CN106636158B - 细胞表面展示pet分解酶的重组大肠杆菌及构建及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了细胞表面展示PET分解酶的重组大肠杆菌及构建及应用，其构建方法为：(1)化学合成锚定蛋白和PETase基因；(2)利用PCR将锚定蛋白和PETase基因连接，得到融合序列；(3)将融合序列连接到大肠杆菌表达载体上，得到融合表达载体；(4)将融合表达载体转入表达宿主大肠杆菌中，得到细胞表面展示PET分解酶的重组大肠杆菌。本发明的构建将目的蛋白具有PET降解功能的PETase，通过inaK‑N、BrkA、AIDA或Lpp‑OmpA锚定蛋白定位到细胞表面，并具有生物催化活性高的特点，解决了野生菌株产PETase能力有限、生长周期长和降解速率慢的问题，且酶无需分离纯化，制备和使用简单。

Description

细胞表面展示PET分解酶的重组大肠杆菌及构建及应用
技术领域
本发明属于酶的基因工程技术领域，涉及一种细胞表面展示PET分解酶的重组大肠杆菌及构建及应用。
背景技术
当今塑料制品由于其廉价便捷的特性，广泛使用于工业生产和日常生活中，在为我们提供方便的同时也带来了严重的环境污染问题。其中聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是一种重要的塑料制品，如生活中常见的许多种饮料瓶都含有PET。
2016年3月日本科学家发现，细菌Ideonella sakaiensis可以利用PET作为主要的碳源和能源。该菌株可以产生一种能够催化分解PET生成乙二醇(TPA)、对苯二甲酸(MHET)以及(2-羟乙基)对苯二甲酸的分解酶，称聚对苯二甲酸乙二醇酯分解酶(PETase)。这也是人类历史上第一次在细菌中发现能分解PET的分解酶。该分解酶与传统的能分解PET的脂肪酶和角质酶不同，它的酶促反应比较温和，不需要高温即可进行有效的酶促反应，且该酶的PET分解效率相较其它PET分解酶较高。但由于野生菌株产酶能力有限、生长周期长和降解速率慢，极大地限制了该酶的推广应用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种细胞表面展示PET分解酶的重组大肠杆菌。
本发明的第二个目的是提供一种细胞表面展示PET分解酶的重组大肠杆菌的构建。
本发明的第三个目的是提供一种细胞表面展示PET分解酶的重组大肠杆菌的应用。
本发明的技术方案概述如下：
细胞表面展示PET分解酶的重组大肠杆菌的构建，包括如下步骤：
(1)化学合成锚定蛋白基因，化学合成如SEQ ID No.1所示的PETase基因；
(2)利用PCR将锚定蛋白基因的核苷酸序列和PETase基因的核苷酸序列连接，得到融合序列；
(3)将融合序列连接到大肠杆菌表达载体pET22b上，得到融合表达载体；
(4)将融合表达载体转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中，得到细胞表面展示PET分解酶的重组大肠杆菌。
所述锚定蛋白基因为SEQ ID No.2所示的inaK-N、SEQ ID No.3所示的Lpp-OmpA、SEQ ID No.4所示的BrkA或SEQ ID No.5所示的AIDA。
上述构建方法构建的细胞表面展示PET分解酶的重组大肠杆菌。
上述细胞表面展示PET分解酶的重组大肠杆菌在全细胞催化分解PET的用途。
本发明的有益效果：本发明的构建将目的蛋白具有PET降解功能的PETase，通过inaK-N、BrkA、AIDA或Lpp-OmpA锚定蛋白定位到细胞表面，并具有生物催化活性高的特点，解决了野生菌株产PETase能力有限、生长周期长和降解速率慢的问题，且酶无需分离纯化，其制备方法和使用都很简单。
附图说明
图1为重组细胞组分的Western blot分析图；
其中图1-1为BL21/pET22bNP细胞组分的Western blot分析图；
图1-2为BL21/pET22bLOP细胞组分的Western blot分析图；
图1-3为BL21/pET22bBP细胞组分的Western blot分析图；
图1-4为BL21/pET22bAP细胞组分的Western blot分析图。
图2为重组细胞组分的免疫荧光显微镜照片；
其中图2-1为BL21/pET22bNP细胞组分的免疫荧光显微镜照片；
图2-2为BL21/pET22bLOP细胞组分的免疫荧光显微镜照片；
图2-3为BL21/pET22bBP细胞组分的免疫荧光显微镜照片；
图2-4为BL21/pET22bAP细胞组分的免疫荧光显微镜照片；
图3为全细胞催化酶活测定。
具体实施方式
本发明所涉及的四个锚定蛋白基因序列来自Genbank。
pET22b市售。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：细胞表面展示PET分解酶的重组大肠杆菌(BL21/pET22bNP)的构建及应用
化学合成锚定蛋白如SEQ ID No.2所示的inaK-N基因，化学合成如SEQ ID No.1所示的PETase基因；
以inaK-基因序列和PETase基因序列为模板设计引物。
上游引物inaK-NF1 5’GGAATTCCATATGACACTTGATAAGGCGC 3’(划线部分为NdeI酶切位点)
下游引物inaK-NR1 5’ATAAGGATTGGTTTGAGTCTGTAAGTTCTGAGGGG 3’
上游引物inaK-NF2:5’CAGAACTTACAGACTCAAACCAATCCTTATGCCC 3’
下游引物inaK-NR2:5’CCCTCGAGGCTACAGTTGGCGGTACGA 3’(划线部分为XhoI酶切位点)
以人工合成的inaK-N基因和PETase基因为模板进行PCR扩增获得目的基因inaK-N和PETase。PCR反应参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸2min；34个循环后72℃保温10min。将PCR产物跑胶验证，回收目的条带。
overlap PCR：加入等质量的inaK-N和PETase PCR产物，反应参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸2min；12个循环后72℃保温10min。
第三轮PCR以第二轮overlap产物为模板，扩增目的基因inaK-N-PETase。反应参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec；53℃退火30sec；72℃延伸3min；22个循环后72℃保温10min。将PCR产物跑胶验证，回收目的条带(inaK-N基因的核苷酸序列和PETase基因的核苷酸序列连接后的融合序列)。
PCR纯化产物经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，回收目的片段，再与经过同样酶切处理过的表达载体pET-22连接构建质粒pET22bNP，4℃过夜。取10μL连接产物pET22bNP转化到100μlEscherichia coli DH5α感受态细胞中，涂布于含Amp的LB固体平板上，37℃温箱培养13h，从转化板上挑取几株单菌落，接种于5ml含有100μg/mL氨苄抗性的LB培养液中，37℃快速振荡12h。取600μL菌液加入400μL甘油混匀冻存，并用剩余菌液提取质粒送Genewiz公司测序，从而获得重组质粒pET22bNP。
将测序正确的pET22bNP质粒转化到100μl大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布与含氨苄抗性的LB固体平板上，37℃温箱培养13h，从转化板上挑取单克隆菌落，从而获得细胞表面展示PET分解酶的重组大肠杆菌BL21/pET22bNP，简称BL21/pET22bNP重组大肠菌株。
Western blot:
取BL21/pET22bNP重组大肠菌株200μl，离心去上清，加20μl培养基重悬，加4μl6×loading buffer。100℃加热15min。
SDS-PAGE上样后恒流跑胶
转膜：顺序为1层海绵2层滤纸蛋白胶硝酸纤维素膜2层滤纸，低温100V，60min。
封闭：0.5g脱脂奶粉溶于10ml PBST(5％)，室温孵育1h。PBST洗三次。
将2.5μl一抗溶于5ml脱脂牛奶中，4℃孵育过夜。PBST洗三次。
将2.5μl二抗溶于5ml PBST溶液中，室温孵育1h，PBST洗三次。
显色：等体积加入A液B液，均匀滴在膜上，曝光，见图1-1。
免疫荧光：
载玻片的处理：将70％酒精、1％HCL溶液(933ml 75％酒精、27ml 37％HCL、40mlH2O)加入玻片架白盒子，浸泡1h。将新的载玻片放在玻片架白盒子内，加入70％酒精、1％HCL溶液，泡1h。用ddH2O清洗浸泡过的载玻片。将玻片架拿出放在超净台内风干。载玻片上用疏水的笔在画大小适宜的圈，在超净台内操作。在圈圈里加入适量多聚赖氨酸(按1mg/1ml配制)。室温下结合10min后吸走，将玻片放入另一款白盒子内，室温下放置一晚。
取OD＝1 1ml的BL21/pET22bNP重组大肠菌株，500g 5min 4℃离心，用1ml pH＝7.0的HEPS洗三次，后用900ul HEPS重悬，并加入100ul 37％福尔马林，室温固定1h。用1mlpH＝7.0的HEPS洗三次，后用1ml PBS洗一次，再用200ul PBS重悬后，取适量加入疏水圈，室温结合15min后吸走。在疏水圈内加入适量的3％BSA(0.3g BSA溶于10ml PBST溶液)，封闭30min。在疏水圈内加入适量含有一抗(1:1000)的3％BSA(0.3g BSA溶于10ml PBST溶液)，在湿盒中加入适量水，将载玻片放入其中，4℃过夜。将玻片放在玻片架上，用PBST洗三次(静置即可)，每次5min。在圈圈内加入适量含有二抗的PBS溶液(1:200)，在湿盒中加入适量水，将载玻片放入其中，室温1h。PBST洗三次后，封片，镜检，见图2-1。
BL21/pET22bNP重组大肠菌株全细胞催化反应
PET膜的处理：用打孔器将PET膜裁成直径为2mm的圆片，选择完好的放在一个EP管中。双蒸水冲洗数次，加入Triton X 100加热wash 1～2次，双蒸水洗掉Triton X 100直到无泡，加入Na2CO3溶液加热冲洗若干次，双蒸水洗若干次，放在干净的培养皿中60℃烘干。
取BL21/pET22bNP重组大肠菌株，以0.1％的体积比接种量接种于含100μg/mL氨苄抗性的LB培养液中，37℃220rpm/min振荡12h，然后将此活化的菌液再以0.1％体积比接种量接种到新鲜的LB诱导培养液中，37℃振荡培养4-6h，待菌体密度OD600在0.6-1.2范围内，加入终浓度0.1mMIPTG16℃诱导培养24h左右。3500rpm离心5min,加入Glycine/NaOH pH＝9buffer重悬，3500rpm离心5min，重复上述操作。
加入Glycine/NaOH pH＝9buffer 100μL重悬，放入处理过的PET膜，开始反应。
一段时间后终止反应，4℃5000g离心10min，取上清，加入终止液，85℃灭活10min。测量240nm处产物MHET的吸收峰，见图3。
实施例2：细胞表面展示PET分解酶的重组大肠杆菌(BL21/pET22bLOP)的构建及应用
化学合成锚定蛋白如SEQ ID No.3所示的Lpp-OmpA基因，化学合成如SEQ ID No.1所示的PETase基因；
以Lpp-OmpA基因序列和PETase基因序列为模板设计引物。
上游引物LOP-F1 5’GGTCTTCCATATGAAAGCTACTAAACTGGTAC 3’(划线部分为NdeI酶切位点)
下游引物LOP-R1 5’CACTACCTCCACCACCGTTGTCCGGACGAGTG 3’
上游引物LOP-F2:5’CACTCGTCCGGACAACGGTGGTGGAGGTAGTG 3’
下游引物LOP-R2:5’CCCTCGAGGCTACAGTTGGCGGTACGA 3’(划线部分为XhoI酶切位点)
以人工合成Lpp-OmpA基因和PETase基因为模板进行PCR扩增获得目的基因Lpp-OmpA和PETase。PCR反应参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸2min；34个循环后72℃保温10min。将PCR产物跑胶验证，回收目的条带。
overlap PCR：加入等质量的Lpp-OmpA和PETase PCR产物，反应参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸2min；12个循环后72℃保温10min。
第三轮PCR以第二轮overlap产物为模板，扩增目的基因Lpp-OmpA-PETase。反应参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec；53℃退火30sec；72℃延伸3min；22个循环后72℃保温10min。将PCR产物跑胶验证，回收目的条带(Lpp-OmpA基因的核苷酸序列和PETase基因的核苷酸序列连接后的融合序列)。
PCR纯化产物经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，回收目的片段，再与经过同样酶切处理过的表达载体pET-22b连接构建质粒pET22bLOP，4℃过夜。取10μL连接产物pET22LOP转化到100μlEscherichia coli DH5α感受态细胞中，涂布于含Amp的LB固体平板上，37℃温箱培养13h，从转化板上挑取几株单菌落，接种于5ml含有100μg/mL氨苄抗性的LB培养液中，37℃快速振荡12h。取600μL菌液加入400μL甘油混匀冻存，并提取质粒送Genewiz公司测序，从而获得重组质粒pET22bLOP。
将测序正确的pET22bLOP质粒转化到100μl大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布与含氨苄抗性的LB固体平板上，37℃温箱培养13h，从转化板上挑取单克隆菌落，从而获得细胞表面展示PET分解酶的重组大肠杆菌BL21/pET22bLOP，简称BL21/pET22bLOP重组大肠菌株。
Western blot:
取BL21/pET22BLOP重组大肠杆菌株200μl，离心去上清，加20μl培养基重悬，加4μl6×loading buffer。100℃加热15min。
SDS-PAGE上样后恒流跑胶
转膜：顺序为1层海绵2层滤纸蛋白胶硝酸纤维素膜2层滤纸，低温100V，60min。
封闭：0.5g脱脂奶粉溶于10ml PBST(5％)，室温孵育1h。PBST洗三次。
将2.5μl一抗溶于5ml脱脂牛奶中，4℃孵育过夜。PBST洗三次。
将2.5μl二抗溶于5ml PBST溶液中，室温孵育1h，PBST洗三次。
显色：等体积加入A液B液，均匀滴在膜上，曝光，见图1-2。
免疫荧光：
载玻片的处理：将70％酒精、1％HCL溶液(933ml 75％酒精、27ml 37％HCL、40mlH2O)加入玻片架白盒子，浸泡1h。将新的载玻片放在玻片架白盒子内，加入70％酒精、1％HCL溶液，泡1h。用ddH2O清洗浸泡过的载玻片。将玻片架拿出放在超净台内风干。载玻片上用疏水的笔在画大小适宜的圈，在超净台内操作。在圈圈里加入适量多聚赖氨酸(按1mg/1ml配制)。室温下结合10min后吸走，将玻片放入另一款白盒子内，室温下放置一晚。
取OD＝1 1ml的BL21/pET22bLOP重组大肠菌株，500g 5min 4℃离心，用1ml pH＝7.0的HEPS洗三次，后用900ul HEPS重悬，并加入100ul 37％福尔马林，室温固定1h。用1mlpH＝7.0的HEPS洗三次，后用1ml PBS洗一次，再用200ul PBS重悬后，取适量加入疏水圈，室温结合15min后吸走。在疏水圈内加入适量的3％BSA(0.3g BSA溶于10ml PBST溶液)，封闭30min。在疏水圈内加入适量含有一抗(1:1000)的3％BSA(0.3g BSA溶于10ml PBST溶液)，在湿盒中加入适量水，将载玻片放入其中，4℃过夜。将玻片放在玻片架上，用PBST洗三次(静置即可)，每次5min。在圈圈内加入适量含有二抗的PBS溶液(1:200)，在湿盒中加入适量水，将载玻片放入其中，室温1h。PBST洗三次后，封片，镜检，见图2-2。
BL21/pET22bLOP重组大肠菌株全细胞催化反应
PET膜的处理：用打孔器将PET膜裁成直径为2mm的圆片，选择完好的放在一个EP管中。双蒸水冲洗数次，加入Triton X 100加热wash 1～2次，双蒸水洗掉Triton X 100直到无泡，加入Na2CO3溶液加热冲洗若干次，双蒸水洗若干次，放在干净的培养皿中60℃烘干。
取BL21/pET22bLOP重组大肠菌株，以0.1％的体积比接种量接种于含100μg/mL氨苄抗性的LB培养液中，37℃220rpm/min振荡12h，然后将此活化的菌液再以0.1％体积比接种量接种到新鲜的LB诱导培养液中，37℃振荡培养4-6h，待菌体密度OD600在0.6-1.2范围内，加入终浓度0.1mMIPTG16℃诱导培养24h左右。3500rpm离心5min,加入Glycine/NaOH pH＝9buffer重悬，3500rpm离心5min，重复上述操作。
加入Glycine/NaOH pH＝9buffer 100μL重悬，放入处理过的PET膜，开始反应。
一段时间后终止反应，4℃5000g离心10min，取上清，加入终止液，85℃灭活10min。测量240nm处产物MHET的吸收峰，见图3。
实施例3：细胞表面展示PET分解酶的重组大肠杆菌(BL21/pET22bBP)的构建及应用
化学合成锚定蛋白如SEQ ID No.4所示的BrkA基因，化学合成如SEQ ID No.1所示的PETase基因；
以BrkA基因序列和PETase基因序列为模板设计引物。
上游引物BrkA1 5’GGAATTCCATATGTACTTGGATCGTTTTCGGCA3’(划线部分为NdeI酶切位点)
下游引物BrkA2 5’ATAAGGATTGGTTTGCCCGGCGTCCTGAGCATGT3’
上游引物BrkA3 5’ATGCTCAGGACGCCGGGCAAACCAATCCTTATGCC3’
下游引物BrkA4 5’GAGATATTCCGGCGCTACAGTTGGCGGTACGA3’
上游引物BrkA5 5’GCCAACTGTAGCGCCGGAATATCTCTTAGTGTT3’
下游引物BrkA6 5’CCGCTCGAGTCAAAACGAGTACCGATAGCC 3’(划线部分为XhoI酶切位点)
以人工合成的BrkA基因和PETase基因为模板进行PCR扩增获得目的基因sp、PETase、βbarrel。PCR反应参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸3min；34个循环后72℃保温10min。将PCR产物跑胶验证，回收目的条带sp、PETase、βbarrel。
overlap PCR：体系中加入等质量的sp和PETase PCR产物，反应参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸2min；12个循环后72℃保温10min，获得目的条带sp-PETase.
第三轮PCR以第二轮overlap产物为模板，扩增目的基因sp-PETase。反应参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec；53℃退火30sec；72℃延伸2min；22个循环后72℃保温10min。将PCR产物跑胶验证，回收目的条带。
overlap PCR：加入等质量的sp-PETase和βbarrel PCR产物，反应参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸3min；12个循环后72℃保温10min，获得目的条带sp-PETase-βbarrel。
第三轮PCR以第二轮overlap产物为模板，扩增目的基因sp-PETase-βbarrel。反应参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec；53℃退火30sec；72℃延伸5min；22个循环后72℃保温10min。将PCR产物跑胶验证，回收目的条带(BrkA基因的核苷酸序列和PETase基因的核苷酸序列连接后的融合序列)。
PCR纯化产物经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，回收目的片段，再与经过同样酶切处理过的表达载体pET-22b连接构建质粒pET22bBP，4℃过夜。取10μL连接产物pET22BP转化到100μlEscherichia coli DH5α感受态细胞中，涂布于含Amp的LB固体平板上，37℃温箱培养13h，从转化板上挑取几株单菌落，接种于5ml含有100μg/mL氨苄抗性的LB培养液中，37℃快速振荡12h。取600μL菌液加入400μL甘油混匀冻存，并提取质粒送Genewiz公司测序，从而获得重组质粒pET22bBP。
将测序正确的pET22bBP质粒转化到100μl大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布与含氨苄抗性的LB固体平板上，37℃温箱培养13h，从转化板上挑取单克隆菌落，从而获得细胞表面展示PET分解酶的重组大肠杆菌BL21/pET22bBP，简称BL21/pET22bBP重组大肠菌株。
Western blot:
取BL21/pET22bBP重组大肠菌株，200μl，离心去上清，加20μl培养基重悬，加4μl 6×loading buffer。100℃加热15min。
SDS-PAGE上样后恒流跑胶
转膜：顺序为1层海绵2层滤纸蛋白胶硝酸纤维素膜2层滤纸，低温100V，60min。
封闭：0.5g脱脂奶粉溶于10ml PBST(5％)，室温孵育1h。PBST洗三次。
将2.5μl一抗溶于5ml脱脂牛奶中，4℃孵育过夜。PBST洗三次。
将2.5μl二抗溶于5ml PBST溶液中，室温孵育1h，PBST洗三次。
显色：等体积加入A液B液，均匀滴在膜上，曝光，见图1-3。
免疫荧光：
载玻片的处理：将70％酒精、1％HCL溶液(933ml 75％酒精、27ml 37％HCL、40mlH2O)加入玻片架白盒子，浸泡1h。将新的载玻片放在玻片架白盒子内，加入70％酒精、1％HCL溶液，泡1h。用ddH2O清洗浸泡过的载玻片。将玻片架拿出放在超净台内风干。载玻片上用疏水的笔在画大小适宜的圈，在超净台内操作。在圈圈里加入适量多聚赖氨酸(按1mg/1ml配制)。室温下结合10min后吸走，将玻片放入另一款白盒子内，室温下放置一晚。
取OD＝1 1ml的BL21/pET22bBP重组大肠菌株，500g 5min 4℃离心，用1ml pH＝7.0的HEPS洗三次，后用900ul HEPS重悬，并加入100ul 37％福尔马林，室温固定1h。用1mlpH＝7.0的HEPS洗三次，后用1ml PBS洗一次，再用200ul PBS重悬后，取适量加入疏水圈，室温结合15min后吸走。在疏水圈内加入适量的3％BSA(0.3g BSA溶于10ml PBST溶液)，封闭30min。在疏水圈内加入适量含有一抗(1:1000)的3％BSA(0.3g BSA溶于10ml PBST溶液)，在湿盒中加入适量水，将载玻片放入其中，4℃过夜。将玻片放在玻片架上，用PBST洗三次(静置即可)，每次5min。在圈圈内加入适量含有二抗的PBS溶液(1:200)，在湿盒中加入适量水，将载玻片放入其中，室温1h。PBST洗三次后，封片，镜检，见图2-3。
BL21/pET22bBP重组大肠菌株全细胞催化反应
PET膜的处理：用打孔器将PET膜裁成直径为2mm的圆片，选择完好的放在一个EP管中。双蒸水冲洗数次，加入Triton X 100加热wash 1～2次，双蒸水洗掉Triton X 100直到无泡，加入Na2CO3溶液加热冲洗若干次，双蒸水洗若干次，放在干净的培养皿中60℃烘干。
取BL21/pET22bBP重组大肠菌株,以0.1％的体积比接种量接种于含100μg/mL氨苄抗性的LB培养液中，37℃220rpm/min振荡12h，然后将此活化的菌液再以0.1％体积比接种量接种到新鲜的LB诱导培养液中，37℃振荡培养4-6h，待菌体密度OD600在0.6-1.2范围内，加入终浓度0.1mMIPTG16℃诱导培养24h左右。3500rpm离心5min,加入Glycine/NaOH pH＝9buffer重悬，3500rpm离心5min，重复上述操作。
加入Glycine/NaOH pH＝9buffer 100μL重悬，放入处理过的PET膜，开始反应。
一段时间后终止反应，4℃5000g离心10min，取上清，加入终止液，85℃灭活10min。测量240nm处产物MHET的吸收峰，见图3。
实施例4：细胞表面展示PET分解酶的重组大肠杆菌(BL21/pET22bAP)的构建及应用
化学合成锚定蛋白如SEQ ID No.5所示的AIDA基因，化学合成如SEQ ID No.1所示的PETase基因；
以人工合成的AIDA基因序列和PETase基因序列为模板设计引物。
上游引物sp-F 5’GGAATTGCATATGAATAAGGCCTACAGTATCATTTGGAGC 3’(划线部分为NdeI酶切位点)
下游引物sp-R 5’AGGATTGGTTTGCATGCAAATGCATTTCCG3’
上游引物PET-F 5’GGAAATGCATTTGCAATGCAAACCAATCCTTATG 3’
下游引物PET-R 5’ATGGTGATGGTGATGGTGGCTACAGTTGGCGGTAC3’
上游引物AIDA-F 5’CATCACCATCACCATGTGAATAACAATGGAAGC 3’
下游引物AIDA-R 5’CCCTCGAGTCAGAAGCTGTATTTAATCCCCAG 3’(划线部分为XhoI酶切位点)
以人工合成的AIDA基因和PETase基因为模板进行PCR扩增获得目的基因sp、PETase、βbarrel。PCR反应参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸3min；34个循环后72℃保温10min。将PCR产物跑胶验证，回收目的条带sp、PETase、βbarrel。
overlap PCR：体系中加入等质量的sp和PETase PCR产物，反应参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸2min；12个循环后72℃保温10min，获得目的条带sp-PETase.
第三轮PCR以第二轮overlap产物为模板，扩增目的基因sp-PETase。反应参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec；53℃退火30sec；72℃延伸2min；22个循环后72℃保温10min。将PCR产物跑胶验证，回收目的条带。
overlap PCR：加入等质量的sp-PETase和βbarrel PCR产物，反应参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸3min；12个循环后72℃保温10min，获得目的条带sp-PETase-βbarrel。
第三轮PCR以第二轮overlap产物为模板，扩增目的基因sp-PETase-βbarrel。反应参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec；53℃退火30sec；72℃延伸5min；22个循环后72℃保温10min。将PCR产物跑胶验证，回收目的条带(AIDA基因的核苷酸序列和PETase基因的核苷酸序列连接后的融合序列)。
PCR纯化产物经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，回收目的片段，再与经过同样酶切处理过的表达载体pET-22b连接构建质粒pET22bBP，4℃过夜。取10μL连接产物pET22AP转化到100μlEscherichia coli DH5α感受态细胞中，涂布于含Amp的LB固体平板上，37℃温箱培养13h，从转化板上挑取几株单菌落，接种于5ml含有100μg/mL氨苄抗性的LB培养液中，37℃快速振荡12h。取600μL菌液加入400μL甘油混匀冻存，并提取质粒送Genewiz公司测序，从而获得重组质粒pET22bAP。
将测序正确的pET22bAP质粒转化到100μl大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布与含氨苄抗性的LB固体平板上，37℃温箱培养13h，从转化板上挑取单克隆菌落，从而获得细胞表面展示PET分解酶的重组大肠杆菌BL21/pET22bAP，简称BL21/pET22bAP重组大肠菌株。
Western blot:
取BL21/pET22bAP重组大肠菌株200μl，离心去上清，加20μl培养基重悬，加4μl 6×loading buffer。100℃加热15min。
SDS-PAGE上样后恒流跑胶
转膜：顺序为1层海绵2层滤纸蛋白胶硝酸纤维素膜2层滤纸，低温100V，60min。
封闭：0.5g脱脂奶粉溶于10ml PBST(5％)，室温孵育1h。PBST洗三次。
将2.5μl一抗溶于5ml脱脂牛奶中，4℃孵育过夜。PBST洗三次。
将2.5μl二抗溶于5ml PBST溶液中，室温孵育1h，PBST洗三次。
显色：等体积加入A液B液，均匀滴在膜上，曝光，见图1-4。
免疫荧光：
载玻片的处理：将70％酒精、1％HCL溶液(933ml 75％酒精、27ml 37％HCL、40mlH2O)加入玻片架白盒子，浸泡1h。将新的载玻片放在玻片架白盒子内，加入70％酒精、1％HCL溶液，泡1h。用ddH2O清洗浸泡过的载玻片。将玻片架拿出放在超净台内风干。载玻片上用疏水的笔在画大小适宜的圈，在超净台内操作。在圈圈里加入适量多聚赖氨酸(按1mg/1ml配制)。室温下结合10min后吸走，将玻片放入另一款白盒子内，室温下放置一晚。
取OD＝1 1ml的BL21/pET22bAP重组大肠菌株，500g 5min 4℃离心，用1ml pH＝7.0的HEPS洗三次，后用900ul HEPS重悬，并加入100ul 37％福尔马林，室温固定1h。用1mlpH＝7.0的HEPS洗三次，后用1ml PBS洗一次，再用200ul PBS重悬后，取适量加入疏水圈，室温结合15min后吸走。在疏水圈内加入适量的3％BSA(0.3g BSA溶于10ml PBST溶液)，封闭30min。在疏水圈内加入适量含有一抗(1:1000)的3％BSA(0.3g BSA溶于10ml PBST溶液)，在湿盒中加入适量水，将载玻片放入其中，4℃过夜。将玻片放在玻片架上，用PBST洗三次(静置即可)，每次5min。在圈圈内加入适量含有二抗的PBS溶液(1:200)，在湿盒中加入适量水，将载玻片放入其中，室温1h。PBST洗三次后，封片，镜检，见图2-4。
BL21(DE3)/pET22bAP重组大肠菌株全细胞催化反应
PET膜的处理：用打孔器将PET膜裁成直径为2mm的圆片，选择完好的放在一个EP管中。双蒸水冲洗数次，加入Triton X 100加热wash 1～2次，双蒸水洗掉Triton X 100直到无泡，加入Na2CO3溶液加热冲洗若干次，双蒸水洗若干次，放在干净的培养皿中60℃烘干。
取BL21/pET22bAP重组大肠菌株，以0.1％的体积比接种量接种于含100μg/mL氨苄抗性的LB培养液中，37℃220rpm/min振荡12h，然后将此活化的菌液再以0.1％体积比接种量接种到新鲜的LB诱导培养液中，37℃振荡培养4-6h，待菌体密度OD600在0.6-1.2范围内，加入终浓度0.1mMIPTG16℃诱导培养24h左右。3500rpm离心5min,加入Glycine/NaOH pH＝9buffer重悬，3500rpm离心5min，重复上述操作。
加入Glycine/NaOH pH＝9buffer 100μL重悬，放入处理过的PET膜，开始反应。
一段时间后终止反应，4℃5000g离心10min，取上清，加入终止液，85℃灭活10min。测量240nm处产物MHET的吸收峰，见图3。

Claims (4)

1.细胞表面展示PET分解酶的重组大肠杆菌的构建，其特征是包括如下步骤：
(1)化学合成锚定蛋白基因，化学合成如SEQ ID No.1所示的PETase基因；
(2)利用PCR将锚定蛋白基因的核苷酸序列和PETase基因的核苷酸序列连接，得到融合序列；
(3)将融合序列连接到大肠杆菌表达载体pET22b上，得到融合表达载体；
(4)将融合表达载体转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中，得到细胞表面展示PET分解酶的重组大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的细胞表面展示PET分解酶的重组大肠杆菌的构建，其特征是所述锚定蛋白基因为SEQ ID No.2所示的inaK-N、SEQ ID No.3所示的Lpp-OmpA、SEQ ID No.4所示的BrkA或SEQ ID No.5所示的AIDA。
3.权利要求1-2之一构建的细胞表面展示PET分解酶的重组大肠杆菌。
4.权利要求3的细胞表面展示PET分解酶的重组大肠杆菌在全细胞催化分解PET的用途。
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