CN102382790A - 一种高产过氧化氢酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用 - Google Patents
一种高产过氧化氢酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102382790A CN102382790A CN2011103287531A CN201110328753A CN102382790A CN 102382790 A CN102382790 A CN 102382790A CN 2011103287531 A CN2011103287531 A CN 2011103287531A CN 201110328753 A CN201110328753 A CN 201110328753A CN 102382790 A CN102382790 A CN 102382790A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cat
- bacillus subtilis
- pstop1622
- subtilis
- kata
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种高产过氧化氢酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用，属于遗传工程技术领域。本发明首次将CAT基因在野生型宿主菌中表达。出发菌株为野生型枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis WSHDZ-01)，由武汉中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M206062。将其CAT基因katA利用表达载体pSTOP1622在野生菌株中进行表达，大幅度提高了CAT的产量，是原始菌株的4倍。在3L搅拌式反应器中培养，CAT活性可以提高4.19倍，达到39117U/mL。本发明为CAT的过量表达提供了方法，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株可用于生产过氧化氢酶的枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用，尤其是一种过量表达过氧化氢酶而高产过氧化氢酶的枯草芽孢杆菌，属于遗传工程技术领域。
背景技术
过氧化氢酶(CAT)是一种酶类清除剂，它可促使H2O2分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。一个过氧化氢酶分子每秒钟可以分解数百万个过氧化氢分子。大多数过氧化氢酶由4个相同的亚单位组成，分子量在240kDa左右。所有的好氧生物在进行氧代谢时均会产生包括H2O2在内的氧自由基，在活性氧代谢过程中过氧化氢酶可催化分解细胞内产生的或由胞外进入细胞的H2O2，避免了H2O2通过Fenton和Harber-weiss反应产生·OH，从而保护机体；并对血红蛋白及其它的含巯基蛋白质起到保护作用，使它们不被氧化，对减轻活性氧损伤有一定意义，因此，过氧化氢酶是一种重要的生物抗氧化酶。过氧化氢酶在纺织、食品、医药、临床等行业都有着广泛的用途。
随着过氧化氢酶在纺织、造纸、制浆等行业的普遍应用，市场对过氧化氢酶的需求大幅增长。近年来嗜热子囊菌，粘质沙雷氏菌，苹果炭疽菌、芽孢杆菌等微生物菌种均有用于过氧化氢酶的生产研究。但利用野生菌株生产过氧化氢酶，资源消耗大、原料利用率低、产量较低，难以满足日益增长的市场需求；通过传统方法育种，工作量大、盲目性大、回复突变率高，难以筛选得到理想的突变菌株。有通过重组大肠杆菌生产过氧化氢酶，但由于内毒素、包涵体以及大分子蛋白分泌困难等限制因素，大肠杆菌并非表达CAT的理想宿主，产品后续处理复杂，很难在产业上应用。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis WSHDZ-01)是一株已用于过氧化氢酶(CAT)工业化生产的野生菌株。虽然该菌株易于培养，产生的CAT耐热耐碱性强，但CAT产量不稳定且酶活较低，无法满足市场对CAT的需求量。实验室从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilisWSHDZ-01)中扩增出过氧化氢酶基因katA并用pET20b在大肠杆菌中表达，CAT活性大幅提高，但该菌株需要在发酵培养基中添加甘氨酸促进其产物的分泌才能获得较高活性的过氧化氢酶。
发明内容
针对目前CAT发酵产量及应用中存在的问题，本发明提供一种高产过氧化氢酶的重组枯草芽孢杆菌，含有克隆有过氧化氢酶基因的质粒pSTOP1622-katA，所述过氧化氢酶基因克隆与pSTOP1622质粒木糖启动子下游。
所述枯草芽孢杆菌(B.subtilis WSHDZ-01)购买于CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M206062(该菌株是本课题组专利申请中保藏的菌株，ZL200610040898.0)。
所述过氧化氢酶基因含有编码自身信号肽和启动子的序列。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种构建所述重组枯草芽孢杆菌的方法，首先构建木糖诱导型表达质粒的构建pSTOP1622-katA；然后，将其转化枯草芽孢杆菌(B.subtilisWSHDZ-01)。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种利用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生产过氧化氢酶的方法，其发酵条件为：温度设为30～40℃，搅拌转速为300～500rpm，通气量为0.5～2.0vvm，发酵时间为36～72h；发酵培养基组成为(g/L)：葡萄糖10～20，NaNO3 5～10，MgSO4·7H2O 0.5，Na2HPO4 9.52，KH2PO4 0.6，FeSO4·7H2O 0.0025，麦芽汁2.0％～3.0％(w/w)，pH自然；木糖诱导浓度为0.1～1.0％(w/w)，其中优选发酵条件为：温度设为37℃，搅拌转速为400rpm，通气量为1.0vvm，发酵时间为48～56h，发酵培养基组成为(g/L)：葡萄糖20，NaNO3 10，MgSO4·7H2O 0.5，Na2HPO4 9.52，KH2PO4 0.6，FeSO4·7H2O 0.0025，麦芽汁2.0％(w/w)，pH自然；木糖诱导浓度为0.1％(w/w)。
运用基因工程手段改造野生菌株，使其自身片段自克隆，过量表达所需产品；加之双启动子表达体系以及芽孢杆菌作为野生酶类较适合的表达系统，获得的转化株的CAT产量显著提高，摇瓶中产量可达7532U/mL，是原始菌株枯草芽孢杆菌(B.subtilis WSHDZ-01)的4倍。在3L搅拌式反应器(STR)中培养，重组枯草芽孢杆菌(B.subtilis WSHDZ-01)CAT活性可以提高4.19倍，达到39117U/m，这是文献报道中产CAT芽孢杆菌的活性最高。
附图说明
图1木糖诱导型质粒pSTOP1622-katA物理图谱。
图2重组枯草芽孢杆菌250mL摇瓶中发酵结果。
图3重组枯草芽孢杆菌3L搅拌式反应器中发酵结果。
具体实施方式
实施例1、木糖诱导型表达质粒的构建及重组枯草芽孢杆菌的获得
1.枯草芽孢杆菌(B.subtilis WSHDZ-01)基因组的提取
根据细菌基因组提取试剂盒说明提取枯草芽孢杆菌(B.subtilis WSHDZ-01)的基因组，并通过琼脂糖电泳检测。琼脂糖浓度为质量百分比0.8％。
2.katA片断克隆的克隆
根据GenBank上公布枯草芽孢杆菌(Bacillus sp.TEl24)的基因组序列，设计引物
katA primer1：5′-GGACTAGTAAAAGCTGTTACAACAAGTT-3′
katA primer2：5′-TCCCCCCGGGGATGAGAAGCATACGCAATG-3′
以枯草芽孢杆菌(B.subtilis WSHDZ-01)的基因组为模板，利用PCR(聚合酶链式反应)体外扩增katA片段。
PCR反应体系如下：(引物浓度为20μmol/L)
10×缓冲液 5.0μL，
25mmol/L MgCl2 4.0μL；
10mmol/L四种dNTP混合液 1.0μL；
上下游引物各 1.0μL；
TaqDNA聚合酶 0.5μL；
基因组DNA 1.0μL，
加水补至 50μL；
PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸120s，30个循环后72℃延伸5min，4℃保存。电泳检测片段的大小。琼脂糖浓度为0.8％。
引物中下划线部分为相应的酶切位点，前引物中为SpeI酶切位点，后者为SmaI酶切位点。
3.木糖诱导型表达质粒的构建及重组菌的获得
(1)酶切反应
将环境诱导型片断与pSTOP1622利用SpeI和SmaI核酸内切酶进行双酶切消化。SpeI酶切反应温度为37℃，SmaI酶切反应温度为30℃。然后利用PCR产物回收试剂盒(购自TakaRa公司)回收纯化酶切的片段。
(2)连接反应
利用Ligation Mix连接液(购买于TakaRa公司)连接，反应组成体系为：
katA片断 4.0μL
pSTOP1622 1.0μL
Ligation Mix 5.0μL
连接反应在16℃下进行，反应时间为4h，反应体系为10μL。经连接后得到重组木糖诱导型表达质粒pSTOP1622-katA。
(3)感受态细胞的制备
挑枯草芽孢杆菌(B.subtilis WSHDZ-01)单菌落至2mL SPI培养基中，37℃，200rpm培养过夜。次日上午取100μL培养液转接至5mL SPI培养基中，37℃，200rpm培养至对数生长末期(约4～5h)，取0.2mL培养液至2mL SPII培养基中，37℃，200rpm培养90min，加入20μL 10mmol/LEGTA，再于37℃，200rpm培养10min。
(4)重组木糖诱导型表达质粒pSTOP1622-katA的验证扩增
将含有重组木糖诱导型表达质粒pSTOP1622的连接液加入500μL的枯草芽孢杆菌感受态细胞中，混匀；于37℃，100rpm培养90min，取菌液涂布筛选平板。将转化液涂布于含有质量百分比为2.0％的琼脂并加有终浓度为20μg/mL的四环素的固体LB培养基平板上，37℃条件下，静置培养16h，挑取单菌落筛选转化子。
将单菌落挑取转入LB液体培养基中，37℃，200rpm下培养过夜(培养基中添加四环素至终浓度为20μg/mL)。离心菌体，利用质粒提取试剂盒(购买于TakaRa公司)提取重组质粒pSTOP1622，并验证质粒的正确性。
重组质粒图谱见图1。
实施例2、重组菌CAT产量检测
活化培养基：6％(w/w)麦芽汁，pH 7.0～7.5
重组枯草芽孢杆菌的发酵条件为：温度设为30～40℃，摇床转速设为150～250rpm，发酵时间36h～72h；
发酵培养基组成为(g/L)：葡萄糖10～20，NaNO3 5～10，MgSO4·7H2O 0.5，Na2HPO49.52，KH2PO4 0.6，FeSO4·7H2O 0.0025，pH自然；
木糖诱导浓度为0.1～1.0％(w/w)。
挑取LB平板中筛选后的产CAT重组枯草芽孢杆菌，在无菌条件下用接种环接1～2环于20～50mL并加有终浓度为10～50μg/mL的四环素的活化培养基中(只含有质量百分比为6％的麦芽汁)，30～40℃条件下，150～250rpm摇床振荡培养8～16h，制得种子液；以1％～5％的接种量转接入装有20～50mL发酵培养基的250mL三角瓶中。发酵条件为30～40℃，150～250rpm。发酵36～72h，每间隔4h取样。
进一步的优选方式，发酵重组大肠杆菌的发酵条件为：温度设为37℃，摇床转速设为200rpm，发酵时间48h～56h。发酵培养基组成为(g/L)：葡萄糖10，NaNO3 5，MgSO4·7H2O 0.5，Na2HPO4 9.52，KH2PO4 0.6，FeSO4·7H2O 0.0025，pH自然；
木糖诱导浓度为0.5％(w/w)
挑取LB平板中筛选后的产CAT重组枯草芽孢杆菌，在无菌条件下用接种环接1～2环于25mL并加有终浓度为20μg/mL的四环素的活化培养基中，37℃条件下，200rpm摇床振荡培养16h，制得种子液；以5％的接种量转接入装有25mL发酵培养基的250mL三角瓶中。发酵条件为37℃，200rpm。发酵56h，每间隔4h取样，原菌株枯草芽孢杆菌(B.subtilisWSHDZ-01)作为对照。
CAT发酵检测
取1mL发酵液于5mL离心管中，10000rpm、4℃下离心10min，取上清液为胞外CAT测定样品，沉淀以50mol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH70)洗涤2次，以1mL缓冲液重悬后置冰浴预冷；超声波间歇破碎9min；10000rpm离心15min，上清液作为胞内CAT测定样品。
过氧化氢酶总酶活＝胞内酶活-胞外酶活，总酶活用紫外分光光度计在240nm下测定。检测结果见图2。katA基因在枯草芽孢杆菌(B.subtilis WSHDZ-01)中过量表达，获得的转化株的CAT产量显著提高，摇瓶中产量可达7532U/mL(图2)，是原始菌株枯草芽孢杆菌(B.subtilis WSHDZ-01）的4倍。
实施例3、3L搅拌式反应器中重细菌CAT产量检验
活化培养基：6％(w/w)麦芽汁，pH 7.0～7.5
重组枯草芽孢杆菌3L搅拌式反应器的发酵条件为：温度设为30～40℃，搅拌转速为300～500rpm，通气量为0.5～2.0vvm，发酵时间为36～72h；
发酵培养基组成为(g/L)：葡萄糖10～20，NaNO3 5～10，MgSO4·7H2O 0.5，Na2HPO49.52，KH2PO4 0.6，FeSO4·7H2O 0.0025，麦芽汁2.0％～3.0％(w/w)，pH自然；
木糖诱导浓度为0.1～1.0％(w/w)。
挑取LB平板中筛选后的产CAT重组枯草芽孢杆菌，在无菌条件下用接种环接1～2环于20～50mL并加有终浓度为10～50μg/mL的四环素的活化培养基中(只含有质量百分比为6％的麦芽汁)，30～40℃条件下，150～250rpm摇床振荡培养8～16h，制得种子液；以1％～5％的接种量转接入装有1.0～1.6L发酵培养基的3L搅拌式反应器中。发酵条件为：温度设为30～40℃，搅拌转速为300～500rpm，通气量为0.5～2.0vvm，发酵时间为36～72h，每间隔4h取样。
进一步的优选方式，发酵重组枯草芽孢杆菌的发酵条件为：温度设为37℃，搅拌转速为400rpm，通气量为1.0vvm，发酵时间为48～56h。发酵培养基组成为(g/L)：葡萄糖20，NaNO3 10，MgSO4·7H2O 0.5，Na2HPO4 9.52，KH2PO4 0.6，FeSO4·7H2O 0.0025，麦芽汁2.0％(w/w)，pH自然；
木糖诱导浓度为0.1％(w/w)。
挑取LB平板中筛选后的产CAT重组枯草芽孢杆菌，在无菌条件下用接种环接1～2环于25mL并加有终浓度为20μg/mL的四环素的活化培养基中，37℃条件下，200rpm摇床振荡培养16h，制得种子液；以5％的接种量转接入装有1.6L发酵培养基的3L搅拌式反应器中。发酵条件为：温度设为37℃，搅拌转速为400rpm，通气量为1.0vvm，发酵时间为56h，每间隔4h取样，原菌株枯草芽孢杆菌(B.subtilis WSHDZ-01)作为对照。
CAT发酵检测与实施例2中相同。检测结果见图3。
在3L搅拌式反应器(STR)中培养，重组枯草芽孢杆菌(B.subtilis WSHDZ-01)CAT活性可以提高4.19倍，达到39117U/mL(图3)，这是文献报道中产CAT芽孢杆菌的活性最高。研究结果表明，自我克隆原始菌株的完整表达框的是一个合理的过量表达策略，可明显改善野生型酶的产量。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (6)
1.一种高产过氧化氢酶的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于含有克隆有过氧化氢酶基因的质粒pSTOP1622-katA，所述过氧化氢酶基因克隆于pSTOP1622质粒木糖启动子下游。
2.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征是：所述过氧化氢酶基因含有编码自身信号肽和启动子的序列。
3.权利要求1所述重组菌株的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)构建木糖诱导型表达质粒的构建pSTOP1622-katA；
(2)将步骤1)获得的木糖诱导型表达质粒转化枯草芽孢杆菌。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征是：所述pSTOP1622-katA由katA片段插入到质粒pSTOP1622中的SpeI与SmaI限制性酶切位点之间构建而成。
5.权利要求2所述重组菌株应用于过氧化氢酶的生产，其特征在于所述重组枯草芽孢杆菌的发酵条件为：温度设为30～40℃，搅拌转速为300～500rpm，通气量为0.5～2.0vvm，发酵时间为36～72h；发酵培养基组成为(g/L)：葡萄糖10～20，NaNO3 5～10，MgSO4·7H2O 0.5，Na2HPO4 9.52，KH2PO4 0.6，FeSO4·7H2O 0.0025，麦芽汁2.0％～3.0％(w/w)，pH自然；木糖诱导浓度为0.1～1.0％(w/w)。
6.权利要求5所述的应用，其特征在于所述重组枯草芽孢杆菌的发酵条件为：温度设为37℃，搅拌转速为400rpm，通气量为1.0vvm，发酵时间为48～56h，发酵培养基组成为(g/L)：葡萄糖20，NaNO3 10，MgSO4·7H2O 0.5，Na2HPO4 9.52，KH2PO4 0.6，FeSO4·7H2O 0.0025，麦芽汁2.0％(w/w)，pH自然：木糖诱导浓度为0.1％(w/w)。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110328753.1A CN102382790B (zh) | 2011-10-26 | 2011-10-26 | 一种高产过氧化氢酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110328753.1A CN102382790B (zh) | 2011-10-26 | 2011-10-26 | 一种高产过氧化氢酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102382790A true CN102382790A (zh) | 2012-03-21 |
| CN102382790B CN102382790B (zh) | 2018-02-23 |
Family
ID=45822624
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110328753.1A Expired - Fee Related CN102382790B (zh) | 2011-10-26 | 2011-10-26 | 一种高产过氧化氢酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102382790B (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103451163A (zh) * | 2013-09-10 | 2013-12-18 | 江南大学 | 一种酶活及热稳定性提高的过氧化氢酶突变体 |
| CN105316262A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-02-10 | 福建省农业科学院土壤肥料研究所 | 一种嗜热芽胞杆菌菌株及其应用 |
| CN105802986A (zh) * | 2016-04-05 | 2016-07-27 | 北京工商大学 | 一种产靛蓝色素基因工程菌的构建方法与应用 |
| CN106047829A (zh) * | 2016-06-22 | 2016-10-26 | 江南大学 | 一种过氧化氢酶及其高产基因工程菌 |
| CN108473994A (zh) * | 2015-12-14 | 2018-08-31 | 巴斯夫欧洲公司 | 来自芽孢杆菌的经修饰的双向过氧化氢酶启动子 |
-
2011
- 2011-10-26 CN CN201110328753.1A patent/CN102382790B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| 《Biotechnol Lett》 20080131 Xunlong Shi et al. Overexpression,purification and characterization of a recombinant secretary catalase from Bacillus subtilis 第181页摘要 5-6 第30卷, 第1期 * |
| 《Biotechnol Lett》 20080131 Xunlong Shi et al. Overexpression,purification and characterization of a recombinant secretary catalase from Bacillus subtilis 第182页第1栏第2段,第182页第2栏第2段 1-4 第30卷, 第1期 * |
| XUNLONG SHI ET AL.: "Overexpression,purification and characterization of a recombinant secretary catalase from Bacillus subtilis", 《BIOTECHNOL LETT》 * |
| 史训龙: "重组表达过氧化氢酶及抗氧化损伤生物活性的研究", 《中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）自然科学与工程技术类专辑医药卫生科技辑》 * |
| 姚丹丹等: "活性氧胁迫促进枯草芽孢杆菌WSHDZ-01过量合成过氧化氢酶", 《生物工程学报》 * |
| 赵志军等: "碱性过氧化氢酶高产菌的筛选、鉴定及发酵条件优化", 《微生物学通报》 * |
| 邓宇: "Bacillus subtilis WSHDZ-01发酵生产过氧化氢酶条件优化", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库自然科学与工程技术类专辑工程科技Ⅰ辑》 * |
| 邓宇等: "氮源对枯草芽孢杆菌WSHDZ-01合成过氧化氢酶的影响", 《应用与环境生物学报》 * |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103451163A (zh) * | 2013-09-10 | 2013-12-18 | 江南大学 | 一种酶活及热稳定性提高的过氧化氢酶突变体 |
| CN103451163B (zh) * | 2013-09-10 | 2015-09-30 | 江南大学 | 一种酶活及热稳定性提高的过氧化氢酶突变体 |
| CN108473994A (zh) * | 2015-12-14 | 2018-08-31 | 巴斯夫欧洲公司 | 来自芽孢杆菌的经修饰的双向过氧化氢酶启动子 |
| CN108473994B (zh) * | 2015-12-14 | 2023-09-01 | 巴斯夫欧洲公司 | 来自芽孢杆菌的经修饰的双向过氧化氢酶启动子 |
| CN105316262A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-02-10 | 福建省农业科学院土壤肥料研究所 | 一种嗜热芽胞杆菌菌株及其应用 |
| CN105316262B (zh) * | 2015-12-30 | 2019-03-15 | 福建省农业科学院土壤肥料研究所 | 一种嗜热芽胞杆菌菌株及其应用 |
| CN105802986A (zh) * | 2016-04-05 | 2016-07-27 | 北京工商大学 | 一种产靛蓝色素基因工程菌的构建方法与应用 |
| CN106047829A (zh) * | 2016-06-22 | 2016-10-26 | 江南大学 | 一种过氧化氢酶及其高产基因工程菌 |
| CN106047829B (zh) * | 2016-06-22 | 2019-11-22 | 江南大学 | 一种过氧化氢酶及其高产基因工程菌 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102382790B (zh) | 2018-02-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ohnishi et al. | Development of a simple bio-hydrogen production system through dark fermentation by using unique microflora | |
| Mladenovska et al. | Anaerobic digestion of manure and mixture of manure with lipids: biogas reactor performance and microbial community analysis | |
| Yi et al. | Identification of novel butyrate-and acetate-oxidizing bacteria in butyrate-fed mesophilic anaerobic chemostats by DNA-based stable isotope probing | |
| CN108060114B (zh) | 一种发酵生产l-丙氨酸的大肠杆菌及其应用 | |
| CN110484471B (zh) | 一株高产细菌纤维素的耐酸菌株及其生产细菌纤维素的方法 | |
| CN102382790A (zh) | 一种高产过氧化氢酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用 | |
| Tarlera et al. | Caloramatorproteoclasticus sp. nov., a New Moderately Thermophilic Anaerobic Proteolytic Bacterium | |
| Ha et al. | Potential of the waste from beer fermentation broth for bio-ethanol production without any additional enzyme, microbial cells and carbohydrates | |
| Dominguez et al. | Lipolytic enzyme production by Thermus thermophilus HB27 in a stirred tank bioreactor | |
| Dutta et al. | Optimization of the medium for the production of extracellular amylase by the Pseudomonas stutzeri ISL B5 isolated from municipal solid waste | |
| TOUZEL et al. | Description of a new strain of Methanothrix soehngenii and rejection of Methanothrix concilii as a synonym of Methanothrix soehngenii | |
| CN101475914B (zh) | 一种循环利用重组酿酒酵母生产低聚半乳糖的方法 | |
| Rakaz et al. | Isolation, Extraction, Purification, and Molecular Characterization for Thermostable α‐Amylase from Locally Isolated Bacillus Species in Sudan | |
| CN104046586B (zh) | 一株基因工程菌及其在生产(2r,3r)-2,3-丁二醇中的应用 | |
| CN103451163B (zh) | 一种酶活及热稳定性提高的过氧化氢酶突变体 | |
| Sewell et al. | Isolation and characterization of xylan-degrading strains of Butyrivibrio fibrisolvens from a Napier grass-fed anaerobic digester | |
| CN107227284A (zh) | 一种发酵小分子透明质酸的重组兽疫链球菌 | |
| CN104726355B (zh) | 酿酒酵母孢子表达的(s)‑羰基还原酶ii不对称转化制备(s)‑苯乙二醇的方法 | |
| CN104789586B (zh) | 大肠杆菌基因组整合载体、基因工程菌以及在生产木糖醇中的应用 | |
| Fatoni | Thermophilic amylase from Thermus sp. isolation and its potential application for bioethanol production. | |
| Lü et al. | Characterization of the effective cellulose degrading strain CTL-6 | |
| Wang et al. | Biochemical kinetics of fermentative hydrogen production by Clostridium butyricum W5 | |
| CN104480127A (zh) | 超嗜热糖苷酶突变体及其在人参皂苷ck制备中的应用 | |
| CN107299074B (zh) | 甲酸脱氢酶工程菌株的构建方法及应用 | |
| CN104403969A (zh) | 一种可降解孔雀石绿的过氧化物酶及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20180223 Termination date: 20181026 |