CN106047829B - 一种过氧化氢酶及其高产基因工程菌 - Google Patents

一种过氧化氢酶及其高产基因工程菌 Download PDF

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Abstract

本发明是一种新型来源的过氧化氢酶及其重组工程菌的构建。本发明在于：首次根据短小芽孢杆菌的过氧化氢酶基因设计引物并构建了重组表达载体。将载体转化至基因工程菌大肠杆菌及枯草芽孢杆菌进行异源表达。利用发酵培养基对重组工程菌进行5L发酵罐发酵培养，其中重组大肠杆菌的过氧化氢酶主要在胞内表达，酶活为6645U/mL，重组B.subtilis 168的过氧化氢酶总酶活达到23263U/mL，胞外酶活为15368U/mL，而在B.subtilis WB600的过氧化氢酶总酶活高达26635U/mL，胞外酶活为20128U/mL，利用B.subtilis WB600为宿主更有利于胞外合成过氧化氢酶，具有重要的工业应用价值。这是目前报道的利用微生物生产过氧化氢酶的最高产量，为其工业化生产提供了一种实际有效策略。

Description

一种过氧化氢酶及其高产基因工程菌
技术领域
本发明属于基因工程及酶工程领域，具体涉及一种来源于短小芽孢杆菌的新型过氧化氢酶基因，将其连接到pET-28a或pMA5质粒上并分别在大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中的表达，利用重组大肠杆菌或重组枯草芽孢杆菌发酵高产过氧化氢酶的方法。
背景技术
自然界所有的依赖氧的生物体自身都会产生活性氧如O2-，H2O2及羟基自由基，而这一类活性氧如果过量的话会对细胞有毒害作用并且造成核酸、蛋白质及脂类物质的氧化。过氧化氢酶(Catalase，EC 1.11.1.6)作为去除活性氧自由基的核心酶广泛存在于很大一部分的依赖氧的生物体内，它可以催化H2O2生成氧气和水以维持生物体内的氧化还原平衡。过氧化氢酶被广泛用于生物传感器、环境及生物修复、食品处理、生物转化、纺织、造纸和医药等行业。过氧化氢酶可以分为三个家族，包括含血红素单功能过氧化氢酶、含血红素过氧化氢酶及过氧化物酶双功能酶及含锰过氧化氢酶。大部分依赖氧的生物体均含有一种或一种以上过氧化氢酶，不同物种间过氧化氢酶的差异性也较大。
目前商品化的过氧化氢酶主要是通过动物肝脏的提取及微生物发酵获得。利用动物肝脏提取的过氧化氢酶由于来源有限因此价格昂贵，且酶学性质较为单一，不适合用于纺织等工业生产中。利用微生物发酵生产过氧化氢酶因其生产周期短及提取简单已经成为趋势，近年来用于过氧化氢酶的生产研究菌株包括嗜热子囊菌、黑曲霉、粘质沙雷氏菌、苹果炭疽菌、芽孢杆菌等。然而利用野生菌株生产过氧化氢酶存在副产物较多、产量较低等缺陷，虽然可以通过育种技术对野生菌株进行筛选，但工作量较大且难以得到理想的突变菌株。因此利用基因工程技术用于过氧化氢酶的生产可以提供一种快速而高产的策略。近期报道，相比于枯草芽孢杆菌及地衣芽孢杆菌，短小芽孢杆菌具有更高的抗氧化能力，更适合用于抗氧化的酶的工业化生产(Stefan Handtke RS,Britta Jurgen,Karen Methling,Rabea Schluter,Dirk Albrecht,Johannes Bongaerts(2014).Bacillus pumilusreveals a remarkably high resistance to hydrogen peroxide provoked oxidativestress.PloS one 9(1):1-14doi:10.1371/journal.pone.0085625)。而本研究室在前期研究中筛选得到一株产过氧化氢酶的短小芽孢杆菌ML413，因此对其过氧化氢酶进行研究。
发明内容
本发明的主要研究内容：本发明在于根据来源于短小芽孢杆菌过氧化氢酶基因序列(KatX2，GenBank Accession No.CP011150.1)合成引物。通过PCR技术将该基因复制，并与pET-28a或pMA5质粒进行连接，构建表达载体pET-28a-KatX2及pMA5-KatX2，并分别将其转化到宿主菌大肠杆菌(E.coli)BL21和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)168和枯草芽孢杆菌(B.subtilis WB600)中，成功构建了基因工程菌pET-28a-KatX2/BL21、pMA5-KatX2/BS168和pMA5-KatX2/BS WB600。利用发酵培养基对该工程菌进行发酵生产过氧化氢酶，为过氧化氢酶的工业化生产提供了一种实际有效策略。
本发明的技术方案：
1.过氧化氢酶引物设计
根据NCBI上报道的来源于短小芽孢杆菌过氧化氢酶KatX2基因序列，设计过氧化氢酶基因分别在pET-28a及pMA5质粒上表达的引物P1、P2、P3和P4。
P1：5’-ACGCGTCGACAAATGACAAATTCAAATCAT-3’(Sal I)
P2：5’-CCGCTCGAGTTATTTCATGCTTCCTTG-3’(Xho I)
P3：5’-CGGGATCCATGACAAATTCAAATCATAAAAAT-3’(BamH I)
P4：5’-CGACGCGTTTATTCATGCTTCCTTG-3’(Mlu I)
2.重组工程菌的构建
以染色体DNA作为模板，根据预先设计好的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行PCR。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。采用相同的限制性内切酶对载体pET-28a或者pMA5和纯化的PCR产物进行双酶切，电泳检验酶切产物，并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收。将载体和PCR产物用T4DNA连接酶过夜连接，将连接产物转入E.coli BL21或B.subtilis 168的感受态细胞，挑取阳性克隆于加入卡那霉素的10mL的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后，将菌液加入甘油于-40℃冰箱保存。
3.重组工程菌的培养
将构建好的工程菌接种于LB培养基中进行活化，次日转接于发酵培养基中，其中重组大肠杆菌需要加入IPTG诱导表达，离心收集菌体。发酵培养基中具备微生物生长所需的营养成分，即碳源、氮源、无机盐、生长因子等。碳源包括葡萄糖、甘油、糖蜜、淀粉、淀粉水解物等；氮源主要有玉米浆、酵母膏、酵母粉、蛋白胨、酪蛋白水解物、其他含氮有机物尿素、氨基酸等以及含氮无机物氨水、硫酸铵和氯化铵等。以及磷酸盐(磷源)和硫酸盐(硫源)等。另外，培养基中还适量加入金属离子。
本发明的有益效果：
过氧化氢酶可以去除活性氧自由基，被广泛用于生物传感器、环境及生物修复、食品处理、生物转化、纺织、造纸和医药等行业。本发明首次对来源于具有高抗氧化能力的短小芽孢杆菌过氧化氢酶基因进行了PCR，并将其与pET-28a或pMA5质粒进行连接，并分别于两种宿主细胞E.coli BL21、B.subtilis 168、B.subtilis WB600中进行异源表达。利用发酵培养基对重组工程菌进行发酵培养，其中重组大肠杆菌的过氧化氢酶主要在胞内表达，酶活为6645U/mL，重组B.subtilis168的过氧化氢酶总酶活达到23263U/mL，胞外酶活为15368U/mL，而在B.subtilis WB600的过氧化氢酶总酶活高达26635U/mL，胞外酶活为20128U/mL，利用B.subtilis WB600为宿主更有利于胞外合成过氧化氢酶，具有重要的工业应用价值。
附图说明
无
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做详细的说明，以下实施例不对本发明产生限制。
实施例1：重组质粒pET-28a-KatX2的构建及转化
[1]以短小芽孢杆菌的基因组DNA作为模板。
[2]根据短小芽孢杆菌的过氧化氢酶基因序列(KatX2，GenBank AccessionNo.CP011150.1)以及pET-28a或pMA5质粒上的酶切位点设计KatX2基因引物。
P1：5’-ACGCGTCGACAAATGACAAATTCAAATCAT-3’(Sal I)
P2：5’-CCGCTCGAGTTATTTCATGCTTCCTTG-3’(Xho I)
[3]利用短小芽孢杆菌的DNA作为模板做PCR扩增得到基因。PCR扩增体系：模板2μL，上下游引物P1及P2各0.5μL，dNTP Mix 4μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，灭菌ddH2O 37μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL。PCR反应条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，58℃退火，1min，72℃延伸，1min 30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。
[4]构建重组质粒pMD18-T-KatX2，导入感受态E.coli JM109。PCR胶回收产物连接克隆载体pMD18-T，其中连接体系中连接缓冲液加酶5μL，基因4.8μL，pMD18-T 0.2μL，16℃过夜连接。连接产物转化E.coil JM109，转化方法参照实施例[2]，转化产物涂布含氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取菌落到10mL液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T-KatX2，经酶切验证连接成功后，将菌液加入甘油于-70℃冰箱保藏。
[5]将[4]中提取的质粒和表达载体pET-28a分别用Sal I和Xho I进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将连接好的重组质粒pET-28a-KatX2转化到感受态E.coli BL21，转化方法参照实施例[2]，用卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40℃冰箱保藏备用。
实施例2：大肠杆菌感受态的制备及质粒的转化
[1]大肠杆菌感受态的制备。将单克隆大肠杆菌于10ml LB培养基中活化，之后转接于37℃振荡培养至OD600 0.35即可制备感受态；将培养好的菌液置于冰水中，轻轻摇晃使菌液迅速冷却约10min；准备灭好菌的1.5ml离心管若干个，分装菌液于管中，每管装菌量1.2ml，将离心管放置于冰中；菌液离心8000r/min 10-20s，冰水中静置2min，弃上清，加入预冷好的0.1M CaCl2 400μL，轻轻吹吸悬浮液，放入冰中15min(该步骤重复2-3次)；最后，每管菌液离心弃上清后加入预冷好的0.1M CaCl2 80μL，轻轻吹吸悬浮菌液放入冰中。
[2]质粒的转化。取[1]制备好的感受态细胞，加入需要转化的质粒，轻轻反复吹吸，并在冰中放置45min；将离心管放入42℃水浴锅准确放置90s，然后取出迅速放入冰中5min；加入LB培养基800μL，轻轻混合，37℃摇床培养1-1.5h；菌体离心2min，弃大部分上清，再重新吹吸悬浮，取200μL于目标抗性平板，置于37℃培养箱中培养；待转化子长出之后提质粒验证。
实施例3：重组质粒pET-28a-KatX2的构建及转化
[1]以短小芽孢杆菌的基因组DNA作为模板。
[2]根据短小芽孢杆菌的过氧化氢酶基因序列(KatX2，GenBank AccessionNo.CP011150.1)以及pMA5质粒上的酶切位点设计KatX2基因引物。
P3：5’-CGGGATCCATGACAAATTCAAATCATAAAAAT-3’(BamH I)
P4：5’-CGACGCGTTTATTCATGCTTCCTTG-3’(Mlu I)
[3]利用短小芽孢杆菌的DNA作为模板做PCR扩增得到基因。PCR扩增体系：模板2μL，上下游引物P3及P4各0.5μL，dNTP Mix 4μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，灭菌ddH2O 37μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL。PCR反应条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，58℃退火，1min，72℃延伸，1min 30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。
[4]将[3]中PCR胶回收产物和表达载体pMA5分别用BamH I和Mlu I进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将连接好的重组质粒pMA5-KatX2转化到感受态E.coliJM109，转化方法参照实施例[2]，用氨苄霉素抗性平板筛选阳性克隆。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40℃冰箱保藏备用。
[5]将[4]中重组质粒pMA5-KatX2转化到感受态B.subtilis168和B.subtilisWB600，转化方法参照实施例[4]，用卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40℃冰箱保藏备用。
实施例4：枯草芽孢杆菌感受态的制备及质粒的转化
[1]溶液的配制。包括：
SPI-A溶液：0.4％(NH4)SO4，2.8％K2HPO4，1.2％KH2PO4，0.2％二水合柠檬酸钠，121℃灭菌20min；
SPI-B溶液：0.04％MgSO4，121℃灭菌20min；
100*CAYE母液：2％酪蛋白水解物，10％酵母提取物，121℃灭菌20min；
100*EGTA母液：10mM EGTA，用氢氧化钠调pH至8.0；
SPI培养基：9.8mL SPI-A溶液，9.8mL SPI-B溶液，0.1g葡萄糖，0.2mL 100*CAYE母液，121℃灭菌20min；
SPII培养基：5.88mL SPI培养基，60uL的50mM氯化钙溶液，60uL的250mM氯化镁溶液，121℃灭菌20min。
[2]枯草芽孢杆菌感受态的制备。将单克隆枯草芽孢杆菌于10ml LB培养基中过夜活化，之后取100uL种子液转接于5mL的SPI培养基中，37℃，200r/min振荡培养至对数末期。将培养好的菌液快速取200uL转接于2mL的SPII培养基中，37℃，100r/min振荡培养1.5小时。之后在SPII培养基中加入20uL的100*EGTA母液，37℃，100r/min振荡培养10分钟，然后分装于1.5mL离心管中即得枯草芽孢杆菌感受态细胞。
[3]质粒的转化。取[2]制备好的感受态细胞，加入需要转化的质粒1-5uL，轻轻反复吹吸，37℃，100r/min振荡培养30分钟后，调整摇床转速至250r/min继续培养1-2小时。菌体离心2min，弃大部分上清，再重新吹吸悬浮，取200μL于目标抗性平板，置于37℃培养箱中培养；待转化子长出之后提质粒验证。
实施例5：重组菌的发酵培养基
[1]LB基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10。
[2]发酵培养基(g/L)：蔗糖5-25，胰蛋白胨5-15，玉米浆3-15，K2HPO4 1-8，KH2PO42-6，MgSO4 0.3-1，pH 7.0-7.2。
实施例6：重组大肠杆菌发酵生产过氧化氢酶
[1]将重组菌pET-28a-KatX2/BL21利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后转接于2L LB基中。接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养2-3h后加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导温度降低为28℃，诱导16h后，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用pH 7.0的50mM PB缓冲液将pET-28a-KatX2/BL21重组大肠杆菌洗涤二次，重悬于培养时同等体积的pH 7.0的50mM PB缓冲液中，利用60MPa弗氏细胞压碎器对细胞悬浮液进行细胞破碎。得到重组大肠杆菌生产的过氧化氢酶酶活为6645U/mL。因过氧化氢酶主要属于胞外酶，重组大肠杆菌的胞外过氧化氢酶酶活可忽略不计，而对重组菌进行细胞破碎会大大增加成本，因此未进一步对重组大肠杆菌生产过氧化氢酶的培养条件进行优化。
过氧化氢酶酶活测定方法：取3mL的总反应体积，反应温度为37℃,其中包括2.9mL的含120mM H2O2的50mM PB缓冲液及0.1mL的粗酶液。H2O2的分解速率可以在240nm的紫外光下测定。一个标准酶活单位定义为：在37℃下，1min内分解1umol H2O2所需要的酶量(其中H2O2的消光系数为39.4L/mol/cm)。
实施例9：重组枯草芽孢杆菌发酵生产过氧化氢酶
将重组菌pMA5-KatX2/B.subtilis168利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后转接于2L发酵培养基中，其中培养基包括(g/L)：蔗糖5，胰蛋白胨15，玉米浆3，K2HPO41，KH2PO4 6，MgSO4 0.3，pH 7.0。接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养48h后，4℃，8000r/min离心10min收集发酵液及菌体，其中菌体用pH 7.0的50mM PB缓冲液洗涤二次，然后重悬于培养时同等体积的pH 7.0的50mM PB缓冲液中，利用60MPa弗氏细胞压碎器对细胞悬浮液进行细胞破碎。
实施例10：重组枯草芽孢杆菌发酵生产过氧化氢酶
将重组枯草芽孢杆菌利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后转接于2L发酵培养基中，其中培养基包括(g/L)：蔗糖25，胰蛋白胨5，玉米浆15，K2HPO4 8，KH2PO4 2，MgSO4 1，pH 7.2。接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养48h后，4℃，8000r/min离心10min收集发酵液及菌体，其中菌体用pH 7.0的50mM PB缓冲液洗涤二次，然后重悬于培养时同等体积的pH 7.0的50mM PB缓冲液中，利用60MPa弗氏细胞压碎器对细胞悬浮液进行细胞破碎。得到重组枯草芽孢杆菌168生产的胞内过氧化氢酶酶活为7895U/mL，胞外过氧化氢酶酶活为15368U/mL，重组枯草芽孢杆菌生产的过氧化氢酶总酶活为23263U/mL。而在B.subtilis WB600的过氧化氢酶总酶活高达26635U/mL，胞外酶活为20128U/mL，利用B.subtilis WB600为宿主更有利于胞外合成过氧化氢酶。

Claims (1)

1.一种高产过氧化氢酶的基因工程菌，其特征在于：将来源于短小芽孢杆菌过氧化氢酶基因KatX2分别与表达载体pET-28a和pMA5-HpaII连接，构建重组表达载体pET-28a-KatX2及pMA5-KatX2，并将重组表达载体分别转化至枯草芽胞杆菌WB600中，构建枯草芽胞杆菌基因工程菌，并将其用于生产过氧化氢酶，所述的过氧化氢酶基因序列如SEQ No.1所示；
将所述的枯草芽胞杆菌基因工程菌发酵生产过氧化氢酶，其步骤为：
将枯草芽胞杆菌基因工程菌利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后转接于2L发酵培养基中，接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm，培养48h后，4℃，8000r/min离心10min收集发酵液及菌体，其中菌体用pH 7.0的50mM PB缓冲液洗涤二次，然后重悬于培养时同等体积的pH 7.0的50mM PB缓冲液中，利用60MPa弗氏细胞压碎器对细胞悬浮液进行细胞破碎；
所述的培养基包括(g/L)：蔗糖25，胰蛋白胨5，玉米浆15，K2HPO4 8，KH2PO4 2，MgSO4 1，pH 7.2。
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