CN111620322B - 一种利用微生物发酵液还原氧化石墨烯的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用微生物发酵液还原氧化石墨烯的方法，属于材料合成领域；本发明中首先构建了异源表达[FeFe]氢化酶的基因工程大肠杆菌，通过处理获得无菌发酵液，并将其用于氧化石墨烯的还原，实现了在常温常压下氧化石墨烯的生物绿色还原。

Description

一种利用微生物发酵液还原氧化石墨烯的方法

技术领域

本发明属于材料合成领域，具体涉及一种利用微生物发酵液还原氧化石墨烯的方法。

背景技术

石墨烯内部的碳原子以sp ²杂化轨道构成了六角型蜂窝式结构，每个碳原子垂直于层平面的pz轨道可以形成贯穿全层的多原子的大π键（与苯环类似），具有优良的导电、光学和力学性能，在材料学、环境领域、生物医学和药物传递等方面具有重要的应用前景。

石墨烯主要的制备方法有：机械剥离法、取向附生法、化学气相沉积法、碳化硅外延法和氧化石墨烯（GO）还原法等。氧化石墨烯还原法的原理是将石墨氧化得到分散的氧化石墨烯溶液，再用还原剂制备还原氧化石墨烯，常用的还原剂有水合肼、二甲基肼、硼氢化钠和醇类、酚类等。尽管化学还原法制备的还原性氧化石墨烯表现出了优良的电化学性能、稳定和出色的理化性质，并且具有产率高和可大批量生产的优势，但其能耗高、反应条件苛刻、而且对环境有污染的问题。因此开发氧化石墨烯的绿色、环保、廉价的还原方法，有十分重要的意义。

目前，许多绿色合成还原性氧化石墨烯的方法被报道。例如研究者以环境友好的Vc作为还原剂合成还原性氧化石墨烯，但高成本限制了其发展应用；或者以天然环保材料的提取物（例如：绿茶提取物）作为还原剂合成还原性氧化石墨烯，但其劣势是原料来源有限及操作复杂；Yong等开发了一种生物还原氧化石墨烯的方法，其原理是利用微生物代谢产生的电子还原氧化石墨烯，反应条件温和、无毒环保，且相对于之前的绿色还原方法操作简单、成本低且来源广泛，但微生物与还原性氧化石墨烯之间紧密相连，产物分离困难。

发明内容

为了克服现有技术中氧化石墨烯还原方法的不足，本发明公开了一种利用微生物发酵液还原氧化石墨烯的方法，首先构建了异源表达 [FeFe]氢化酶（来自于Clostridium acetobutylicum NBRC 13948）的基因工程大肠杆菌，对得到的基因工程大肠杆菌进行处理，获得无菌发酵液，并将其用于氧化石墨烯的还原，实现了在常温常压下氧化石墨烯的生物绿色还原。

为了解决上述问题，本发明提供了一种利用微生物发酵液还原氧化石墨烯的方法，具体步骤如下：

（1）预先构建异源表达 [FeFe] 氢化酶的基因工程大肠杆菌E. coli BL21(DE3)；

（2）将上述基因工程大肠杆菌E. coli BL21(DE3)接种至发酵培养基中，然后向其中加入IPTG诱导表达氢化酶，得到的菌液在恒温震荡箱中厌氧发酵一段时间，得到发酵菌液；

（3）取适量步骤（2）发酵菌液厌氧离心取上清，该上清经0.22 μm水系过滤膜过滤除菌后，获得无菌厌氧发酵液；

（4）在厌氧条件下，取适量步骤（3）得到的发酵液，加入GO水溶液和氢气，恒温振荡培养，使GO转化为rGO。

进一步地，步骤（1）中所述 [FeFe] 氢化酶的基因簇包括HydA、HydE、HydF及HydG。

进一步地，步骤（1）中，所述大肠杆菌E. coli BL21(DE3)通过如下方法得到：将重组质粒pETDuet-1-HydAE和pCDFDuet-1-HydFG通过电转化法同时转入E. coli BL21(DE3)感受态，并均匀涂布于含40 μg/mL链霉素和100 μg/mL氨苄青霉素LB平板上，37 ℃培养后，挑取单克隆PCR验证并保存菌株。

进一步地，所述重组质粒pETDuet-1-HydAE为 [FeFe] 氢化酶的基因簇中HydA和HydE通过与载体pETDuet-1连接得到。

进一步地，所述重组质粒pCDFDuet-1-HydFG为 [FeFe] 氢化酶的基因簇中HydF和HydG通过与载体pCDFDuet-1连接得到。

进一步地，步骤（2）中，所述发酵培养基中包含LB培养基、pH缓冲剂、碳源补充剂、电子受体、链霉素和氨苄青霉素。

进一步地，所述pH缓冲剂为MOPS缓冲溶液、HEPEs缓冲溶液、Tris-HCl缓冲液和PBS缓冲溶液中的任一种，pH缓冲剂浓度为10~100 mmol/L；所述碳源补充剂为葡萄糖、乳酸钠、乙酸钠及甲酸钠中的任一种；所述电子受体为琥珀酸、丙酮酸和二氧化碳中的任一种；所述链霉素浓度为40 μg/mL；所述氨苄青霉素浓度为100 μg/mL。

进一步地， 步骤（2）诱导表达时菌液的OD₆₀₀为0.2~2；所述IPTG终浓度为0.01~1mmol/L;所述发酵时间为4-36 h。

进一步地， 步骤（4）中，所述体系中GO的终浓度为0.1~2 mg/mL, 氢气终浓度为0.1~50％。

进一步地，步骤（2）和步骤（4）中所述恒温振荡培养条件均为：温度4~60 ℃，摇床转速100~300 rpm，培养时间4~36 h。

本发明的有益效果：

传统rGO纳米材料主要采用化学还原法，此方法不仅能耗高、反应条件苛刻、还需要添加有毒化学试剂易对环境造成污染。rGO微生物发酵液还原法不仅反应条件温和、绿色环保，还避免了有毒有害化学试剂的使用，具有环境友好的优点，且较与其他绿色合成方法，具有成本低、操作简易、来源广泛且产物易于分离纯化等优势。

附图说明

图1为实施例1中所述重组质粒示意图，其中a为pETuet-1-HydAE，b为pCDFDuet-1-HydFG。

图2为实施例1中所述重组质粒双酶切验证的DNA琼脂糖凝胶电泳图，其中图a为pETDuet-1-HydAE，图b为pCDFDuet-1-HydFG。

图3为实施例3中不同菌液还原GO前的宏观图，其中a为野生菌株发酵液，b为本发明中所述生物发酵液。

图4为实施例3中不同菌液还原GO后的宏观图，其中a为野生菌株发酵液，b为本发明中所述生物发酵液。

图5为实施例4中制备的rGO的XPS表征图。其中a图为GO的XPS图，b图为rGO的XPS图，c图为a图中C1s分峰图，d图为b图中C1s分峰图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行具体描述，其目的在于更好的理解本发明的技术内涵，但是本发明的保护范围不限于以下的实施范围。

实施例1：异源表达 [FeFe] 氢化酶重组质粒的构建：

（1）制备氢化酶(HydA)及其相关成熟酶(HydE, HydF, HydG)：

首先，以Clostridium acetobutylicum NBRC 13948基因组（登录号为Accession:NC_003030.1）为模板，通过高保真PCR扩增得到氢化酶(HydA)及其相关成熟酶(HydE,HydF, HydG)。氢化酶(HydA)及其相关成熟酶(HydE, HydF, HydG)的核苷酸序列SEQ IDNO:1~4所示，引物序列、酶切位点、退火温度以及延长时间的具体条件如表1所示：

表1. PCR扩增引物序列及反应条件

（2）构建重组质粒pETDuet-1-HydAE：

对pETDuet-1质粒（来源于Novagen）与HydE基因片段同时进行Nde I和Kpn I位点双酶切，通过粘性末端连接得到连接产物pET-HydE，将连接产物pET-HydE转入E. coli JM109感受态（购自生工生物工程(上海)股份有限公司），并均匀涂布于100 μg/mL氨苄青霉素LB平板上，经37 ℃过夜培养后，挑取单克隆E. coli JM109-pET-HydE培养并提取重组质粒pETDuet-1-HydE；pETDuet-1-HydE质粒与HydA 基因片段同时进行Nco I和BamH I位点双酶切，通过粘性末端连接得到连接产物pET-HydAE，连接产物pET-HydAE转入E. coli JM109感受态，并均匀涂布于100 μg/mL氨苄青霉素LB平板上，经37 ℃过夜培养后，挑取单克隆E. coli JM109-pET-HydAE培养并提取重组质粒pETDuet-1-HydAE。

（3）构建重组质粒pCDFDuet-1-HydFG：

对pCDFDuet-1质粒（来源于Novagen）与HydG基因片段同时进行Nde I和Kpn I位点双酶切，通过粘性末端连接得到连接产物pCD-HydG，将连接产物pCD-HydG转入E. coli JM109感受态，并均匀涂布于100 μg/mL氨苄青霉素LB平板上，经37 ℃过夜培养后，挑取单克隆E. coli JM109-pCD-HydG培养并提取重组质粒pCDFDuet-1-HydG；然后对pCDFDuet-1-HydG质粒与HydF 基因片段同时进行Nco I和BamH I位点双酶切，通过粘性末端连接得到连接产物pCD-HydFG，连接产物pCD-HydFG转入E. coli JM109感受态，并均匀涂布于100 μg/mL氨苄青霉素LB平板上，经37 ℃过夜培养后，挑取单克隆E. coli JM109-pCD-HydFG培养并提取重组质粒pCDFDuet-1-HydFG。

重组质粒pETDuet-1-HydAE和pCDFDuet-1-HydFG质粒示意图如图1所示。从图中可以看出HydA和 HydE基因片段分别在Nco I、 BamH I位点和Nde I、Kpn I位点插入质粒pETDuet-1构建新的重组质粒pETDuet-1-HydAE。HydF和 HydG基因片段分别在Nco I、 BamHI位点和Nde I、Kpn I位点插入质粒pCDFDuet-1构建新的重组质粒pCDFDuet-1-HydFG。

（4）验证重组质粒：

提取pETDuet-1-HydAE和pCDFDuet-1-HydFG重组质粒，通过Nco I、BamH I或NdeI、Kpn I限制性内切酶的双酶切后，得到双酶切产物，与HydA、HydE、HydF、HydG目标基因片段进行琼脂糖凝胶电泳检测。图2为本实施例所述重组质粒双酶切验证的DNA琼脂糖凝胶电泳图，其中图a为pETDuet-1-HydAE，图b为pCDFDuet-1-HydFG。图a中条带M为marker的电泳结果，1为pETDuet-1-HydE Ndel、Kpn I双酶切，2为pETDuet-1 Nde I、Kpn I双酶切，3为HydE，4为pETDuet-1-HydAE Nco I、BamH I双酶切，5为pETDuet-1-HydE Nco I、BamH I双酶切，6为HydA。图b中条带M为marker的电泳结果，1为pCDFDuet-1-HydG Ndel、Kpn I双酶切，2为pCDFDuet-1 Nde I、Kpn I双酶切，3为HydG，4为pCDFDuet-1-HydFG Nco I、BamH I双酶切，5为pETDuet-1-HydG Nco I、BamH I双酶切，6为HydF。

从图中可以看出，对pETDuet-1-HydAE采用Nco I、BamH I双酶切后得到的基因大小为1749bp，与基因HydA的大小一致；采用Nde I、Kpn I双酶切后得到的基因大小为1053bp，与基因HydE的大小一致。对pCDFDuet-1-HydFG采用Nco I、BamH I双酶切后得到的基因大小为1235bp，与基因HydF的大小一致；采用Nde I、Kpn I双酶切后得到的基因大小为1419bp，与HydG的大小一致。因此，HydA、HydE基因片段已成功连接至pETDuet-1，HydF、HydG基因片段成功连接至pCDFDuet-1质粒，即pETDuet-1-HydAE和pCDFDuet-1-HydFG重组质粒成功构建。

实施例2：异源表达 [FeFe] 氢化酶的E. coli BL21(DE3)的构建及表达的确定

(1) 构建方法：

重组质粒pETDuet-1-HydAE和pCDFDuet-1-HydFG同时转入E. coli BL21(DE3)感受态（购自生工生物工程(上海)股份有限公司），并均匀涂布于含40 μg/mL链霉素和100 μg/mL氨苄青霉素LB平板上，经37 ℃过夜培养后，挑取单克隆E. coli BL21(DE3)- HydAEFG培养。

(2) 异源表达 [FeFe] 氢化酶：

重组菌株接种于10 mL LB培养基（含40 μg/mL链霉素和100 μg/mL氨苄青霉素）中，在转速200 rpm的37 ℃恒温摇床中过夜培养。将过夜培养的菌液按1 %（v/v）的比例接种于200 mL LB液体培养基（加入100 mM 3-吗啉丙磺酸(MOPS)溶液，pH 调至7.2；含40 μg/mL链霉素和100 μg/mL氨苄青霉素）中，将摇瓶放入转速为200 rpm的37 ℃恒温摇床中培养1-8 h，细菌OD₆₀₀达到0.2-2。菌液从摇瓶转移至500 mL 厌氧瓶中，并加入0.01-1 mmol/LIPTG、20 mM 葡萄糖、25 mM 富马酸。将无菌氮气通入厌氧瓶30 min以上作厌氧处理后，用丁基胶塞和铝盖封口。将密封厌氧瓶放入200 rpm的30 ℃恒温摇床中发酵培养4-36 h。

(3) [FeFe] 氢化酶酶活的检测方法：

[FeFe] 氢化酶酶活是在过量的还原性甲基紫精作为电子供体条件下，以氢气产生的速率来测定。具体的检测步骤为：在厌氧条件下，制备包含100 mM Tris-HCl (pH 7)、150 mM NaCl、5 mM 甲基紫精、25 mM连二亚硫酸钠的反应溶液，置于10 ml西林瓶中，用铝盖和丁基胶塞密封；顶空气体为氮气，细胞悬液通过注射器加入反应液中，37 ^oC条件下反应4 min，然后添加10 % (w/v)三氯乙酸终止反应。采用气相色谱法(GC-7900，天美公司)对顶空中氢气的含量进行了测定，所述气相色谱使用5A分子筛填充柱（3 mm*2 m），热导池检测器（TCD），载气为氮气，柱温为60 ^oC，进样口温度为120 ^oC。检测结果如表2所示，E. coli BL21(DE3)- HydAEFG具备催化产生氢气的活性，而没有表达氢化酶的野生E. Coli BL21(DE3)不具备催化产生氢气的能力，证明重组菌株E. coli BL21(DE3)- HydAEFG成功异源表达具备活性的[FeFe]氢化酶。

表2.氢化酶酶活检测结果

实施例3：异源表达氢化酶的微生物发酵液还原氧化石墨烯的方法

取实施例2已发酵的菌液厌氧离心取上清，在厌氧条件下经0.22μm水系过滤膜过滤除菌，获得无菌厌氧发酵液。在所述发酵液中加入终浓度为0.1-2 mg/mL的GO及终浓度为0.1-50％的氢气，进行恒温振荡培养，条件控制在温度4～50 ℃、摇床转速100～250 rpm、培养时间是4～36 h，GO被缓慢还原为rGO。反应前宏观照片如图3所示，a和b中均表现为GO的淡黄透明色。反应后宏观照片如图4所示：a中发酵液由淡黄色变为黄褐色且无沉淀产生；b中发酵液为E. coli BL21(DE3)- HydAEFG发酵液，液体由淡黄色变为黑色，并且从图中可以明显看到有黑色沉淀物产生。证明只有异源表达E. coli BL21(DE3)- HydAEFG发酵液可以还原GO变为黑色rGO，是由于E. coli BL21(DE3)- HydAEFG发酵液中存在[FeFe]氢化酶氧化氢气还原了GO。

实施例4：rGO材料的验证

XPS表征样品制备：取实施例3还原GO得到的rGO的溶液，10000 rpm离心10 min，弃上清，用纯水清洗3次，再用无水乙醇清洗3次，使用真空冷冻干燥机冻干后，得到rGO样品，将样品研磨成粉末进行X射线光电子能谱分析（XPS）表征。

结果如图5所示，碳元素不变的情况下，在XPS图中 rGO相较于GO的氧元素峰显著降低， C1s分峰图显示，相较于GO，rGO中大多数含氧官能团已被移除，证明GO已被还原。

所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏大学

<120> 一种利用微生物发酵液还原氧化石墨烯的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1749

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaaaacaa taatcttaaa tggcaatgaa gtgcatacag ataaagatat tactatcctt 60

gagctagcaa gagaaaataa tgtagatatc ccaacactct gctttttaaa ggattgtggc 120

aattttggaa aatgcggagt ctgtatggta gaggtagaag gcaagggctt tagagctgct 180

tgtgttgcca aagttgaaga tggaatggta ataaacacag aatccgatga agtaaaagaa 240

cgaatcaaaa aaagagtttc aatgcttctt gataagcatg aatttaaatg tggacaatgt 300

tctagaagag aaaattgtga attccttaaa cttgtaataa agacaaaagc aaaagcttca 360

aaaccatttt taccagaaga taaggatgct ctagttgata atagaagtaa ggctattgta 420

attgacagat caaaatgtgt actatgcggt agatgcgtag ctgcatgtaa acagcacaca 480

agcacttgct caattcaatt tattaaaaaa gatggacaaa gggctgttgg aactgttgat 540

gatgtttgtc ttgatgactc aacatgctta ttatgcggtc agtgtgtaat cgcttgtcct 600

gttgctgctt taaaagaaaa atcccatata gaaaaagttc aagaagctct taatgaccct 660

aaaaaacatg tcattgttgc aatggctcca tcagtaagaa ctgctatggg cgaattattc 720

aaaatgggat atggaaaaga tgtaacagga aaactatata ctgcacttag aatgttaggc 780

tttgataaag tatttgatat aaactttggt gcagatatga ctataatgga agaagctact 840

gaacttttag gcagagttaa aaataatggc ccattcccta tgtttacatc ttgctgtcct 900

gcatgggtaa gattagctca aaattatcat cctgaattat tagataatct ttcatcagca 960

aaatcaccac aacaaatatt tggtactgca tcaaaaactt actatccttc aatttcagga 1020

atagctccag aagatgttta tacagttact atcatgcctt gtaatgataa aaaatatgaa 1080

gcagatattc ctttcatgga aactaacagc ttaagagata ttgatgcatc cttaactaca 1140

agagagcttg caaaaatgat taaagatgca aaaattaaat ttgcagatct tgaagatggt 1200

gaagttgatc ctgctatggg tacttacagt ggtgctggag ctatctttgg tgcaaccggt 1260

ggcgttatgg aagctgcaat aagatcagct aaagactttg ctgaaaataa agaacttgaa 1320

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aagtcacatg ataatccagc tattattaaa atgtatgata gctactttgg aaaaccaggt 1680

gaaggacttg ctcacaaatt actacacgta aaatacacaa aagataaaaa tgtttcaaaa 1740

catgaataa 1749

<210> 2

<211> 1053

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggataata taataaagtt aattaataaa gcagaggtaa cacatgattt aacaaaggat 60

gaattagtaa ctttattgaa ggatgatact cataatgaag agatatataa agcagccgat 120

agagtacgtg aaaaatatgt tggagaagaa gtacatttaa gaggtcttat tgaattctct 180

aatatttgca aaagaaattg tatgtattgt ggtttaagac gtgataataa aaatataaaa 240

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tatcaaacag ttgtacttca atctggtgaa gatgactatt atactgttga aaaaatgaaa 360

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gaaacaacag ataaagaact gtatgaaaag ttagacccta aaatgagcca tgaaaatagg 540

ataaactgcc ttaaaaattt aagaaagctt ggatatgaag ttggttctgg atgtcttgta 600

ggtcttccaa atcaaactat agaatccttg gcagatgata tattattttt taaggaaata 660

gatgctgata tgataggggt aggacctttt atacctaacg aggatactcc tcttggagag 720

gaaaagggtg gagagttttt catgagtgta aaggtaactg cattgattag acttcttctg 780

ccagatataa atataccggc aactacggca atggaatccc tttatccaaa tggaagatca 840

atagctctta caagcggtgc aaatgttgtt atgcctaatg ttacagaagg tgagtataga 900

aagctctatg ccctttaccc aggaaaaata tgcgtaaacg acactcctgg gcactgcaga 960

caatgtatat cactaaaaat aaataagata aatagaaaag tgtctgctac aaagggcttt 1020

agaaaaaaaa gctacaaaga atctattggt taa 1053

<210> 3

<211> 1235

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgaatgaact taactcaaca cccaaaggtg aaagacttca cattgcactt tttggaaaaa 60

ctaatgttgg aaaatccagt gtaataaatg ctcttacttc tcaagaaata gctcttgttt 120

caaatgtaaa aggtacaaca actgatcctg tttacaaagc aatggaactg ctccctcttg 180

gaccagttat gcttatagat actgctggtc ttgatgacat aagtgattta ggtgagctta 240

gacgtggaaa aactctcgag gttttatcaa aaactgatgt agcaatttta gtttttgatg 300

ttgaaagtgg aataacagaa tatgataaaa atatttactc attactgctt gaaaagaaaa 360

ttccactaat aggagtttta aataaaatag ataaaaagga ctataagcta gaggattata 420

cttctcaatt taaaatacct atagtaccaa tttcagctct caataataaa ggcataaata 480

atttaaaaga tgaattaata cgcttagcac cagaaaatga tgataaattt aagattgttg 540

gtgatttact ttctcctggt gacatagcag ttttagttac tccaatagac aaagctgctc 600

caaagggaag attaatactt cctcagcagc aaactataag agatatactt gaaagtgacg 660

ctattgctat ggtgacaaag gaatttgaac ttagagaaac cttagacagc cttagaaaaa 720

aacctaaaat agtaataaca gattctcaag tatttttaaa ggtagcagca gacacaccta 780

aggacatatt gatgacctca ttttctatac ttatggcaag acataaagga gatttaatag 840

aacttgctcg tggtgcaagg gcaattgaag atttaaaaga tggtgataaa attttaatag 900

cagaagcctg cacccaccac cgtcaatctg atgatatagg taaagtaaaa ataccaagat 960

ggcttagaca aaaaactggt aaaaaactag aatttgattt ttcaagtggc ttttcatttc 1020

ctccaaatat agaggattat gcacttatag ttcattgtgc tggctgcatg ctaaacagac 1080

gttcaatgct tcacagaata gaaagttcag taaaaaaaca aattcctata gtaaattacg 1140

gagttcttat tgcctacgtt caaggaattc ttccaagggc attaaagcct tttccatatg 1200

ctgatagaat atttaatcaa tcgagtagga actaa 1235

<210> 4

<211> 1419

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgtataatg ttaaatctaa agttgcaact gaatttatca gtgatgagga aattattgat 60

tcccttgaat acgcaaaaca aaataaaagt aaccgcgaac ttatagacag cataattgaa 120

aaagcaaaag aatgtaaggg gttaacacac agagacgcag ctgtattact agagtgtgac 180

ttagaagatg aaaatgaaaa aatgttcaag cttgcaagag aaatcaaaca aaaattttac 240

ggtaatcgta tagtaatgtt tgctcctctt tatctttcaa actactgtgt aaacggatgt 300

gtatattgtc cataccatca taaaaacaaa catatagcaa gaaaaaagct gtcacaggaa 360

gatgttaaaa gagaaacaat agctcttcaa gatatgggac ataaacgttt ggctttagag 420

gctggagaag accctgtaaa caatcctatt gaatatattc ttgactgtat caaaaccata 480

tacagcataa aacataaaaa tggagcaatt agacgtgtaa atgtaaatat tgcagctact 540

actgtagaaa actacaagaa attaaaggat gctggtattg gaacatatat acttttccaa 600

gaaacctata acaaaaaaag ttacgaggaa cttcatccta caggtccaaa acatgattat 660

gcctatcata cagaagcaat ggatcgtgct atggaaggtg gtattgatga tgtaggtatt 720

ggggttttgt ttggactaaa tatgtacaaa tatgactttg ttggacttct aatgcatgct 780

gaacacttgg aagctgctat gggtgtaggc cctcatacta taagcgttcc tcgtatacgt 840

cctgcagatg acattgatcc tgaaaacttc tcaaatgcaa tatcggacga gatttttgaa 900

aaaattgtag ccattattcg tattgcagtt ccatacacag gcatgatcgt ctctactcgt 960

gagtctaaaa aaactcgtga gcgcgtactt gaactcggta tatctcaaat aagtggtggt 1020

tctagcacaa gtgttggtgg ttacgttgaa tctgaacctg aagaagataa ctcttcacaa 1080

ttcgaagtca atgataaccg tactcttgat gagatagtta attggctttt agaaatgaat 1140

tatattccaa gcttttgtac cgcttgttat cgtgaaggaa gaactggcga ccgtttcatg 1200

agccttgtta aatcaggaca aatagcaaat tgttgccagc caaacgcctt aatgactctt 1260

aaagagtact tggaggatta tgcttcttct aatactcaaa agaatggtga agcacttata 1320

gcttctgaag ttgaaaaaat acctaacgaa aaggttaaat caatagtaaa aaaacacctt 1380

accgaattaa aagagggaca aagagatttt agattctaa 1419

Claims (7)

1.一种利用微生物发酵液还原氧化石墨烯的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）预先构建异源表达 [FeFe] 氢化酶的基因工程大肠杆菌E. coli BL21(DE3)；

（2）将上述基因工程大肠杆菌E. coli BL21(DE3)接种至发酵培养基中，然后向其中加入IPTG诱导表达氢化酶，得到的菌液在恒温震荡箱中厌氧发酵一段时间，得到发酵菌液；诱导表达时菌液的OD600为0.2-2；所述IPTG终浓度为0.01-1 mmol/L；所述发酵时间为4-36h；所述恒温振荡培养条件均为：温度4~60 ℃，摇床转速100~300 rpm；

（3）取适量步骤（2）发酵菌液厌氧离心取上清，将上清过滤除菌后，获得无菌厌氧发酵液；

（4）在厌氧条件下，取适量步骤（3）得到的发酵液，加入GO水溶液和氢气，恒温振荡培养，使GO转化为rGO；所述恒温振荡培养条件均为：温度4~60 ℃，摇床转速100~300 rpm，培养时间4~36 h；所述体系中GO的终浓度为0.1-2 mg/mL，氢气终浓度为0.1-50％。

2. 根据权利要求1所述的利用微生物发酵液还原氧化石墨烯的方法，其特征在于，步骤（1）中所述 [FeFe]氢化酶的基因簇为HydA、HydE、HydF及HydG。

3. 根据权利要求1所述的利用微生物发酵液还原氧化石墨烯的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述大肠杆菌E. coli BL21(DE3)通过如下方法得到：将重组质粒pETDuet-1-HydAE和pCDFDuet-1-HydFG通过电转化法同时转入E. coli BL21(DE3)感受态，并均匀涂布于含40 μg/mL链霉素和100 μg/mL氨苄青霉素LB平板上，37 ℃培养后，挑取单克隆PCR验证并保存菌株。

4. 根据权利要求3所述的利用微生物发酵液还原氧化石墨烯的方法，其特征在于，所述重组质粒pETDuet-1-HydAE为[FeFe] 氢化酶的基因簇中HydA和HydE通过与载体pETDuet-1连接得到；所述重组质粒pCDFDuet-1-HydFG为[FeFe] 氢化酶的基因簇中HydF和HydG通过与载体pCDFDuet-1连接得到。

5.根据权利要求1所述的利用微生物发酵液还原氧化石墨烯的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述发酵培养基中包含LB培养基、pH缓冲剂、碳源补充剂、电子受体、链霉素和氨苄青霉素。

6.根据权利要求5所述的利用微生物发酵液还原氧化石墨烯的方法，其特征在于，所述pH缓冲剂为MOPS缓冲溶液、HEPEs缓冲溶液、Tris-HCl缓冲液和PBS缓冲溶液中的任一种；所述碳源补充剂为葡萄糖、乳酸钠、乙酸钠及甲酸钠中的任一种；电子受体为琥珀酸、丙酮酸和二氧化碳中的任一种。

7. 根据权利要求5所述的利用微生物发酵液还原氧化石墨烯的方法，其特征在于，所述pH缓冲剂的终浓度为10~100 mmol/L；所述碳源补充剂的终浓度为10~100 mmol/L；所述电子受体的终浓度为10~100 mmol/L；所述链霉素的终浓度为40 μg/mL；所述氨苄青霉素的终浓度为100 μg/mL。