CN110872565A - 培养蜂毒肽重组质粒的枯草芽孢杆菌感受态细胞的培养基 - Google Patents

培养蜂毒肽重组质粒的枯草芽孢杆菌感受态细胞的培养基 Download PDF

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戴茜茜
罗文华
曹兰
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Abstract

本发明属于细菌培养基技术领域，具体涉及一种培养蜂毒肽重组质粒的枯草芽孢杆菌感受态细胞的培养基。所述培养蜂毒肽重组质粒的枯草芽孢杆菌感受态细胞的培养基，包括A和B，A由以下成分组成：硫酸铵0.2%，七水硫酸镁0.018%，酵母膏0.2%，葡萄糖0.5%，磷酸氢二钾1.4%，磷酸二氢钾0.6%，硫酸铵0.2%，柠檬酸三钠0.1%，溶剂为水，以质量百分比计，且A与B的体积比为1:10。该培养基显著提高了转染数量和效率，重复稳定性好。

Description

培养蜂毒肽重组质粒的枯草芽孢杆菌感受态细胞的培养基
技术领域
本发明属于细菌培养基领域，具体涉及一种培养蜂毒肽重组质粒的枯草芽孢杆菌感受态细胞的培养基。
背景技术
随着国民经济的快速发展和生活水平的日益提高，人们对养殖环境及安全、健康的动物产品提出了更高、更新的要求。然而，近年来，频频曝光的动物食品安全事件，如“瘦肉精事件”、“三聚氰胺奶事件”等等，无一不对动物养殖业造成了沉重的打击，从而引发了严重的信任危机。中国作为世界第一动物养殖大国，动物产品出口在国民经济中举足轻重，但近年来欧洲、日本等一些国家以食品安全问题为壁垒，拒绝中国动物产品的部分进入，给我国经济造成了严重损失。“动物产品安全”问题，已成为制约中国养殖业科学健康和可持续发展的瓶颈。
动物微生态制剂是根据动物微生态学理论，利用动物体内正常的微生物成员及其代谢产物或生长促进物，经特殊的加工工艺制成的制剂。具有补充、调整或维持动物肠道内微生物平衡，达到防病、治病、促进健康和提高生产性能的目的(“动物微生物制剂的研究进展”，藤颖等，中国兽药杂志，2005年第39卷第11期，第43-46页，公开日2005年12月31日)。
目前，应用最广泛的微生态制剂为枯草芽孢杆菌制剂。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一类好氧型革兰氏阳性菌，为Generally Recognized As Safe(GRAS)菌种之一，对人和动物均无致病性，可作为益生菌用于食品和药品领域。在营养缺乏或其他胁迫条件下，枯草芽孢杆菌能形成具有抗逆性的休眠体-芽孢。芽孢的形成是一系列芽孢衣壳蛋白基因，包括CotA、CotB、CotC、CotF、CotG等70余种蛋白基因按一定的时序调控表达而成，且大多数衣壳蛋白基因的缺失并不会引起枯草杆菌芽孢性状方面的明显变化。芽孢由皮层、芽孢衣壳和芽孢外壁构成，这三层结构的功能及特征使得枯草杆菌芽孢成为生命世界中抗逆性最强的一种结构，能够抵御恶劣的环境条件，如抗热、抗辐射及抗化学药物等方面，从而在自然环境条件下芽孢可存活几年甚至上千万年。
随着研究的不断深入，研究人员发现，枯草杆菌芽孢可作为外源片段表达系统展示外源蛋白。随后人们研究和关注的热点逐渐趋向于以外层芽孢衣壳蛋白为分子载体，通过芽孢表面展示技术在枯草杆菌芽孢表面展示外源片段，成功展示外源片段的重组芽孢，成功展示外源片段的重组芽孢不仅具有芽孢本身独特的抗逆性，而且还携带外源蛋白特有的生物活性。
sticato等于2001年首次利用CotB作为载体蛋白，通过芽孢表面展示技术成功地将破伤风毒素(TTFC)C末端的459个氨基酸片段在枯草杆菌芽孢表面展示。另一芽孢外层衣壳蛋白基因CotC被作为融合载体，将TTFC和大肠杆菌的不耐热肠毒素B亚单位(LTB)分别展示于枯草杆菌芽孢表面。
蜂毒是工蜂毒腺分泌出来的一种具有芳香气味的成分复杂的混合物，主要含有蛋白质多肽类、酶类、生物胺类和其他物质。蜂毒溶血肽又名蜂毒肽(melittin)，占蜂毒干重的50％，是蜂毒中主要功能物质。蜂毒肽具有抗菌、抗病毒、消炎、抗辐射等功效。近年来，人们发现，蜂毒肽还具有抗癌方面作用。然而，但是其临床应用却受到很多方面局限，主要原因是现有技术难以将蜂毒中有致敏反应并与蜂毒肽分子量接近的磷脂酶A2完全去除。基因工程的出现为人们解决这一问题找到了一条有效途径。通过基因工程获得蜂毒肽的方法已经取得一定进展，但仍有许多不足之处，距离大规模生产还有很长的一段路。
但是，在蜂毒肽重组质粒的培养、转染中存在以下问题，现有的枯草芽孢杆菌培养基的配方如下：
表1现有枯草杆菌培养基
Figure BDA0001784491240000031
其中，T Base为T培养基，Spc为Spc培养基，SpII为SpII肉汤培养基，Bacto为试剂的英文品牌名称，EGTA为乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，w/v为质量体积浓度，质量单位为g，体积单位为mL。
然而，采用该培养基培养蜂毒肽重组质粒的枯草芽孢杆菌感受态细胞的转染率低。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种培养枯草芽孢杆菌感受态细胞培养的培养基，该培养基的转染率高，显著提高了转染数量和效率。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
培养枯草芽孢杆菌感受态细胞的培养基，包括A和B，A由以下成分组成：硫酸铵0.2％，七水硫酸镁0.018％，酵母膏0.2％，葡萄糖0.5％，磷酸氢二钾1.4％，磷酸二氢钾0.6％，硫酸铵0.2％，柠檬酸三钠0.1％，溶剂为水，以质量百分比计，且A与B的体积比为1:10。
发明人意外发现，包括A和B，A由以下成分组成：硫酸铵0.2％，七水硫酸镁0.018％，酵母膏0.2％，葡萄糖0.5％，磷酸氢二钾1.4％，磷酸二氢钾0.6％，硫酸铵0.2％，柠檬酸三钠0.1％，溶剂为水，以质量百分比计，且A与B的体积比为1:10的培养基的配方科学合理，为高效制备枯草感受态细胞创造了适宜的生长环境，转染数量和效率。
此外，发明人还发现，采用表1所示培养基培养蜂毒肽重组质粒的枯草芽孢杆菌感受态细胞的重复稳定性差。
进一步，B由以下成分组成：硫酸铵0.2％，七水硫酸镁0.084％，酵母膏0.1％，葡萄糖0.5％，磷酸氢二钾1.4％，磷酸二氢钾0.6％，硫酸铵0.2％，柠檬酸三钠0.1％，氯化钙0.1mol/L，溶剂为水，以质量百分比计。
包括A和B，A由以下成分组成：硫酸铵0.2％，七水硫酸镁0.018％，酵母膏0.2％，葡萄糖0.5％，磷酸氢二钾1.4％，磷酸二氢钾0.6％，硫酸铵0.2％，柠檬酸三钠0.1％，溶剂为水，以质量百分比计，且A与B的体积比为1:10；B由以下成分组成：硫酸铵0.2％，七水硫酸镁0.084％，酵母膏0.1％，葡萄糖0.5％，磷酸氢二钾1.4％，磷酸二氢钾0.6％，硫酸铵0.2％，柠檬酸三钠0.1％，氯化钙0.1mol/L，溶剂为水，以质量百分比计；的培养基用于培养蜂毒肽重组质粒的枯草芽孢杆菌感受态细胞，重复稳定性好。
本发明的目的还在于保护所述培养基的培养方法，包括以下步骤：
将枯草芽孢杆菌活化后，挑单菌落接种于A中，恒温水浴振荡培养，取菌液接种于B中，在恒温水浴振荡器中继续培养，离心收集菌体沉淀；取上清液重悬菌体沉淀，此时枯草芽孢杆菌处于感受状态。
进一步，所述恒温水浴振荡培养的温度为37℃，培养时间为2h。
进一步，所述恒温水浴振荡的转速为180转/min。
进一步，所述离心转速为8000×g。
进一步，所述继续培养的温度为37℃，时间为90min。
本发明的有益效果在于：
本发明的培养基配方科学合理，为高效制备枯草感受态细胞创造了适宜的生长环境，培养后长出的重组枯草芽孢杆菌个数增加，转染效率得到了显著提高。
将本发明的培养基用于培养蜂毒肽重组质粒的枯草芽孢杆菌感受态细胞，重复稳定性好。
附图说明
图1为蜂毒肽重组转化子结构示意图；
图2为实施例2的重组转化子的培养效果图；
图3为实施例3的重组转化子的培养效果图；
图4为实施例4的重组转化子的培养效果图；
图5为对比例1的培养效果图；
图6为对比例2的培养效果图；
图7为对比例3的培养效果图。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
一种枯草芽孢杆菌感受态状态培养基，包括A和B，A由以下成分组成：硫酸铵0.2％，七水硫酸镁0.018％，酵母膏0.2％，葡萄糖0.5％，磷酸氢二钾1.4％，磷酸二氢钾0.6％，硫酸铵0.2％，柠檬酸三钠0.1％，溶剂为水，以质量百分比计；
B由以下成分组成：硫酸铵0.2％，七水硫酸镁0.084％，酵母膏0.1％，葡萄糖0.5％，磷酸氢二钾1.4％，磷酸二氢钾0.6％，硫酸铵0.2％，柠檬酸三钠0.1％，氯化钙0.1mol/L，溶剂为水，以质量百分比计。
实施例2
感受态细胞培养：首先将保存的枯草芽孢杆菌168菌株划线于LB固体培养基，37℃培养12h；挑单菌落接种于20mL新配置的A中，恒温水浴振荡培养(37℃，180r/min)2h；然后取2mL菌液接种于200mLB中，在恒温水浴振荡器中继续培养(37℃，180r/min)90min，8000×g离心力下离心5min，收集菌体沉淀；取18mL上清液重悬菌体沉淀，此时枯草芽孢杆菌已呈感受态状态，将其按照体积比1:1与C混合后可直接用于转化，然后按照每份100μL进行分装，-20℃保存；
所述C由以下成分组成：硫酸铵0.2％，七水硫酸镁0.084％，酵母膏0.1％，葡萄糖0.5％，磷酸氢二钾1.4％，磷酸二氢钾0.6％，硫酸铵0.2％，柠檬酸三钠0.1％，0.1mol/LEGTA，溶剂为水，以质量百分比计。
转化实验过程：在可用于转化的实施例2制成的感受态枯草芽孢杆菌168中加入5μL线性化的质粒，轻轻混匀，接种加入1ml LB液体培养基，于37℃恒温培养2.5h，取100ul均匀涂布于氯霉素抗性平板，37℃恒温培养30h即可在平板上获取重组转化子，重组转化子的结构如图1所示，培养效果如图2所示。
实施例3
感受态细胞培养：首先将保存的枯草芽孢杆菌168菌株划线于LB固体培养基，37℃培养12h；挑单菌落接种于20mL新配置的A中，恒温水浴振荡培养(37℃，180r/min)2h；然后取2mL菌液接种于200mLB中，在恒温水浴振荡器中继续培养(37℃，180r/min)90min，8000×g离心力下离心5min，收集菌体沉淀；取18mL上清液重悬菌体沉淀，此时枯草芽孢杆菌已呈感受态状态，将其按照体积比1:1与C混合后可直接用于转化，然后按照每份100μL进行分装，-20℃保存；
所述C由以下成分组成：硫酸铵0.2％，七水硫酸镁0.084％，酵母膏0.1％，葡萄糖0.5％，磷酸氢二钾1.4％，磷酸二氢钾0.6％，硫酸铵0.2％，柠檬酸三钠0.1％，0.1mol/LEGTA，溶剂为水，以质量百分比计。
转化实验过程：在可用于转化的实施例3制成的感受态枯草芽孢杆菌168中加入5μL线性化的质粒，轻轻混匀，接种加入1ml LB液体培养基，于37℃恒温培养2.5h，取100ul均匀涂布于氯霉素抗性平板，37℃恒温培养30h即可在平板上获取重组转化子，重组转化子的结构如图1所示，培养效果如图3所示。
实施例4
感受态细胞培养：首先将保存的枯草芽孢杆菌168菌株划线于LB固体培养基，37℃培养12h；挑单菌落接种于20mL新配置的A中，恒温水浴振荡培养(37℃，180r/min)2h；然后取2mL菌液接种于200mLB中，在恒温水浴振荡器中继续培养(37℃，180r/min)90min，8000×g离心力下离心5min，收集菌体沉淀；取18mL上清液重悬菌体沉淀，此时枯草芽孢杆菌已呈感受态状态，将其按照体积比1:1与C混合后可直接用于转化，然后按照每份100μL进行分装，-20℃保存；
所述C由以下成分组成：硫酸铵0.2％，七水硫酸镁0.084％，酵母膏0.1％，葡萄糖0.5％，磷酸氢二钾1.4％，磷酸二氢钾0.6％，硫酸铵0.2％，柠檬酸三钠0.1％，0.1mol/LEGTA，溶剂为水，以质量百分比计。
转化实验过程：在可用于转化的实施例3制成的感受态枯草芽孢杆菌168中加入5μL线性化的质粒，轻轻混匀，接种加入1ml LB液体培养基，于37℃恒温培养2.5h，取100ul均匀涂布于氯霉素抗性平板，37℃恒温培养30h即可在平板上获取重组转化子，重组转化子的结构如图1所示，培养效果如图4所示。
对比例1
将低温保存于甘油中的枯草芽孢杆菌168划线接种于LB固体培养基，37℃培养12h；挑单菌落接种于新鲜、37℃预热的20mL Spc肉汤培养基中(配方如表1中Spc培养基所示)，调整菌体浓度，使菌体OD600值约为0.5；恒温水浴振荡培养(37℃，180r/min)，每间隔30min测定一次OD值，取对数生长期的菌液2mL接种于200mL37℃预热的SpII肉汤培养基中，在恒温水浴振荡器中继续培养(37℃，180r/min)90min，8000g离心5min收集菌体沉淀；取18mL上清液轻轻重悬菌体沉淀，此时的枯草芽孢杆菌已呈感受态状态可直接用于转化，1然后按照每份100μL进行分装，-20℃保存。
转化实验过程：在可用于转化的感受态枯草芽孢杆菌168中加入5μL线性化的质粒，轻轻混匀，接种加入1ml LB液体培养基，于37℃恒温培养2h，取100ul均匀涂布于氯霉素抗性平板，37℃恒温培养24-36h，培养效果如图5所示。
对比例2
将低温保存于甘油中的枯草芽孢杆菌168划线接种于LB固体培养基，37℃培养12h；挑单菌落接种于新鲜、37℃预热的20mL Spc肉汤培养基中(配方如表1中Spc培养基所示)，调整菌体浓度，使菌体OD600值约为0.5；恒温水浴振荡培养(37℃，180r/min)，每间隔30min测定一次OD值，取对数生长期的菌液2mL接种于200mL37℃预热的SpII肉汤培养基中，在恒温水浴振荡器中继续培养(37℃，180r/min)90min，8000g离心5min收集菌体沉淀；取18mL上清液轻轻重悬菌体沉淀，此时的枯草芽孢杆菌已呈感受态状态可直接用于转化，1然后按照每份100μL进行分装，-20℃保存。
转化实验过程：在可用于转化的感受态枯草芽孢杆菌168中加入5μL线性化的质粒，轻轻混匀，接种加入1ml LB液体培养基，于37℃恒温培养2h，取100ul均匀涂布于氯霉素抗性平板，37℃恒温培养24-36h，培养效果如图6所示。
对比例3
将低温保存于甘油中的枯草芽孢杆菌168划线接种于LB固体培养基，37℃培养12h；挑单菌落接种于新鲜、37℃预热的20mL Spc肉汤培养基中(配方如表1中Spc培养基所示)，调整菌体浓度，使菌体OD600值约为0.5；恒温水浴振荡培养(37℃，180r/min)，每间隔30min测定一次OD值，取对数生长期的菌液2mL接种于200mL37℃预热的SpII肉汤培养基中，在恒温水浴振荡器中继续培养(37℃，180r/min)90min，8000g离心5min收集菌体沉淀；取18mL上清液轻轻重悬菌体沉淀，此时的枯草芽孢杆菌已呈感受态状态可直接用于转化，1然后按照每份100μL进行分装，-20℃保存。
转化实验过程：在可用于转化的感受态枯草芽孢杆菌168中加入5μL线性化的质粒，轻轻混匀，接种加入1ml LB液体培养基，于37℃恒温培养2h，取100ul均匀涂布于氯霉素抗性平板，37℃恒温培养24-36h，培养效果如图7所示。
性能检测
检测实施例2-4及对比例1-3中获得的重组转化子个数及转化成功率，结果如表2所示；
其中，重组转化子个数的检测方法为：统计实施例2-4及对比例1-3中转化实验过程获得的重组转化子的菌落数进行统计，即得；
转化成功率的检测方法为：观察实施例2-4及对比例1-3中转化实验过程中平板上是否长出了菌落，若长出了菌落，则转化成功率为100％，若未长出菌落，则转化成功率为0。
表2性能测试结果
测试项目 实施例2 实施例3 实施例4 对比例1 对比例2 对比例3
重组转化子个数/个 82 249 26 1 0 4
转化成功率/％ 100 100 100 100 0 100
由表2可知，与对比例1-3相比，实施例2-4中获得的重组转化子个数得到了显著提高。由此证明，本发明的培养基配方科学合理，为高效制备枯草感受态细胞创造了适宜的生长环境，培养后长出的重组转化子数量增多，转染效率得到了显著提高。
由表2可知，对比例1-3中，转化成功率为0或100％，重复稳定性不好。而实施例2-4中转化成功率均为100％。由此证明，采用本发明的培养基培养蜂毒肽重组质粒的枯草芽孢杆菌感受态细胞，重复稳定性好。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (7)

1.培养枯草芽孢杆菌感受态细胞的培养基，其特征在于，包括A和B，A由以下成分组成：硫酸铵0.2%，七水硫酸镁0.018%，酵母膏0.2%，葡萄糖0.5%，磷酸氢二钾1.4%，磷酸二氢钾0.6%，硫酸铵0.2%，柠檬酸三钠0.1%，溶剂为水，以质量百分比计，且A与B的体积比为1:10。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，B由以下成分组成：硫酸铵0.2%，七水硫酸镁0.084%，酵母膏0.1%，葡萄糖0.5%，磷酸氢二钾1.4%，磷酸二氢钾0.6%，硫酸铵0.2%，柠檬酸三钠0.1%，氯化钙0.1mol/L，溶剂为水，以质量百分比计。
3.权利要求1或2所述培养基的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
将枯草芽孢杆菌活化后，挑单菌落接种于A中，恒温水浴振荡培养，取菌液接种于B中，在恒温水浴振荡器中继续培养，离心收集菌体沉淀；取上清液重悬菌体沉淀，此时枯草芽孢杆菌处于感受状态。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述恒温水浴振荡培养的温度为37℃，培养时间为2h。
5.根据权利要求3或4所述的培养方法，其特征在于，所述恒温水浴振荡的转速为180转/min。
6.根据权利要求3、4或5所述的培养方法，其特征在于，所述离心转速为8000×g。
7.根据权利要求3、4、5或6所述的培养方法，其特征在于，所述继续培养的温度为37℃，时间为90min。
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殷素会等: "以CotB为分子载体表面展示蜂毒肽片段的枯草杆菌重组芽孢的构建", 《中国畜牧兽医学会2017年学术年会》 *

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