CN116987650A - 一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌及其构建方法和应用，分别在嗜甲烷菌宿主中敲除L‑2,4‑二氨基丁酸转氨酶编码基因doeD；敲除四氢嘧啶水解酶编码基因doeA；敲除丙酮酸激酶编码基因pykA；过表达天冬氨酸激酶编码基因ask；双敲除L‑2,4‑二氨基丁酸转氨酶编码基因doeD和四氢嘧啶水解酶编码基因doeA；获得嗜甲烷工程菌MAHE01‑05；本发明还提供了所述构建方法得到的嗜甲烷工程菌在产四氢嘧啶上的应用；通过对原始菌及工程菌进行发酵培养实验，结果表明与原始菌株相比，嗜甲烷工程菌的四氢嘧啶产量提高了9.31％‑71.3％，本发明为利用嗜甲烷菌生产四氢嘧啶的商业化提供了借鉴。

Description

一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
面对地球平均温度的稳步上升及其对环境的相关不利影响，各国提出了减少温室气体的倡议。甲烷(CH4)是全球排放的第二大温室气体，占温室气体排放总量的12％，其全球变暖潜势是CO2的25倍。为了响应我国提出的双碳战略的号召，推进甲烷减排是重要策略之一。
四氢嘧啶是一种相容性溶质，可在多种耐盐细菌中维持渗透平衡。四氢嘧啶能够作为酶、蛋白质复合物、核酸和细胞膜的稳定剂，能在冷冻、高温、高紫外线辐射等极端条件下保护微生物，是微生物合成的最有价值的生物产品之一。目前，四氢嘧啶已经应用于医药、化妆品、食品和生物制剂等多个领域，年产量约为15000吨，价格约为1000美元/千克。目前工业上利用嗜盐微生物生产四氢嘧啶，尽管该工业过程具备丰富的设计经验和操作经验，但该过程以葡萄糖作为碳源使得成本高昂，降低了成本效益，并存在与粮食作物土地和食品市场竞争的问题。
嗜甲烷菌是以甲烷作为唯一碳源的微生物，是将甲烷转化为增值化学品和燃料的重要工业生物催化剂。近年来，在间歇式和连续式生物反应器中进行的研究表明，嗜甲烷菌可以表达参与四氢嘧啶合成的基因簇，能够利用甲烷合成四氢嘧啶。因此，利用其这一特性有望降低四氢嘧啶生产的成本及促进甲烷减排。尽管目前已经研究出嗜甲烷菌的全基因组序列和C1同化途径，但是利用甲烷合成的四氢嘧啶产量低，限制了基于嗜甲烷菌的四氢嘧啶工业生产的开发。因此通过对野生型嗜甲烷菌进行基因工程改造有望提高其四氢嘧啶的浓度。
专利申请CN202211421954.0公布了一种高产四氢嘧啶的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法和应用，以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，在hom和dapA基因位置整合了由乳糖启动子Ptac控制的T7噬菌体的RNA聚合酶基因T7RNAP，同时引入可诱导表达的T7RNA聚合酶基因；在pck基因位置整合了由T7强启动子控制来源于谷氨酸棒杆菌的lysC基因；导入重组载体pXMJ19-T7-ectABC，构建由T7强启动子控制的L-天冬氨酸-β-半醛到四氢嘧啶的合成通路。但是该专利申请是以葡萄糖为底物合成四氢嘧啶的谷氨酸棒杆工程菌，无法利用甲烷。
发明内容
为了解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌及其构建方法和应用，通过代谢工程改造增加四氢嘧啶合成前体二氨基丁酸及阻断四氢嘧啶降解为N-α-乙酰基-L-2,4-二氨基丁酸路径，并将其应用在四氢嘧啶的生产中，实现嗜甲烷菌合成四氢嘧啶的过程强化。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌，包括嗜甲烷菌宿主，该嗜甲烷菌宿主单敲除了L-2,4-二氨基丁酸转氨酶编码基因doeD、四氢嘧啶水解酶编码基因doeA或丙酮酸激酶编码基因pykA；或者该嗜甲烷菌宿主过表达了天冬氨酸激酶编码基因ask；或者该嗜甲烷菌宿主双敲除了L-2,4-二氨基丁酸转氨酶编码基因doeD和四氢嘧啶水解酶编码基因doeA；
所述基因doeD的核苷酸序列如图SEQ ID NO.1所示；
所述基因doeA的核苷酸序列如图SEQ ID NO.2所示；
所述基因pykA的核苷酸序列如图SEQ ID NO.3所示；
所述基因ask的核苷酸序列如图SEQ ID NO.4所示；
所述的嗜甲烷菌宿主选自甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基杆菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基微菌(Methylomicrobium)、甲基球形属(Methylosphaera)、甲基热菌(Methylocaldum)、甲基八叠球菌属(Methylosarcina)、甲基弯曲菌属(Methylosinus)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、甲基细胞菌属(Methylocella)和甲基帽菌属(Methylocapsa)中的一种或任意比例多种。
一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌的构建方法，步骤如下：
利用重叠PCR将doeD的上下游同源臂与抗性基因相连得到doeD基因敲除复合体，通过电转化的方式将嗜甲烷菌基因组上的doeD用基因敲除复合体替换，得到嗜甲烷工程菌MAHE01。
一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌的构建方法，步骤如下：
利用重叠PCR将doeA的上下游同源臂与抗性基因相连得到doeA基因敲除复合体，通过电转化的方式将嗜甲烷菌基因组上的doeA用基因敲除复合体替换，得到嗜甲烷工程菌MAHE02。
一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌的构建方法，步骤如下：
利用重叠PCR将pykA的上下游同源臂与抗性基因相连得到pykA基因敲除复合体，通过电转化的方式将嗜甲烷菌基因组上的pykA用基因敲除复合体替换，得到嗜甲烷工程菌MAHE03。
一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌的构建方法，步骤如下：
将基因ask与质粒pAWP89线性化载体相连构建重组质粒P01(pAWP89::ask)，然后转入嗜甲烷菌中，得到嗜甲烷工程菌MAHE04。
一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌的构建方法，步骤如下：
利用重叠PCR将doeD和doeA的上下游同源臂与抗性基因相连得到doeD和doeA基因敲除复合体，通过电转化的方式将嗜甲烷菌基因组上的doeD用基因敲除复合体替换，得到嗜甲烷工程菌MAHE05。
本发明提供一种上述构建方法得到的嗜甲烷工程菌MAHE01-05在产四氢嘧啶上的应用，包括如下步骤：
(1)将嗜甲烷工程菌经菌种活化、种子培养后，以体积分数5％-25％的接种量接种至氯化钠浓度为7.5-60g/L的液体NMS培养基中，于25-35℃、150rpm-300rpm的条件下培养60-96h，培养体系采用可封闭的气液两相体系，培养初始及过程中向培养体系内补充甲烷，甲烷的添加量为培养体系气相体积的4％-30％；
(2)取步骤(1)培养过程中的菌液，离心收获菌体，对菌体重悬后超声破碎并冷冻离心，将上清液过滤后获得四氢嘧啶；
所述的菌种活化步骤为：用接种环取保存的嗜甲烷工程菌液，在固体NMS培养基中划线，置于25～35℃培养箱中培养3～5天；
所述种子培养步骤为：用接种环刮取一环活化菌体，接种到液体NMS培养基中，于25～35℃、150～300rpm的条件下培养至OD600为2～3.5；
所述的NMS2培养基，包括：MgSO4·7H2O0.2-1g，CaCl2·6H2O0.008-0.012g，KNO30.8-1.2g，NaCl8-12g，磷酸盐缓冲溶液20mL，碳酸盐缓冲溶液50mL和微量元素溶液2-4mL，其余用蒸馏水补足1L；
所述的磷酸盐缓冲溶液，pH6.8，按照1L计，KH2PO42.77-5.44g·L-1和Na2HPO45.4-10.73g·L-1，余量为水；
所述的碳酸盐缓冲溶液总浓度是1M，是由140-700体积份的NaHCO3水溶液和60-300体积份的Na2CO3水溶液组成；
所述的微量元素溶液：Na2-EDTA·2H2O1-2g·L-1，FeSO4·7H2O1-2g·L-1，ZnSO4·7H2O0.5-0.8g·L-1，MnCl2·4H2O0.01-0.03g·L-1，H3BO30.01-0.03g·L-1，CoCl2·6H2O0.1-0.2g·L-1，CuCl2·2H2O0.4-0.6g·L-1，NiCl2·6H2O0.01-0.02g·L-1，Na2MO4·2H2O0.02-0.05g·L-1，余量为蒸馏水。
所述的嗜甲烷工程菌属优选甲基微菌Methylomicrobium，所述的甲基微菌是Methylotuvimicrobiumburyatense或Methylotuvimicrobiumalcaliphilum；
Methylotuvimicrobiumburyatense具体为Methylotuvimicrobiumburyatense5GB1S；Methylotuvimicrobium alcaliphilum具体为Methylotuvimicrobiumalcaliphilum20Z。
相对于现有技术，本发明有益效果体现在:
1、本发明提供了一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌，通过敲除doeD增加前体L-2,4-二氨基丁酸或者敲除doeA阻断四氢嘧啶降解为N-α-乙酰基-L-2,4-二氨基丁酸或者敲除pykA增加前体磷酸烯醇式丙酮酸或者过表达ask增加合成前体L-4-天冬氨酰磷酸，实现了四氢嘧啶合成路径中的碳通量调节。提高了以甲烷为碳源合成四氢嘧啶的产量。
2、由于增加四氢嘧啶合成前体和阻断四氢嘧啶降解路径，对于四氢嘧啶的高产同样重要，本发明提供了一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌，同时敲除doeD和doeA增加前体L-2,4-二氨基丁酸并阻断四氢嘧啶降解为N-α-乙酰基-L-2,4-二氨基丁酸，实现了四氢嘧啶合成路径的开源节流，提高了以甲烷为碳源合成四氢嘧啶的产量。
3、本发明提供了一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌应用，提高了以甲烷为碳源合成四氢嘧啶的产量，与原始嗜甲烷菌菌株相比，嗜甲烷工程菌株中四氢嘧啶产量提高了9.31％-71.3％，为利用甲烷生产四氢嘧啶的生物转化平台的发展提供借鉴。
附图说明
图1为本发明实施例1中的生长曲线图。
图2为本发明实施例1中的四氢嘧啶高效液相色谱图。
图3为本发明实施例1中的四氢嘧啶浓度-峰面积的标准曲线图。
图4为本发明实施例7中的生长曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置两次重复实验，结果取平均值。
实施例1、嗜甲烷菌的发酵培养及四氢嘧啶检测
供试菌：M.alcaliphilum20Z。
液体NMS培养基：MgSO4·7H2O0.2g，CaCl2·2H2O0.02g，KNO31.0g，NaCl0～70g，磷酸盐缓冲溶液20mL，碳酸盐缓冲溶液40mL，微量元素溶液1mL，用蒸馏水补足1L。磷酸盐缓冲溶液(pH6.8)：KH2PO45.44g·L-1和Na2HPO45.68g·L-1，余量为水。碳酸盐缓冲溶液：NaHCO375.6g·L-1和Na2CO310.5g·L-1，余量为蒸馏水。微量元素溶液：Na2-EDTA5.0g·L-1，FeSO4·7H2O2.0g·L-1，ZnSO4·7H2O0.3g·L-1，MnCl2·4H2O0.03g·L-1，H3BO30.03g·L-1，CoCl2·6H2O0.2g·L-1，CuSO4·5H2O1.2g·L-1，NiCl2·6H2O0.05g·L-1，Na2MO4·2H2O0.05g·L-1，Na2WO4·2H2O0.3g·L-1，余量为蒸馏水。
液体NMS培养基，NaCl含量具体为7.5g、60g。
固体NMS培养基：与液体NMS配方相同，差异仅在于每升加入15g琼脂粉。
固体NMS培养基中，NaCl含量具体为7.5g。
(1)活化供试菌：将保存的供试菌接种到固体NMS培养基上，30℃静置培养4-5天，即得到活化后的供试菌落；
(2)取固体NMS培养基上的供体菌，接种一环至装有液体NMS培养基的300mL摇瓶中，其中液体量为50mL，含0.75％氯化钠。30℃、200rpm下培养36h，得到种子液。种子液的OD600为2.0～3.5。培养体系采用可封闭的气液两相体系，培养初始及过程中向培养体系内补充甲烷，甲烷的添加量为培养体系气相体积的25％。
(3)取步骤(2)中的种子液5mL，接种至装有液体NMS培养基的300mL摇瓶中，接种后液体量为50mL，含6％氯化钠。30℃、200rpm下培养84h。每隔12h检测培养液的OD600，绘制生长曲线。生长曲线见图1。
(4)取培养至84h的菌液1mL，4℃、10000rpm离心5min，弃上清；菌体用1mL蒸馏水重悬；重悬后的菌液超声破碎6min，超声3s间隔9s，超声变幅杆为Φ2，超声功率为10％；超声破碎后的液体4℃、10000rpm离心5min，收集上清液，用0.22μm滤膜过滤，存于样品瓶中，置于4℃冰箱待测。
(5)测定步骤(4)中样品瓶中的四氢嘧啶浓度。使用高效液相色谱法进行定量测定，高效液相色谱仪采用岛津LC-2030，色谱柱采用岛津InertSustainC18液相柱(4.6mm×150mm)。流动相为5％甲醇和95％40mM磷酸二氢钠溶液(其中添加10mM庚烷磺酸钠)的混合物，流速1mL·min-1，柱温25℃，进样量5μL。经紫外检测器检测，波长为210nm。四氢嘧啶的高效液相色谱图见图2。四氢嘧啶浓度-峰面积的标准曲线见图3。经高效液相色谱检测，在培养至84h时培养液中的四氢嘧啶产量可达到55.51mg·L-1。
实施例2、产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌MAHE01的构建
供试菌：M.alcaliphilum20Z。
液体NMS培养基：与实例1的液体NMS培养基相同。
液体NMS培养基中，NaCl含量具体为7.5g。
固体NMS培养基：与液体NMS配方相同，差异仅在于每升加入15g琼脂粉。
固体NMS培养基中，NaCl含量具体为7.5g。
(1)根据NCBI嗜甲烷菌ASM96853v1基因组中doeD基因序列设计两对引物，通过PCR扩增获得doeD基因上游同源臂950bp及下游同源臂950bp，设计两对引物如下：
doeDL-F:5’-gacgtcatattcggatggcac-3’
doeDL-R:5’-ACCGAACAGGCTTATGTCAAgaatactctccttacggttgaca-3’
doeDR-F:5’-ACCCAAGTACCGCCACCTAAatgattgaacgcgacgac-3’
doeDR-R:5’-atgccgattgaatagcccg-3’
(2)根据pCM351中GmR序列设计一对引物，通过PCR扩增获得GmR基因，设计一对引物如下:
Gm-F:5’-TTGACATAAGCCTGTTCGGTTC-3’
Gm-R:5’-TTAGGTGGCGGTACTTGGGT-3’
(3)使用2×PhantaMaxMasterMix高保真DNA聚合酶，以doeD基因上、下游同源臂片段、GmR基因序列作为模板进行重叠PCR，经重叠PCR扩增得到基因敲除复合体。
(4)将供试菌接入液体NMS培养基中培养至对数生长期，OD600为2；将菌液4℃、5000×g离心10min，弃上清；用50mL冷水重悬菌体，再4℃、5000×g离心10min，弃上清；用1mL蒸馏水重悬菌体，得到感受态细胞。
5)取50μL步骤(4)得到的感受态细胞，加入500ng步骤(3)得到的基因敲除复合体并轻轻混合；然后，将混合物转移到1毫米间隙的低温电击杯中，使用电穿孔仪进行电转(条件设置为1.5kV、25μF和200Ω)；然后，采用10mL液体NMS培养基30℃复苏培养12～24小时；室温、5000×g离心10min，弃上清，将菌体沉淀涂布于含50μg·mL-1庆大霉素的固体NMS培养基平板，30℃培养4～7天，筛选重组子。
(6)重组子通过PCR鉴定后，若测序无碱基突变，即得到嗜甲烷工程菌MAHE01。
(7)将嗜甲烷工程菌MAHE01涂布于含有50μg·mL-1庆大霉素的固体NMS培养基上培养3～5天完成扩大培养，取固体NMS培养基上的嗜甲烷工程菌MAHE转到含有50μg·mL-1庆大霉素的液体NMS培养基中，其中液体量为50mL。在30℃、200rpm条件下培养至对数生长期，保存菌种。
实施例3、产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌MAHE02的构建
供试菌：M.alcaliphilum20Z。
液体NMS培养基：与实例1的液体NMS培养基相同。
液体NMS培养基中，NaCl含量具体为7.5g。
固体NMS培养基：与液体NMS配方相同，差异仅在于每升加入15g琼脂粉。
固体NMS培养基中，NaCl含量具体为7.5g。
(1)根据NCBI嗜甲烷菌ASM96853v1基因组中doeA基因序列设计两对引物，通过PCR扩增获得doeA基因上游同源臂950bp及下游同源臂950bp，设计两对引物如下：
doeAL-F:5’-ctaatgcggtcgaaaccg-3’
doeAL-R:5’-ACCGAACAGGCTTATGTCAAtcataaggcctccaaagcat-3’
doeAR-F:5’-ACCCAAGTACCGCCACCTAAgcaaggagggttactcaatg-3’
doeAR-R:5’-ctgcatcggccagtacgat-3’
(2)通过PCR扩增获得GmR基因，参照实施例2；
(3)使用2×PhantaMaxMasterMix高保真DNA聚合酶，以doeA基因上、下游同源臂片段、GmR基因序列作为模板进行重叠PCR，经重叠PCR扩增得到基因敲除复合体。
(4)培养获得感受态细胞，参考实施例2；
(5)通过电转实现同源重组，复苏后筛选重组子，参考实施例2；
(6)重组子通过PCR鉴定后，若测序无碱基突变，即得到嗜甲烷工程菌MAHE02。
(7)将嗜甲烷工程菌MAHE02涂布于含有50μg·mL-1庆大霉素的固体NMS培养基上培养3-5天完成扩大培养，取固体NMS培养基上的嗜甲烷工程菌MAHE转到含有50μg·mL-1庆大霉素的液体NMS培养基中，其中液体量为50mL。在30℃、200rpm条件下培养至对数生长期，保存菌种。
实施例4、产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌MAHE03的构建
供试菌：M.alcaliphilum20Z。
液体NMS培养基：与实例1的液体NMS培养基相同。
液体NMS培养基中，NaCl含量具体为7.5g。
固体NMS培养基：与液体NMS配方相同，差异仅在于每升加入15g琼脂粉。
固体NMS培养基中，NaCl含量具体为7.5g。
(1)根据NCBI嗜甲烷菌ASM96853v1基因组中pykA基因序列设计两对引物，通过PCR扩增获得pykA基因上游同源臂950bp及下游同源臂950bp，设计两对引物如下：
pykAL-F:5’-gccaaatacagtgcatcgat-3’
pykAL-R:5’-ACCGAACAGGCTTATGTCAAtcggaattccgacgggtt-3’
pykAR-F:5’-ACCCAAGTACCGCCACCTAAgattaagcatcaaaaaaatgttgcg-3’
pykAR-R:5’-tcgaaatccggttcgacac-3’
(2)通过PCR扩增获得GmR基因，参照实施例2；
(3)使用2×PhantaMaxMasterMix高保真DNA聚合酶，以pykA基因上、下游同源臂片段、GmR基因序列作为模板进行重叠PCR，经重叠PCR扩增得到基因敲除复合体。
(4)培养获得感受态细胞，参考实施例2；
(5)通过电转实现同源重组，复苏后筛选重组子，参考实施例2；
(6)重组子通过PCR鉴定后，若测序无碱基突变，即得到嗜甲烷工程菌MAHE03。
(7)将嗜甲烷工程菌MAHE03涂布于含有50μg·mL-1庆大霉素的固体NMS培养基上培养3～5天完成扩大培养，取固体NMS培养基上的嗜甲烷工程菌MAHE转到含有50μg·mL-1庆大霉素的液体NMS培养基中，其中液体量为50mL。在30℃、200rpm条件下培养至对数生长期，保存菌种。
实施例5、产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌MAHE04的构建
供试菌：M.alcaliphilum20Z。
(1)根据NCBI甲烷氧化菌ASM96853v1基因组中ask基因序列设计一对引物，通过PCR方法获得ask基因，设计一对引物如下:
ask-F:5’-tattcacacaggaaacagctatgggattattcgtatataaattcggtgg-3’
ask-R:5’-acgcatcttcccgacaactactaactttctatcggctctctatcc-3’
(2)根据pAWP89序列设计一对引物，通过PCR方法获得pAWP89线性化载体，设计一对引物如下:
P89-F:5’-tagttgtcgggaagatgcg-3’
P89-R:5’-agctgtttcctgtgtgaatacc-3’
(3)步骤2)所得pAWP89线性化载体经过限制性内切酶DpnI于37℃酶切2h，80℃保持20min失活DpnI酶，所得酶切产物通过胶回收纯化即得纯化后pAWP89线性化载体；
(4)用诺唯赞一步克隆试剂盒对步骤(1)和步骤(3)获得的ask基因和pAWP89线性化载体进行重组反应。重组体系中包含等摩尔比的线性化载体和基因片段，多片段重组条件为50℃反应15-30min。重组反应结束后，利用热击转化的方法将产物转移至E.coli S17。经PCR鉴定条带大小正确和测序无突变，表明重组质粒P01(pAWP89::ask)构建成功。
(5)重组质粒P01(pAWP89::ask)通过双亲结合的方式转入供试菌即得嗜甲烷工程菌MAHE04。
实施例6、产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌MAHE05的构建
供试菌：M.alcaliphilum20Z。
液体NMS培养基：与实例1的液体NMS培养基相同。
液体NMS培养基中，NaCl含量具体为7.5g。
固体NMS培养基：与液体NMS配方相同，差异仅在于每升加入15g琼脂粉。
固体NMS培养基中，NaCl含量具体为7.5g。
(1)根据NCBI嗜甲烷菌ASM96853v1基因组中doeD和doeA基因序列设计两对引物，通过PCR扩增获得doeD和doeA基因上游同源臂950bp及下游同源臂950bp，设计两对引物如下：
doeDdoeAL-F:5’-gacgtcatattcggatggcac-3’
doeDdoeAL-R:5’-ACCGAACAGGCTTATGTCAAgaatactctccttacggttgaca-3’
doeDdoeAR-F:5’-ACCCAAGTACCGCCACCTAAgcaaggagggttactcaatg-3’
doeDdoeAR-R:5’-ctgcatcggccagtacgat-3’
(2)通过PCR扩增获得GmR基因，参照实施例2；
(3)使用2×PhantaMaxMasterMix高保真DNA聚合酶，以doeD和doeA基因上、下游同源臂片段、GmR基因序列作为模板进行重叠PCR，经重叠PCR扩增得到基因敲除复合体。
(4)培养获得感受态细胞，参考实施例2；
(5)通过电转实现同源重组，复苏后筛选重组子，参考实施例2；
(6)重组子通过PCR鉴定后，若测序无碱基突变，即得到嗜甲烷工程菌MAHE05。
(7)将嗜甲烷工程菌MAHE05涂布于含有50μg·mL-1庆大霉素的固体NMS培养基上培养3～5天完成扩大培养，取固体NMS培养基上的嗜甲烷工程菌MAHE转到含有50μg·mL-1庆大霉素的液体NMS培养基中，其中液体量为50mL。在30℃、200rpm条件下培养至对数生长期，保存菌种。
实施例7、嗜甲烷工程菌MAHE01-05的发酵培养及四氢嘧啶检测供试菌：嗜甲烷工程菌MAHE01-05。
液体NMS培养基：与实例1的液体NMS培养基相同。
液体NMS培养基中，NaCl含量具体为7.5g、60g。
固体NMS培养基：与液体NMS配方相同，差异仅在于每升加入15g琼脂粉。
固体NMS培养基中，NaCl含量具体为7.5g。
1)活化嗜甲烷工程菌MAHE01-05，参照实施例1；
2)培养嗜甲烷工程菌MAHE01-05种子液，参照实施例1；
3)利用嗜甲烷工程菌MAHE01-05合成四氢嘧啶：取步骤2)中的种子液5mL，接种至装有液体NMS培养基的300mL摇瓶中，接种后液体量为50mL，含6％氯化钠。30℃、200rpm下培养84h。每隔12h检测培养液的OD600，绘制生长曲线。生长曲线见图4。
4)取培养至84h的菌液1mL，4℃、10000rpm离心5min，弃上清；菌体用1mL蒸馏水重悬；重悬后的菌液超声破碎6min，超声3s间隔9s，超声变幅杆为Φ2，超声功率为10％；超声破碎后的液体4℃、10000rpm离心5min，收集上清液，用0.22μm滤膜过滤，存于样品瓶中，置于4℃冰箱待测。
5)测定步骤4)中样品瓶中的四氢嘧啶浓度。使用高效液相色谱法进行定量测定，高效液相色谱仪采用岛津LC-2030，色谱柱采用岛津InertSustainC18液相柱(4.6mm×150mm)。流动相为5％甲醇和95％40mM磷酸二氢钠溶液(其中添加10mM庚烷磺酸钠)的混合物，流速1mL·min-1，柱温25℃，进样量5μL。经紫外检测器检测，波长为210nm。经高效液相色谱检测，MAHE01-05在培养至84h时培养液中的四氢嘧啶产量可达到87.51、95.15、76.55、60.68、95.12mg·L-1。
结合对比实施例1，通过对嗜甲烷菌进行代谢工程改造获得嗜甲烷工程菌后，将其应用在生产四氢嘧啶上，四氢嘧啶产量提高了9.31％-71.3％。
结果表明，通过对嗜甲烷菌进行代谢工程改造，采用本发明所述嗜甲烷工程菌，大大提高了以甲烷为碳源合成四氢嘧啶的产量。
本发明序列表如下：
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Claims (10)

1.一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌，包括嗜甲烷菌宿主，其特征在于，该嗜甲烷菌宿主单敲除了L-2,4-二氨基丁酸转氨酶编码基因doeD、四氢嘧啶水解酶编码基因doeA或丙酮酸激酶编码基因pykA；或者该嗜甲烷菌宿主过表达了天冬氨酸激酶编码基因ask；或者该嗜甲烷菌宿主双敲除了L-2,4-二氨基丁酸转氨酶编码基因doeD和四氢嘧啶水解酶编码基因doeA；
所述基因doeD的核苷酸序列如图SEQ ID NO.1所示；
所述基因doeA的核苷酸序列如图SEQ ID NO.2所示；
所述基因pykA的核苷酸序列如图SEQ ID NO.3所示；
所述基因ask的核苷酸序列如图SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌，其特征在于，所述的嗜甲烷菌宿主选自甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基杆菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基微菌(Methylomicrobium)、甲基球形属(Methylosphaera)、甲基热菌(Methylocaldum)、甲基八叠球菌属(Methylosarcina)、甲基弯曲菌属(Methylosinus)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、甲基细胞菌属(Methylocella)和甲基帽菌属(Methylocapsa)中的一种或任意比例多种。
3.根据权利要求1或2所述的一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：
利用重叠PCR将doeD的上下游同源臂与抗性基因相连得到doeD基因敲除复合体，通过电转化的方式将嗜甲烷菌基因组上的doeD用基因敲除复合体替换，得到嗜甲烷工程菌MAHE01。
4.根据权利要求1或2所述的一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：
利用重叠PCR将doeA的上下游同源臂与抗性基因相连得到doeA基因敲除复合体，通过电转化的方式将嗜甲烷菌基因组上的doeA用基因敲除复合体替换，得到嗜甲烷工程菌MAHE02。
5.根据权利要求1或2所述的一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：
利用重叠PCR将pykA的上下游同源臂与抗性基因相连得到pykA基因敲除复合体，通过电转化的方式将嗜甲烷菌基因组上的pykA用基因敲除复合体替换，得到嗜甲烷工程菌MAHE03。
6.根据权利要求1或2所述的一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：
将基因ask与质粒pAWP89线性化载体相连构建重组质粒P01(pAWP89::ask)，然后转入嗜甲烷菌中，得到嗜甲烷工程菌MAHE04。
7.根据权利要求1或2所述的一种产四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：
利用重叠PCR将doeD和doeA的上下游同源臂与抗性基因相连得到doeD和doeA基因敲除复合体，通过电转化的方式将嗜甲烷菌基因组上的doeD用基因敲除复合体替换，得到嗜甲烷工程菌MAHE05。
8.基于上述根据权利要求3-7构建方法得到的嗜甲烷工程菌MAHE01-05在产四氢嘧啶上的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将嗜甲烷工程菌经菌种活化、种子培养后，以体积分数5％-25％的接种量接种至氯化钠浓度为7.5-60g/L的液体NMS培养基中，于25-35℃、150rpm-300rpm的条件下培养60-96h，培养体系采用可封闭的气液两相体系，培养初始及过程中向培养体系内补充甲烷，甲烷的添加量为培养体系气相体积的4％-30％；
(2)取步骤(1)培养过程中的菌液，离心收获菌体，对菌体重悬后超声破碎并冷冻离心，将上清液过滤后获得四氢嘧啶。
9.根据基根据权利要求7所述的嗜甲烷工程菌MAHE01-05在产四氢嘧啶上的应用，其特征在于，
所述的菌种活化步骤为：用接种环取保存的嗜甲烷工程菌液，在固体NMS培养基中划线，置于25～35℃培养箱中培养3～5天；
所述种子培养步骤为：用接种环刮取一环活化菌体，接种到液体NMS培养基中，于25～35℃、150～300rpm的条件下培养至OD600为2～3.5；
所述的NMS2培养基，包括：MgSO4·7H2O0.2-1g，CaCl2·6H2O0.008-0.012g，KNO30.8-1.2g，NaCl8-12g，磷酸盐缓冲溶液20mL，碳酸盐缓冲溶液50mL和微量元素溶液2-4mL，其余用蒸馏水补足1L；
所述的磷酸盐缓冲溶液，pH6.8，按照1L计，KH2PO42.77-5.44g·L-1和Na2HPO45.4-10.73g·L-1，余量为水；
所述的碳酸盐缓冲溶液总浓度是1M，由140-700体积份的NaHCO3水溶液和60-300体积份的Na2CO3水溶液组成；
所述的微量元素溶液：Na2-EDTA·2H2O1-2g·L-1，FeSO4·7H2O1-2g·L-1，ZnSO4·7H2O0.5-0.8g·L-1，MnCl2·4H2O0.01-0.03g·L-1，H3BO30.01-0.03g·L-1，CoCl2·6H2O0.1-0.2g·L-1，CuCl2·2H2O0.4-0.6g·L-1，NiCl2·6H2O0.01-0.02g·L-1，Na2MO4·2H2O0.02-0.05g·L-1，余量为蒸馏水；
所述的嗜甲烷工程菌属优选甲基微菌Methylomicrobium，所述的甲基微菌是Methylotuvimicrobiumburyatense或Methylotuvimicrobiumalcaliphilum。
10.根据基根据权利要求9所述的嗜甲烷工程菌MAHE01-05在产四氢嘧啶上的应用，其特征在于，Methylotuvimicrobium buryatense具体为Methylotuvimicrobiumburyatense5GB1S；Methylotuvimicrobiumalcaliphilum具体为Methylotuvimicrobiumalcaliphilum20Z。
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