CN116355807B - 一种水貂源枯草芽孢杆菌制剂及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物工程领域，具体涉及一种水貂源枯草芽孢杆菌制剂及应用。本研究从水貂粪便中分离到一株枯草芽孢杆菌，命名为MG‑1。经过鉴定、生物学特性试验结果显示，枯草芽孢杆菌MG‑1为革兰阳性菌，呈杆状，可形成生物膜；对于高温、低pH、胃酸、胆盐等严峻环境具有高耐受性；模拟肠液可以促进枯草芽孢杆菌MG‑1的生长。

Description

一种水貂源枯草芽孢杆菌制剂及应用

技术领域

本发明属于微生物工程领域，具体涉及一种水貂源枯草芽孢杆菌制剂及应用。

背景技术

肠道微生物群是一个庞大又复杂的群体，其在宿主体内主要发挥肠道细胞增殖和分化、维持机体能量平衡、调节肠道内pH值、促进免疫系统发育等重要作用发挥着至关重要的作用。益生菌是指以适当剂量使用时为宿主提供健康益处的活微生物体。目前，最常用的益生菌主要有乳杆菌属、双歧杆菌属、乳球菌属、链球菌属、肠球菌属和芽孢杆菌属、酵母菌属。其中，因芽孢杆菌属可产生高耐受性的孢子抵御外界高热、低温、胃酸等严峻环境，且具有抗菌、抗癌、抗氧化和生产维生素等功能，常用作益生菌菌株，并且蜡状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝固芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、多发酵芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌已经商业化。然而，一些枯草芽孢杆菌菌株被证实会产生肠毒素。目前对于鼬科肠道微生物的研究较少。水貂作为特种经济动物，尚无相关益生菌产品。

发明内容

本发明提供了一种枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis），所述枯草芽孢杆菌在2023年03月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.26814。

本发明还提供了一种菌剂，包含上述枯草芽孢杆菌。

本发明还提供了上述菌种与菌剂在提高母水貂肠道IL12的表达量方面的应用。

本发明还提供了上述菌种与菌剂在制备益生菌药剂方面的应用。

本发明还提供了上述菌种与菌剂在降低公母水貂的炎症反应方面的应用。

本发明还提供了上述菌种与菌剂在帮助消化和吸收人体不能消化的大分子蛋白质方面的应用。

本发明有益效果如下：

本发明提供的枯草芽孢杆菌在高热、胃酸、胆盐、强酸和肠液等恶劣环境下仍能表现出良好的耐受性。本发明提供的枯草芽孢杆菌还可以水解大分子量的酪蛋白，通过优化条件可以提高其水解能力。因此，这种菌株可以帮助消化和吸收人体不能消化的大分子蛋白质。该菌株可以显著降低水貂肠道促炎因子的表达量，可以提高母水貂肠道IL12的表达量，均可降低公母水貂得炎症反应。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1 枯草芽孢杆菌MG-1的耐酸性

图2 枯草芽孢杆菌MG-1的胆汁盐耐受性

图3 枯草芽孢杆菌MG-1的肠液耐受性

图4 枯草芽孢杆菌MG-1的胃酸耐受性

图5 枯草芽孢杆菌MG-1的耐热性

图6 细胞因子表达量1

图7 细胞因表达量2

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，实施例中方法如无特殊说明均采用常规方法，使用试剂如无特殊说明，均为常规市售试剂或采用常规方法配置的试剂。该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1 菌株来源及分离纯化

样品采自中国青岛某养殖场水貂新鲜粪便，采用干冰运输至实验室-20℃储存，并进行分离纯化。获得单一菌株后对菌株进行形态学鉴定、生化鉴定、测序鉴定，全基因组测序后，上传至NCBI数据库，序列号为：CP110634。

实施例2 菌株耐受性测试

将菌株活化后，按10%的比例进行接种。接种于pH为2、3、4 LB肉汤中培养，进行耐酸试验，在0h、24h测量OD600；接种于含有1%胃蛋白酶且pH为3的LB肉汤中培养，进行耐胃酸试验，在0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h测量OD600；接种于含有0.1%、0.2%、0.3%胆汁盐的LB肉汤中培养，进行耐胆盐试验，在0 h、24 h测量OD600；接种于普通LB肉汤中，50℃、60 ℃、70 ℃水浴10 min后培养，进行耐热试验，在0 h、24 h测量OD600；接种于含有0.03%胆盐、1%胰蛋白酶的LB肉汤中进行耐肠液试验，在0 h、24 h测量OD600。以上试验均于恒温震荡培养箱中培养，培养条件为37℃、220 rpm/min。通过OD600值计算相对存活率。

枯草芽孢杆菌MG-1的耐酸性见图1。在pH为2时，MG-1的相对存活率最低，为64.75%。在pH分别为3和4时，相对存活率为75.95%和77.73%。

枯草芽孢杆菌MG-1的胆汁盐耐受性见图2。伴随着胆汁盐浓度的升高，MG-1的相对存活率逐渐降低。胆汁盐浓度为0.1%、0.2%、0.3%时，MG-1的相对存活率分别为61.78%、56.12%、49.44%。

枯草芽孢杆菌MG-1的肠液耐受性见图3。结果表明，枯草芽孢杆菌MG-1的相对存活率达到316.26%。

枯草芽孢杆菌MG-1的胃酸耐受性结果见图4。结果表明，在0.5-1h，试验组生长未见变化，对照组生长正常；随着时间的增加，试验组开始生长，并显示较强的耐受性。

枯草芽孢杆菌MG-1的耐热性见图5。结果表明，枯草芽孢杆菌MG-1在经过50℃、60℃、70℃的处理后相对存活率分别为236.61%、81.15%、117.21%。

实施例3 细胞因子表达量实验

将枯草芽孢杆菌MG-1以1%的比例加入到水貂日料中进行饲喂，具体方案如表1所示：

表1 动物试验方案

，

饲喂30天后，收集水貂空肠，提取RNA，通过qRT-PCR对细胞因子进行检测。细胞因子引物如表2所示。基因表达量采用2-△△CT法进行差异分析。

表2 细胞因子引物

，

细胞因子表达量结果如图6和图7所示。该菌株饲喂可以降低母水貂肠道促炎因子IL12、IL6、IFN-γ、TNF-α的表达量以及TLR4的表达量；提高了IL2的表达量，因此该菌株可以降低母水貂肠道炎症反应，提高免疫力作用，表明非肠道定植菌可能通过其代谢产物发挥主要益生功能。该菌株饲喂可降低公水貂肠道IL4、IL2、TNF-α、TLR4的表达量，提高了IL12的表达量，表明其在抗炎症方面具有不同的作用和效果。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (4)

1.一种枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis），其特征在于，所述枯草芽孢杆菌在2023年03月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.26814。

2.一种菌剂，其特征在于，包含如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌。

3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌或如权利要求2所述的菌剂在制备益生菌药剂方面的应用。

4.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌或如权利要求2所述的菌剂在制备降低公母水貂的炎症反应药物方面的应用。