CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGG
61-R：5’-3’ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATCAATAGAGCAACACCGGC
进行PCR，扩增序列如SEQ ID NO.8的PETase-linker-GCW61。
将PETase-linker-GCW61基因和pPIC9载体同时用Xho I和EcoR I双酶切后，将得到的PETase-linker-GCW61酶切基因片段连接到双酶切后的pPIC9载体上；将上述连接产物转化到感受态细胞E.coli DH5α中，并挑取阳性克隆，在LB液体培养基上扩增后提取质粒，得到重组表达载体p9P61。
在上述步骤中，所述的目的基因片段与载体的连接采用thermo公司的T4DNA连接酶进行连接。
将获得的重组表达载体p9P61转入表达宿主大肠杆菌DH5α中，扩增重组质粒。
在上述步骤中，所述的连接产物的大肠杆菌的转化，按如下方法进行：
1)取一管感受态细胞E.coli DH5α于冰上缓慢溶解，加入要转化的质粒或连接产物(10μL)，轻混后冰浴30min；
2)42℃热激90s后，迅速冰浴5min；
3)加入900μL，37℃温浴的LB培养基，37℃摇床培养1h；
4)取200微升涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB选择平板上，37℃倒置培养12-16h；
5)挑取单克隆，进行后续质粒提取以及验证实验。
在上述步骤中，所述的连接产物阳性克隆验证，按如下方法进行：
1)从筛选平板上挑取p9P61转化子，接入5mL LB液体培养基中(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃摇床培养12-16h；
2)取5mL菌液，用质粒小量提取试剂盒提取质粒；
3)取1μL质粒提取液进行Nanodrop检测，检测提取的质粒浓度；
4)将提取的质粒进行双酶切，验证基因片段与载体的连接效果；
5)将酶切验证正确的重组质粒进行测序或者进行其他实验，测序委托金唯智生物公司完成。
将扩增得到的质粒经过线性化，转入毕赤酵母GS115菌株基因组中，得到细胞表面展示重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW61。
电击法转化毕赤酵母GS115菌株细胞感受态制备
1)从新鲜的毕赤酵母GS115(His-)平板上挑取单菌落，转接至5mL YPD试管培养基中，30℃，250rpm培养过夜；
2)第二天从试管培养物中取0.1-0.5ml过夜培养物，接种至含500ml新鲜YPD培养基的2L摇瓶，过夜生长至OD600约为1.3-1.5；
3)从摇床上取酵母培养物，4℃，1500g离心5分钟以收集细胞，之后在100mLYPD-HEPES-DTT(100ml YPD中加入20ml pH 8.0的HEPES缓冲液，再加入2.5ml新鲜配制的1M的DTT)培养基中重新悬浮细胞，30℃在摇床上培养15分钟；从摇床上取下细胞，冰浴半小时；
4)从摇床上取下细胞，冰浴半小时；4℃，1500g离心5分钟以收集细胞，再用250ml预冷的灭菌水悬浮细胞；
5)如上离心，再用20ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞；
6)如上离心，用1ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5ml；如上离心，用500μL冷超纯水重新悬浮细胞，冰浴中备用。
电击法转化与转化子验证
1)取80μL上述细胞与5-20ug线性化的p9P61载体，转入预冷的0.2cm电转杯中，在冰上放置5min；
2)擦干电转杯外壁水滴，放在电转仪上；
3)设置酵母参数“fungi”，“pic”，点击Pulse；
4)取出电转杯，立即加入600微升L冰预冷1mol/L山梨醇，用枪轻轻吹打，在温和转移至1.5mL离心管中，30℃静置培养1h后加入600微升YPD培养基，30℃，200rpm摇床分别培养1h、3h后分成200-600μL等份，涂于MD平板上(设置感受态中不加入载体的对照组)；30℃避光培养48h后挑取单菌落于MD平板上进行筛选；
5)提取转化子的基因组DNA，进行PCR验证，比较电泳条带位置是否与阳性对照相同，PCR采用的引物为AOX上下游引物、目的基因扩增产物；
6)对细胞表面展示重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW61进行甘油保菌。
将细胞表面展示重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW61接种于BMM培养基中经甲醇诱导进行培养，培养24～120小时后离心收集菌体，用于PET降解，进行酶活测定。
进行重组酵母的诱导表达实验。
1)挑选细胞表面展示重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW61阳性转化子一个，从保存的甘油菌中挑取30uL置于5mL YPD试管培养基中，30℃/260～280rpm培养至OD600＝2-6。
2)转接入装有MGY、BMG或BMGY培养基的摇瓶中，于30℃/260～280rpm培养至OD600＝2-6(～16-18h)。
3)离心以收集菌体(或者室温放置沉淀以防止离心操作过程增加染菌几率)；用BMM培养基重悬菌体，使OD600＝1.0左右；将上步所得的菌液置于摇瓶中，用封口膜封口，放置于30℃/260～280rpm的摇床上继续生长.
4)每24h向培养基中添加1％甲醇,按时间点分别取菌液样品，取至120小时。
实施高效液相色谱仪(HPLC)检测酶活实验。
配置酶活反应所用到的一系列缓冲液。
1)PBS缓冲液：
用800ml双蒸水溶解8g NaCl,0.2g KCl,1.44g Na2HPO4,0.24g KH2PO4
用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水至1L，抽滤除菌。
2)甘氨酸/氢氧化钠缓冲液
3)磷酸磷酸二氢钠缓冲液pH＝2.50：配制0.02M H3PO4 1L，0.02M NaH2PO4，1L，大约1：3混合至pH＝2.50，抽滤。
4)甲醇：将甲醇用有机滤纸抽滤到丝口瓶中
5)终止液：90mL PBS中加入10mL DMSO。
制取进行测量酶活的样品。
1)取适量菌液于EP管，离心去上清。
2)加入适量甘氨酸/氢氧化钠缓冲液(pH＝9.0)重悬菌液，离心去上清，重复一次。
3)在恒温摇床里孵育反应。
4)反应结束后，离心，取上清，加入终止液。
5)加热灭活适宜时间。
6)实施HPLC测试酶活，从图1即可看到关于细胞表面展示重组毕赤酵母P.pastoris
PETase-GCW61降解PET的酶活数据。
将所述的细胞表面展示重组毕赤酵母P.pastoris PETase-GCW61进行免疫荧光检测。
1)取反应液于4℃，12000rpm，离心1min，保留菌体。
2)PBS缓冲液对重组酵母细胞进行重悬，于4℃，12000rpm，离心1min，弃上清留菌体。
3)利用BSA的PBS缓冲液重悬菌体，于室温下反应1h，期间应使菌体上下混匀，于4℃，12000rpm，离心1min，保留菌体。
4)利用含Flag一抗的200uL的含BSA的PBS缓冲液重悬菌体，于4℃过夜处理，期间应使菌体上下混匀。次日于4℃，12000rpm，离心1min，保留菌体。
5)PBS缓冲液对重组酵母细胞进行重悬，室温处理10min，于4℃，12000rpm，离心1min，弃上清留菌体。
6)步骤(5)重复两次。
7)利用含1uLFlag二抗的200uL的PBS缓冲液重悬菌体，避光室温处理1h，期间应使菌体上下混匀，于4℃，12000rpm，离心1min，保留菌体。
8)PBS缓冲液对重组酵母细胞进行重悬，避光室温处理5min，期间应使菌体上下混匀，于4℃，12000rpm，离心1min，弃上清留菌体。
9)步骤(8)重复一次。
10)用PBS缓冲液重悬，每次取10uL于洁静载玻片制片，图2-3即可得到关于PETase-linker-GCW61序列在毕赤酵母中的表达情况。
表1.基因以及其核苷酸序列

Claims (4)

1.细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母的构建方法，其特征是包括如下步骤：
(1)化学合成SEQ ID No.1所示的改良过的PET分解酶基因的核苷酸序列；从毕赤酵母GS115基因组中克隆出锚定蛋白基因的核苷酸序列；
(2)利用OverlapPCR将锚定蛋白基因的核苷酸序列和改良过的PET分解酶基因的核苷酸序列连接得到融合序列；
(3)将融合序列连接到毕赤酵母表达载体上，得到重组表达载体；
(4)将重组表达载体转入宿主毕赤酵母中，得到细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母；
所述锚定蛋白基因为核苷酸序列如SEQ ID NO.2所述的GCW21、核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示的GCW51或核苷酸序列如SEQ ID No.4所述GCW61。
2.根据权利要求1所述的细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母的构建方法，其特征是所述毕赤酵母表达载体为pPIC9。
3.权利要求1或2构建方法得到的细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母。
4.权利要求3的细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母在全细胞催化分解PET的用途。
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