CN112063609A - 一种制备固定化d-木糖酸脱水酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备固定化D‑木糖酸脱水酶的方法，包括如下步骤：(1)将D‑木糖酸脱水酶的缓冲液与聚多巴胺修饰的四氧化三铁磁性纳米微球混合，得到混合液；(2)再向所得混合液中加入多巴胺，静置，离心，所得沉淀物即为固定化D‑木糖酸脱水酶。本发明利用核壳结构的磁性纳米材料对D‑木糖酸脱水酶实现高效封装，得到的酶催化剂具有方便的磁回收性能、长效的催化使用寿命、较好的酶活稳定性、更高的酶催化活性。整个制备过程不需要昂贵的设备和繁琐的制备工艺，简化了纳米酶制剂的合成步骤，最大限度的保证了制备过程中酶的活性。

Description

一种制备固定化D-木糖酸脱水酶的方法

技术领域

本发明涉及固定化酶领域，具体涉及一种制备固定化D-木糖酸脱水酶的方法。

背景技术

D-木糖酸脱水酶，在微生物生物体内参与许多重要代谢途径，能催化木糖酸脱水反应。利用微生物合成许多高附加值的化学品，例如乙二醇、三元醇和四元醇等，都需要D-木糖酸脱水酶的参与。然而在实际生产过程中，木糖酸脱水酶面临长时间反应和不适宜的催化环境，从而导致酶反应速率降低和酶失活的缺点。因此，利用固定化纳米颗粒对D-木糖酸脱水酶实现包埋封装，以满足D-木糖酸脱水酶在实际生产过程中的需要，从而提高木糖酸脱水酶的反应速率和稳定性，具有十分重要的经济价值。

利用磁性纳米材料对酶进行封装，可以实现利用磁力对生物催化剂的方便回收，并且材料本身较小的纳米尺寸，使得固定化酶具备尺寸效应，展现出更好的催化效果。例如，利用聚多巴胺等粘性材料修饰的磁性纳米材料可以对酶实现较好的吸附及固定的作用，然而这种固定化形式的酶蛋白仍然暴露在外部介质中，容易受环境的改变而失活。

因此，本发明对磁性纳米材料进行改性和再包裹，制备核壳结构的固定化载体，使得酶蛋白固定化在核壳结构的纳米夹层中，可以在不影响底物传质的情况下，实现对酶的高效封装。因此利用核壳结构的磁性纳米材料对D-木糖酸脱水酶进行固定化，以应对实际使用过程中的苛刻催化环境，具有十分重要的经济价值和现实意义。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种固定化D-木糖酸脱水酶的方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种制备固定化D-木糖酸脱水酶的方法，包括如下步骤：

(1)将D-木糖酸脱水酶的缓冲液与聚多巴胺修饰的四氧化三铁磁性纳米微球混合，得到混合液；

(2)再向所得混合液中加入多巴胺，静置，离心，所得沉淀物即为固定化D-木糖酸脱水酶。

步骤(1)中，所述的聚多巴胺修饰的四氧化三铁磁性纳米微球的制备方法为将四氧化三铁磁性纳米微球置于缓冲液中，超声分散，再向其中加入多巴胺，静置，离心，所得沉淀物即为聚多巴胺修饰的四氧化三铁磁性纳米微球。

其中，所述的四氧化三铁磁性纳米微球的粒径为300-400nm。

其中，所述的缓冲液为pH 8.0的Tris-Hcl缓冲液。

其中，所述的四氧化三铁磁性纳米微球与缓冲液的用量比为0.01～0.5mg/mL，优选为0.1mg/mL。

其中，所述的多巴胺的终浓度为0.5～5g/L，优选为1g/L。

其中，所述的静置的时间为0.5～2h，优选为1h。

步骤(1)中，所述的缓冲液为pH 8.0的Tris-Hcl缓冲液；控制缓冲液的用量，使D-木糖酸脱水酶的蛋白浓度为0.01～2mg/mL，优选为0.1mg/mL；D-木糖酸脱水酶的酶活为1.5U/mg。

酶活定义为：每分钟消耗木糖酸生成1μM的3-脱氧-D-甘油戊酮酸所需要的酶量为1U。

步骤(1)中，控制聚多巴胺修饰的四氧化三铁磁性纳米微球的用量，使得未修饰的四氧化三铁磁性纳米微球与D-木糖酸脱水酶的质量比为1:1～10:1，优选为1:1。

步骤(2)中，所述的混合液中多巴胺的终浓度为0.5～3g/L，优选为2g/L。

步骤(2)中，所述的静置的时间为1～5h，优选为2h。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

(1)本发明对磁性纳米材料进行改性和再包裹，制备核壳结构的固定化载体，使得酶蛋白固定化在核壳结构的纳米夹层中，可以在不影响底物传质的情况下，实现对酶的高效封装。

(2)本发明利用核壳结构的磁性纳米材料对D-木糖酸脱水酶实现高效封装，得到的酶催化剂具有方便的磁回收性能、长效的催化使用寿命、较好的酶活稳定性、更高的酶催化活性。整个制备过程不需要昂贵的设备和繁琐的制备工艺，简化了纳米酶制剂的合成步骤，最大限度的保证了制备过程中酶的活性。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

实施例1重组质粒的构建

在D-木糖酸脱水酶xylD基因的5’端和3端引物引入酶切位点BamHI和XhoI，对xylD基因和PRSFDuet-1进行双酶切，然后将xylD基因连接到PRSFDuet-1载体上(参照“CN201711190972.1一种酶反应合成1,2,4-丁三醇的方法”中的实施例1)。

实施例2重组菌株的构建

将实施例1构建好的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并涂布到终浓度为50mg/L的卡那霉素(Kana)的LB固体培养基上，37℃培养后进行菌落PCR验证。经菌落PCR验证正确的菌株再进行测序验证，其核苷酸序列如CN201711190972.1一种酶反应合成1,2,4-丁三醇的方法中的SEQ ID NO.2所示，最终将正确的菌株于终浓度为25vt％的甘油在-80℃超低温冰箱保藏。

实施例3培养方法

3.1平板培养

将保藏于-80℃冰箱的甘油菌取出，在含有50mg/L的Kana的平板上划线，后将平板于37℃培养箱培养12～14h。

3.2种子液培养

挑取平板上的单菌落接种到含有50mg/L Kana的10mL培养基中，在摇床200rpm，37℃培养8～10h。

3.3摇瓶发酵培养

将种子液接种到含有50mg/L Kana的100mL的LB液体培养基中，接种量为1vt％，200rpm，37℃培养。当OD600为0.6～0.8时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导，降温至30℃培养12h后，离心收集菌体。

实施例4蛋白的表达及纯化

将离心收集的菌体用纯水洗涤两次除去培养基，并震用纯水将菌体悬浮，利用超声破碎仪对菌体进行破碎(时间10min，超2s停3s，功率30％)。将所得细胞裂解物于离心机8000rpm，4℃，离心20min，去除沉淀，取上清跑蛋白胶。采用考马斯亮蓝法检测蛋白浓度。

将所得粗酶液，用0.2μm滤膜过滤，除去固体杂质。利用

蛋白纯化仪进行蛋白纯化。A相：上样缓冲为Tris 20mM，NaCl 0.5M，咪唑50mM，pH调至7.0。B相：洗脱缓冲为Tris 20mM，NaCl 0.5M，咪唑500mM，pH调至7.0。首先利用A相平衡镍柱，然后将粗酶液上样(1mL/min)，最后用100％的B相(2mL/min)将结合在镍柱上的目标蛋白洗脱下来，并在此时收集酶液，即为纯酶液。由于所得纯酶液中含大量NaCl和咪唑，且蛋白浓度较低，因此利用Millipore超滤管对其进行除盐及浓缩，即得D-木糖酸脱水酶，酶活为1.5U/mg。

实施例5D-木糖酸脱水酶的酶活检测方法

利用改进后的氨基脲的方法可以测定D-木糖酸脱水酶的酶活。酶活测定体系为：10mL PBS(50mM，pH 7.0)缓冲液中加入适量的D-木糖酸脱水酶，终浓度为0.5mM的D-木糖酸，37℃反应。反应5min后，取1mL反应液，加入20μL的三氟乙酸(TFA)终止反应，再加入300μL的氨基脲盐酸盐(含1.5wt％的三水合乙酸钠)，30℃水浴15min，用石英比色皿(1cm)在250nm处测定吸光度值。摩尔吸光系数为10.2mM^-1cm^-1。

酶活的定义为，每分钟消耗木糖酸生成1μM的3-脱氧-D-甘油戊酮酸所需要的酶量为1U。

实施例6磁性纳米材料的修饰

称取15mg的四氧化三铁磁性纳米微球(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，粒径300-400nm)，放入150mL的Tris-Hcl缓冲液中(50mM,pH 8.0)中超声30min进行分散，然后混合液中加入多巴胺，至多巴胺终浓度达到1g/L，静置1h得到表面附有聚多巴胺的四氧化三铁磁性纳米微球。高速离心(6000rpm，10min)，并用蒸馏水对沉淀物进行洗涤，共3次循环。沉淀物即为聚多巴胺修饰的四氧化三铁磁性纳米微球。

实施例7D-木糖酸脱水酶的固定化

将实施例4中的纯酶液加入到150mL的Tris-Hcl缓冲液中(50mM,pH 8.0)中，使得酶的蛋白浓度为0.1mg/mL；继续将实施例6中的聚多巴胺修饰的四氧化三铁磁性纳米微球全部加入到酶溶液中，4℃超声混合15min，然后混合液中加入多巴胺，至多巴胺终浓度达到2g/L，静置2h。然后高速离心(6000rpm，10min)，并用蒸馏水对沉淀物进行洗涤，共3次循环后。将沉淀物在真空冷冻干燥机进行干燥处理，即得到固定化D-木糖酸脱水酶催化剂A。

实施例8催化性能

取1mg的固定化D-木糖酸脱水酶催化剂(其中蛋白含量为0.05mg)加入到10mL PBS(50mM，pH 7.0)缓冲液中，并添加终浓度为0.5mM的D-木糖酸，37℃反应。反应5min后，取1mL反应液，加入20μL的三氟乙酸(TFA)终止反应，进行酶活检测。对照组为相同蛋白浓度的游离D-木糖酸脱水酶溶液。经过对比发现，固定化D-木糖酸脱水酶催化剂A的催化活性为游离D-木糖酸脱水酶溶液的1.7倍。

取1mg的固定化D-木糖酸脱水酶催化剂(其中蛋白含量为0.05mg)加入到10mL PBS(50mM，pH 7.0)缓冲液中，并添加终浓度为0.5mM的D-木糖酸，37℃反应。反应5min后，对固定化D-木糖酸脱水酶催化剂A进行回收，对上清液进行酶活检测，每次记为一个循环。在6个循环后，固定化D-木糖酸脱水酶催化剂A仍能保持87％的初始活性，而游离的D-木糖酸脱水酶催化剂不能重复，对比例1所制备的固定化D-木糖酸脱水酶催化剂B仅能保持32％的初始活性。

对比例1聚多巴胺修饰磁性材料固定化酶

取实施例6中制备的聚多巴胺修饰的四氧化三铁磁性纳米微球全部(约15mg)与，与实施例4中的纯酶液一起加入到150mL的Tris-Hcl缓冲液中(50mM,pH 8.0)中，使得酶的蛋白浓度为0.1mg/mL，4℃超声混合15min。然后高速离心(6000rpm，10min)，并用蒸馏水对沉淀物进行洗涤，共3次循环后。将沉淀物在真空冷冻干燥机进行干燥处理，即得到固定化D-木糖酸脱水酶催化剂B。

分别取1mg的固定化D-木糖酸脱水酶催化剂A(其中蛋白含量为0.05mg)和固定化D-木糖酸脱水酶催化剂B(其中蛋白含量为0.05mg)加入到10mL PBS(50mM，pH 7.0)缓冲液中，45℃环境中保持1h，后冷却至室温后，添加终浓度为0.5mM的D-木糖酸，37℃反应，反应5min后，取1mL反应液，加入20μL的三氟乙酸(TFA)终止反应，对固定化D-木糖酸脱水酶催化剂A和B进行回收，对上清液进行酶活检测，固定化D-木糖酸脱水酶催化剂A的催化活性为固定化D-木糖酸脱水酶催化剂B的1.5倍。

分别取1mg的固定化D-木糖酸脱水酶催化剂A(其中蛋白含量为0.05mg)和固定化D-木糖酸脱水酶催化剂B(其中蛋白含量为0.05mg)加入到10mL PBS(50mM，pH 6.0)缓冲液中，室温环境中保持1h后离心保留沉淀，并用10mL PBS(50mM，pH 7.0)缓冲液重悬后，添加终浓度为0.5mM的D-木糖酸，37℃反应，反应5min后，取1mL反应液，加入20μL的三氟乙酸(TFA)终止反应，对固定化D-木糖酸脱水酶催化剂A和B进行回收，对上清液进行酶活检测，固定化D-木糖酸脱水酶催化剂A的催化活性为固定化D-木糖酸脱水酶催化剂B的3.1倍。

综上所述，本发明种一种固定化D-木糖酸脱水酶的方法，利用核壳结构的磁性纳米材料对D-木糖酸脱水酶实现高效封装，即先对磁性纳米材料上面做了一层聚多巴胺粘附层，这一层材料增加了磁性纳米材料对于酶的吸附性，然后把酶吸附在磁性纳米材料上后，再涂一层聚多巴胺把酶包裹住，提高了封装的效果，可有效克服了传统固定化方案中对酶保护不足的弊端。这种合成策略提升了D-木糖酸脱水酶的催化活性和重复利用率。

本发明提供了一种制备固定化D-木糖酸脱水酶的方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (10)

1.一种制备固定化D-木糖酸脱水酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将D-木糖酸脱水酶的缓冲液与聚多巴胺修饰的四氧化三铁磁性纳米微球混合，得到混合液；

(2)再向所得混合液中加入多巴胺，静置，离心，所得沉淀物即为固定化D-木糖酸脱水酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的聚多巴胺修饰的四氧化三铁磁性纳米微球的制备方法为将四氧化三铁磁性纳米微球置于缓冲液中，超声分散，再向其中加入多巴胺，静置，离心，所得沉淀物即为聚多巴胺修饰的四氧化三铁磁性纳米微球。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的四氧化三铁磁性纳米微球的粒径为300-400nm。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的四氧化三铁磁性纳米微球与缓冲液的用量比为0.01～0.5mg/mL。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的多巴胺的终浓度为0.5～5g/L。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的静置的时间为0.5～2h。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，控制缓冲液的用量，使D-木糖酸脱水酶的蛋白浓度为0.01～2mg/mL，D-木糖酸脱水酶的酶活为1.5U/mg。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，控制聚多巴胺修饰的四氧化三铁磁性纳米微球的用量，使得未修饰的四氧化三铁磁性纳米微球与D-木糖酸脱水酶的质量比为1:1～10:1。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的混合液中多巴胺的终浓度为0.5～3g/L。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的静置的时间为1～5h。