CN109897800A - 一株富硒坚强肠球菌a8-1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株富硒坚强肠球菌A8‑1及其应用，该富硒坚强肠球菌命名为Enterococcus durans A8‑1，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC No：M2018497，保藏日期为2018年7月25日。其生长性能及抗逆性能优良，可耐受酸、耐受高浓度胆盐和NaCl，可黏附于肠道上皮和肠粘膜；该菌具有显著的生物富硒作用，对无机硒的转化率高达82％，细胞富硒后的发酵液上清抑菌活性显著提高；同时该菌对肠球菌常见14种抗生素均敏感，不存在溶血和明胶水解的毒力表型，相关毒力基因检测阴性，对大蜡螟无毒。该菌株一方面可以作为益生性肠球菌进行产品开发，具有潜在的应用价值，另一方面也可作为基因改造的优良肠球菌出发菌株、生产外源蛋白的工程菌株。

Description

一株富硒坚强肠球菌A8-1及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一株富硒坚强肠球菌A8-1及其应用。

背景技术

肠球菌(Enterococcus spp.)属于乳酸菌的一大类，革兰氏阳性球菌，需氧或者兼性厌氧，广泛分布于环境、食品，同时也是是人类及动物肠道菌群的重要组成之一。常见有粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)等，目前肠球菌属已增加至41个种。一般认为肠球菌可以产L-乳酸、形成生物膜附着于肠粘膜、分解部分蛋白质、产抑菌活性的细菌素等，具有改善肠道微环境、促进宿主对营养物质、调节肠道菌群平衡、提高宿主免疫力、降低胆固醇等益生功能。肠球菌作为益生菌，已广泛应用于食品、动物饲料添加剂、微生态制剂等。我国2008年已经将粪肠球菌列为可饲用的微生物菌种，目前为止，允许添加的饲用微生物已增至34种。动物微生态制剂的作用机制包括调节胃肠道菌群平衡、竞争排斥有害菌在宿主肠道的黏附、产生抑菌物质抑制有害菌、抗病毒、保护肠道上皮屏障完整性、刺激机体的非特异性及特异性免疫系统来增加宿主免疫力、促进宿主生长发育、降解环境中的有害物质等。

虽然坚强肠球菌还未被列入可饲用的微生物菌种目录，但越来越多的研究证实了坚强肠球菌具有显著的益生特性。据报道，坚强肠球菌KLDS6.0933、KLDS6.0930耐酸、耐胆盐，且具有显著的降低胆固醇作用，被认为是潜在的益生菌。一般认为无毒副作用、耐胃酸和胆汁、可黏附于肠道上皮和肠粘膜、群体遗传稳定等是筛选优良益生菌菌种的重要因素。

可开发为益生菌的菌株首先应该不能对宿主有毒性，然后应对宿主的消化道环境有一定的耐受性，并可以较好的黏附于宿主消化道黏膜表层，同时具有较高的生物活性。优良的菌种对益生菌发挥功效至关重要，益生菌菌种的开发同时也要考虑到菌株的安全性，包括毒力因子、耐药基因等，因此从人源或者食品中分离优良菌种，并充分评价其安全性，对其进一步研究和开发均具有显著的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一株富硒坚强肠球菌A8-1及其应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一株富硒坚强肠球菌A8-1，该富硒坚强肠球菌命名为Enterococcusdurans A8-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC No：M2018497，保藏日期为2018年7月25日。

本发明还公开了上述的富硒坚强肠球菌A8-1在制备富硒微生态制剂或富硒功能食品中的应用。

本发明还公开了上述的富硒坚强肠球菌A8-1在制备致病菌抑菌剂中的应用。

进一步地，富硒坚强肠球菌A8-1经富硒培养后抑菌能力增强。

本发明还公开了上述的富硒坚强肠球菌A8-1在制备饲料添加剂、食品添加剂、保健食品、宠物功能食品或兽药中的应用。

本发明还公开了上述的富硒坚强肠球菌A8-1在制备抗辐射化妆品或免疫佐剂的应用。

本发明还公开了上述的基因改造的优良肠球菌出发菌株、生产外源蛋白的工程菌株的应用。

本发明还公开了一种微生态制剂，所述微生态制剂中含有上述的富硒坚强肠球菌A8-1。

优选地，所述微生态制剂中还包括与富硒坚强肠球菌A8-1复配的益生菌、多糖类活性物质或多酚类活性物质

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明从健康婴幼儿粪便标本中获得一株坚强肠球菌Enterococcus durans A8-1，保藏编号为CCTCC NO：M 2018497，其生长性能及抗逆性能优良，可耐受酸、耐受高浓度胆盐和NaCl，可黏附于肠道上皮和肠粘膜；该菌具有显著的生物富硒作用，对无机硒的转化率高达82％，细胞富硒后的发酵液上清抑菌活性显著提高；同时该菌对肠球菌常见14种抗生素均敏感，不存在溶血和明胶水解的毒力表型，相关毒力基因检测阴性，对大蜡螟无毒。该菌株一方面可以作为益生性肠球菌进行产品开发，具有潜在的应用价值，另一方面也可作为基因改造的优良肠球菌出发菌株、生产外源蛋白的工程菌株。

进一步地，坚强肠球菌分离株A8-1对常见致病菌具有明显的抑菌作用，特别是革兰氏阴性致病菌，抑菌谱广。

本发明经过实验验证，坚强肠球菌A8-1分离株生长条件不严苛，抗逆性优良，无毒、无害、安全性较好；同时该菌株可黏附于宿主消化道黏膜，具有维持肠道物理屏障、促进肠道上皮细胞的损伤修复作用，可调节肠道微生物区系平衡，促进肠道固有菌定植，有效抑制病原菌的繁殖，促进宿主健康，增强宿主对不良环境的抵抗力是一株具有开发价值的益生菌菌株。相对于严格厌氧的双歧杆菌和乳杆菌，肠球菌的生长特性决定其便于工业化发酵、生产、储藏、运输和使用，可作为动物用微生态制剂单独或者复配使用，也可用作饲料添加剂用于畜禽养殖、宠物功能食品。

附图说明

图1为坚强肠球菌A8-1培养物在显微镜下的镜检结果；其中，(a)奥林巴斯CX31显微镜，放大倍数100×100)；(b)为A8-1在MRS固体培养基上的生长状态；

图2为A8-1与其他细菌的16s rRNA序列比对进化树分析；

图3为坚强肠球菌A8-1在MRS培养基中的生长曲线分析；其中，(a)厌氧环境和好氧环境的生长能力比较；(b)不同pH条件下的生长能力比较；(c)不同胆盐浓度下的生长能力比较；(d)不同NaCl浓度下的生长能力比较；

图4坚强肠球菌A8-1对Mucin-黏蛋白、Collagen-胶原蛋白、BSA-血清白蛋白的体外相对黏附力；

图5坚强肠球菌A8-1在添加不同浓度亚硒酸钠的MRS培养基中的生长曲线；

图6为坚强肠球菌A8-1的生长情况；其中，(a)为在添加(右)和不添加(左)30μg/ml亚硒酸钠的MRS培养基中的24h培养物的照片；(b)为A8-1在添加(右)和不添加(左)30μg/ml亚硒酸钠的MRS培养基中的24h培养物离心后，生理盐水洗涤的照片；(c)为菌体重悬于生理盐水中的照片；

图7为不同转接量的坚强肠球菌A8-1在30μg/ml亚硒酸钠的MRS培养基中的24h培养物，从左至右分别是无亚硒酸钠培养物对照、3％、5％、7％、9％的转接量；

图8为坚强肠球菌A8-1在血平板上的生长(a)；溶血定量实验(b)，从左至右依次为坚强肠球菌A8-1、金黄色葡萄球菌ATCC25923、阴性对照、阳性对照；

图9为坚强肠球菌产明胶酶实验；(a)为-1(明胶水解阴性)；(b)空白对照(明胶未水解，下方试管)；粪肠球菌致病株C66(明胶水解阳性，上方试管)；

图10为大蜡螟的72h存活实验坚强肠球菌A8-1、粪肠球菌ATCC 29212、婴儿双歧杆菌CICC6069，每个菌株设置3个浓度梯度(10⁶CFU、10⁷CFU、10⁸CFU)；

图11为坚强肠球菌A8-1毒力基因PCR检测结果。

菌株保藏

富硒坚强肠球菌A8-1命名为Enterococcus durans A8-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址是中国武汉武昌珞珈山，保藏名称为Enterococcus durans A8-1，分类命名为Enterococcus durans,保藏号是CCTCC NO：M2018497，保藏日期为2018年7月25日。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

从健康婴幼儿粪便标本中分离出一株生长性能优良的兼性厌氧菌株A8-1，A8-1在MRS固体平板上单菌落呈圆形，白色不透明，边缘整齐光滑，直径约0.6-0.9mm，如图1中(a)所示。革兰氏染色阳性，无荚膜、无芽孢，该菌的显微镜观察图片见图1中(b)。

1、分离株鉴定

提取A8-1总DNA，并一直为模板，扩增1.5kb 16S rRNA序列，16S rRNA PCR引物为16S-F:5'AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG3'，16S-R:5‘GGT ACC T TG TTA CGA CTT3'。扩增程序为：94℃,4min,1个循环预变性；94℃变性，30sec，58℃退火，30sec，72℃延伸，1min，30个循环；72℃7min。PCR扩增体系为20μl PCR体系中分别加入10mM dNTP 1.6μl，10×Taq酶buffer 2μl，1nM PCR引物各1μl，A8-1总DNA模板2-3ng，Taq DNA聚合酶0.2μl，以MiniQ水补足20μl。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证后，用PCR产物回收试剂盒回收，并送测序公司测序。测序结果与NCBI上公布的细菌16S rRNA序列比对，结果参见图2所示。其16s rRNA序列进行PCR扩增，扩增片段测序后进行NCBI数据库的细菌16s rRNA序列比对(序列号MH385353)，证实该分离株属于坚强肠球菌，命名为坚强肠球菌Enterococcus durans分离株A8-1。菌株现保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2018497。

2、抗逆性实验(耐酸、耐胆盐、耐NaCl实验)

将经MRS培养基37℃过夜培养的A8-1液体培养物离心收集细胞，无菌PBS洗涤2次，测定OD₆₀₀。96孔板中加入200μLMRS培养基(分别调节pH至2.0、3.0、4.0、5.0；0.5％、1％、2％、3％的胆盐；1.75％、3.5％、7％的NaCl)，每种培养基设3个重复，将A8-1以终浓度为OD₆₀₀＝0.1的浓度加入培养基，以200μLMRS空白培养基含有OD₆₀₀＝0.1的A8-1为阴性对照。全自动酶标仪37°下连续20h测定细菌生长OD₆₀₀，每30min测定一次。

好氧培养：A8-1单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃摇床过夜培养。

厌氧培养：A8-1单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养箱静置过夜培养；在酶标板上培养时，每个孔加入培养基和菌体后，再覆盖无菌凡士林50μL。

实验结果：

1)耐受氧气

菌株A8-1在有无氧气的情况下均可生长，且在有氧培养时生长状态显著优于厌氧培养。在有氧时，该菌的最大OD₆₀₀可达到2.6630，厌氧培养时仅为1.8670。且在有氧培养时，该菌株生长速率高、稳定期长，如图3中(a)所示。

2)耐酸特性

在不同pH的MRS培养基中，菌株A8-1均可存活。

在有氧条件下，当pH＝5.0时，该菌的最大OD₆₀₀可达到最适生长条件的60％(1.5480 vs 2.6630)；当pH＝4.0时，该菌的最大OD₆₀₀可达到最适生长条件的21％(0.5527vs 2.6630)；当pH＝3.0时，该菌的最大OD₆₀₀可达到最适生长条件的18％(0.4870vs 2.6630)。在厌氧条件下，当pH＝5.0时，该菌的最大OD₆₀₀可达到最适生长条件的94％(1.7543 vs 1.8670)；当pH＝4.0时，该菌的最大OD₆₀₀可达到最适生长条件的50％(0.8830vs 1.8670)；当pH＝3.0时，该菌的最大OD₆₀₀可达到最适生长条件的36％(0.6730 vs1.8670)。表明菌株A8-1在厌氧条件下对低pH具有很好的耐受能力。参见图3中(b)，表明菌株A8-1在厌氧条件下对低pH具有很好的耐受能力。

3)耐胆盐特性

在4种胆盐浓度的MRS培养基中，菌株A8-1的生长状态均非常好。

有氧条件下，在含有0.5％、1％、2％、3％胆盐的MRS培养基中，该菌的最大OD₆₀₀分别为2.5847、3.1353、2.6090、2.0067，相比与MRS培养基(2.6630)，0.5％、2％、3％胆盐对A8-1的生长无影响(P>0.05)，而1％的胆盐对该菌的生长有特异的促进作用(P<0.05)。

厌氧条件下，在含有0.5％、1％、2％、3％胆盐的MRS培养基中，该菌的最大OD₆₀₀分别为2.8050、2.5457、1.3957、0.9470，相比与MRS培养基(1.8630)，0.5％、1％的胆盐对该菌的生长有特异的促进作用(P<0.01)。

结果如图3中(c)所示，说明A8-1在胆盐耐受能力上有非常突出的优势。

4)耐NaCl特性

在3种NaCl浓度的MRS培养基中，菌株A8-1的生长状态均非常好。

有氧条件下，1.75％、3.5％的NaCl可以促进A8-1的生长，其最大OD₆₀₀分别为3.1407(P<0.01)和2.7150(P<0.05)。当NaCl浓度达到7％时，其最大OD₆₀₀为1.8470，和MRS培养基(2.6630)中的最大OD₆₀₀没有显著差异(P>0.05)。

厌氧条件下，1.75％的NaCl对A8-1生长无影响，其最大OD₆₀₀为1.7350，相比与MRS培养基(1.8670)，3.5％和7％的NaCl对A8-1生长有一定的抑制作用，其最大OD₆₀₀分别为0.6545和0.9535，但是细胞仍存活，并未死亡。

结果如图3中(d)所示，说明A8-1在NaCl的耐受能力上也有非常突出的优势。

3、体外结合BSA、胶原蛋白、粘蛋白实验

96孔板(黑色)分别加入100μL/孔的黏蛋白溶液(500μg/ml)、胶原溶液(50μg/ml)、BSA溶液(500μg/ml)，4℃过夜孵育，结束后用无菌PBS洗板2次，室温晾干。

用DMSO配置5-(6-)-羧基荧光素二乙酸酯(cFDA)溶液母液，浓度为3.5mg/ml。收集MRS液体培养基过夜培养的A8-1细胞，使用无菌PBS溶液调节OD₆₀₀到0.25。每2ml细菌悬液加入20μL cFDA溶液，混匀后室温避光孵育1h，然后10000rpm离心5min，弃上清，无菌PBS洗涤荧光标记的菌体一次，再重悬于2mlPBS中。

将100μL cFDA标记的菌悬液/孔加入已经固定好底物的黑色96孔板，4℃避光过夜孵育，然后PBS洗涤反应孔3次，最后再加入100μLPBS/孔。将100μL cFDA标记的菌悬液加入未固定底物的孔中做对照。使用酶标仪检测孔板的荧光强度，并按照公式分别计算A8-1对黏蛋白、胶原、BSA的黏附率：

黏附率％＝(黏附实验后的荧光强度)/(细菌原始的荧光强度)×100％

以鼠李糖杆菌Lactobacillus rhamnosus GG BL379为阳性对照，将其黏附率定位100％，计算A8-1相对于L.rhamnosus GG BL379的相对黏附力。

实验结果：

由图4可以看出，A8-1在厌氧培养时对黏蛋白、白蛋白和胶原蛋白均具有非常好的黏附力，其相对黏附力分别为LGG的5.8、5.7和1.8倍。

4、药敏实验

采用Vitek32微生物分析仪及配套的药敏条对(GP67)所分离的肠球菌进行抗生素的耐药表型检测，包括苄青霉素、氨苄西林、高水平庆大霉素(协同作用)、高水平链霉素(协同作用)、环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、红霉素、氯林霉素(克林霉素)、喹奴普丁/达福普汀、利奈唑胺、万古霉素、四环素、替加环素和呋喃妥因15种临床常见抗生素。根据分析仪所获得的最低抑菌浓度(MIC)与CLSI 2017数据库中判断文件比较，判别细菌对某种药物的敏感程度。

实验结果：

坚强肠球菌A8-1的抗生素敏感性检测结果见表1，结果显示在15种检测的抗生素中，A8-1对14种抗生素敏感，分别是氨苄西林、苄青霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、利奈唑胺、万古霉素、替加环素、呋喃妥因、高水平庆大霉素(协同作用)、高水平链霉素(协同作用)、红霉素、奎奴普汀和四环素；仅对克林霉素1种抗生素呈耐药。结果说明该菌株的抗生素敏感性好，安全性很高。

表1坚强肠球菌A8-1的抗生素药敏检测结果(肉汤稀释法)

5、溶血定性和定量实验

划线接种于血平板上，37℃培养24h，观察溶血环。

无菌脱纤维羊血4℃800g离心10min收集红细胞，预冷的无菌PBS轻柔洗涤，再离心再洗涤，重复3次。将经MRS培养基过夜培养的对数期A8-1调节OD₆₀₀至1.0-1.5，并准备菌体悬液为3个稀释度1、1/2、1/4。每个反应依次加入25μL红血球悬液、100μL不同稀释度的菌体悬液、850μL无菌PBS，轻柔混匀，37℃孵育30min。每个稀释度做3个重复。反应结束后4℃5500rpm离心1min，取上清测定OD543。阳性对照：100μL 1％tritonX100+25μL红细胞悬液+850μL PBS，阴性对照：975μL PBS+25μL红细胞悬液。该菌的溶血定量(％)＝(样品OD₅₄₃-阴性对照OD₅₄₃)/(阳性对照OD₅₄₃-阴性对照OD₅₄₃)。

实验结果：

坚强肠球菌致病株可产生溶血素，也叫细胞溶素(cytolysin)，在宿主病损部位高表达时可破坏宿主细胞，引起相关疾病。A8-1菌株在血平板上生长无明显的溶血环，如图8中(a)所示，溶血活性定量结果显示，其相对溶血活性为4.57％，和婴儿双歧杆菌CICC6069的相对溶血活性(2.18％)无显著差异(P>0.05)。如图8中(b)所示，从左至右依次为坚强肠球菌A8-1(淡粉色)、金黄色葡萄球菌ATCC25923(红色)、阴性对照(淡粉色)、阳性对照(红色)。

6、产明胶酶实验(明胶水解实验)

有些细菌具有明胶酶(亦称类蛋白水解酶)，能将明胶先水解为多肽，又进一步将多肽水解为氨基酸，明胶失去凝胶性质，使培养基由固态变为液态。明胶酶是坚强肠球菌致病株的一类重要的毒力因子。

将经MRS培养基过夜培养的待测A8-1，按1％接种量接种于明胶液体培养基中，于37℃培48h，静置于4℃冰箱1h，立即取出观察是否有液化现象，有明胶液化现象的为水解明胶阳性。

实验结果：

参见图9，菌株A8-1的明胶酶实验结果显示其明胶水解实验阴性，不产生明胶酶。

7、毒力实验

使用大蜡螟作为毒力测试对象。将经MRS培养基培养的进入稳定期的A8-1液体培养物离心，无菌PBS洗涤2次去除菌体的培养基残留，将细菌重悬于无菌PBS中。每个虫子腹腔注射10⁶、10⁷、10⁸CFU的细菌(不超过20μL)，每组20只，对照组注射等体积的无菌PBS。将注射后的大蜡螟置于37度培养箱中，连续观察72h，记录每组虫子其黑化与死亡情况。以婴儿双歧杆菌ATCC15697和屎肠球菌ATCC29212为对照菌株。

实验结果：

经过连续3天的观察，注射MRS空白培养基和生理盐水的对照组虫子100％存活，坚强肠球菌ATCC29212的10⁶CFU、10⁷CFU、10⁸CFU注射组存活率分别是100％、90％、0％；双歧杆菌ATCC15697的10⁶CFU、10⁷CFU、10⁸CFU注射组存活率分别是100％、80％、80％；坚强肠球菌分离株A8-1的10⁶CFU、10⁷CFU、10⁸CFU注射组存活率分别是100％、90％、80％。72h存活力曲线见图10。结果表明A8-1对大蜡螟的毒性和婴儿双歧杆菌CICC6069相当，另外在10⁸CFU注射时其毒性低于婴儿双歧杆菌CICC6069。

8、毒力因子相关基因的PCR检测

采用PCR方法对肠球菌常见的9种毒力因子相关基因进行检测，PCR引物见表2，扩增程序为：94℃,4min,1个循环预变性；94℃变性，30sec，58℃-48℃退火，30sec，72℃延伸，30sec，35个循环；72℃7min。PCR扩增体系为20μl PCR体系中分别加入10mM dNTP 1.6μl，10×Taq酶buffer 2μl，1nM PCR引物各1μl，G-14总DNA模板2-3ng，Taq DNA聚合酶0.2μl，以MiniQ水补足20μl。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

表2毒力因子的引物序列表

实验结果：

参见图11，毒力因子包括溶细胞素cylA、肠球菌外膜蛋白esp、透明质酸酶hylfm、心内膜炎抗原efaA、肠球菌黏附素acm、胶原蛋白黏附素ace、聚集物质agg检测均为阴性。聚集物质asa1、明胶酶gelE和聚集物质agg检测阳性，但是明胶水解阴性，这可能提示即便是该菌携带了某毒力基因，但并未表达，或者基因突变，导致表达的蛋白没有功能。

9、A8-1对不同浓度无机硒的耐受能力

将经MRS培养基37℃过夜培养的A8-1液体培养物穿刺接种与MRS斜面培养基(分别含有终浓度为0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200μg/ml的Na₂SeO₃)，37°培养箱静置培养24h，观察菌落颜色变化。

将经MRS培养基37℃过夜培养的A8-1液体培养物离心收集细胞，无菌PBS洗涤2次，测定OD₆₀₀。96孔板中加入200μLMRS培养基(分别终浓度为10、20、30、40、50、75、100μg/ml的Na₂SeO₃)，每种培养基设3个重复，将A8-1以终浓度为OD₆₀₀＝0.1的浓度加入培养基，以200μLMRS空白培养基含有OD₆₀₀＝0.1的A8-1为阴性对照。全自动酶标仪37°下连续24h测定细菌生长OD₆₀₀，每30min测定一次。

实验结果：

如图5和图6所示，图6中，(a)图为A8-1在添加(右，深红色)和不添加(左，黄色)30μg/ml亚硒酸钠的MRS培养基中的24h培养物的照片；(b)图为A8-1在添加(右，粉红色)和不添加(左，无色)30μg/ml亚硒酸钠的MRS培养基中的24h培养物离心后，生理盐水洗涤的照片；(c)图为A8-1在添加(右，红色沉淀)和不添加(左，无色)30μg/ml亚硒酸钠的MRS培养基中的24h培养物离心后，菌体重悬于生理盐水中的照片。实验结果表明，不同浓度的亚硒酸钠对A8-1的生长影响不同，10μg/ml亚硒酸钠可以促进A8-1的生长，当亚硒酸钠为30μg/ml时，A8-1的生长虽然受硒的影响，但菌株富硒率最高，可达75.2％，随着亚硒酸钠浓度继续升高，A8-1生长受抑，富硒率也开始下降，因此后续实验以30μg/ml亚硒酸钠为适宜的富硒浓度。

10、不同接种量及起始培养基pH对菌株富集硒的影响

将经MRS培养基37℃过夜培养的A8-1液体培养物以1％、3％、5％、7％、9％的转接量加入含有终浓度为30μg/ml的Na₂SeO₃的MRS试管培养基(3ml)，每个接种量设3个重复，以同样接种量的不含Na₂SeO₃的MRS培养基作为为阴性对照，37°通气培养24h，测定细菌生长OD₆₀₀，比较菌对硒的富集率。

将经MRS培养基37℃过夜培养的A8-1液体培养物以7％的转接量转接至新鲜的MRS液体试管中，通气培养，分别在0h、2h、4h、6h和8h分别加入终浓度为30μg/ml的Na₂SeO₃，每个处理设3个重复，以同样接种量的不含Na₂SeO₃的MRS培养基作为为阴性对照，37°通气培养24h，测定细菌生长OD₆₀₀，比较菌对硒的富集率。

实验结果：

参见图7，从左至右分别是无亚硒酸钠培养物对照(无色)、3％(粉红)、5％(粉红)、7％(淡粉)、9％的转接量(淡粉)。将A8-1过夜培养物以不同接种量接入MRS培养基(含30μg/ml亚硒酸钠)中，24h后显示随着接种量的升高，A8-1的生物量，即OD₆₀₀逐渐增高，直到3％接种量的时候OD₆₀₀达到最高(0.78±0.08)，相当于同样接种量培养物(不含亚硒酸钠)的生物量的56％，此时菌株的富硒率最高，达到82.3％。同时，我们发现A8-1的24h培养物pH约为4.5-4.7，含30μg/ml亚硒酸钠的MRS培养基中A8-1的24h培养物pH约为5.0；当调整转接时MRS培养基的pH至6.8-7.0时，A8-1的生物量最高，富硒率也最高。

11、富硒效果评价

参照国标GB5009.93-2017(食品中硒的测定-原子荧光光谱法)进行菌体中硒含量的测定。样品处理方法为收集菌体(约0.5g)，洗涤除去表面吸附的无机硒，湿法消化(硝酸：高氯酸＝10.2)，过夜消化，将六价硒还原为四价硒，50ml容量瓶定容，混匀，上机测定。以硒标准液做标准曲线(硒含量为横坐标，荧光强度为纵坐标)，从标准曲线上求出菌体样品中的硒含量。

菌对硒的富集率(％)＝菌体吸收的总硒(μg/ml)/培养基中硒的添加量(μg/ml)×100％

实验结果：经计算，坚强肠球菌A8-1对无机硒的最佳富集率是84％。

12、抑菌实验

以4％的转接量将A8-1过夜培养物转接至MRS液体培养基中37℃通气培养，4h(对数生长初期)加入30μg/ml的Na₂SeO₃，继续培养至16h，离心收集菌体，无菌PBS调节细胞OD₆₀₀至1.0/ml，冰上超声破碎细胞，4℃离心去掉沉淀，0.22μm滤膜过滤除菌，以之为A8-1的无细胞提取物进行体外抑菌实验，以同样培养条件下不添加亚硒酸钠的A8-1的MRS培养物的无细胞提取物作为阴性对照。

采用牛津杯法测定A8-1菌株的抑菌活性，指示菌为大肠杆菌ATCC19433、金黄色葡萄球菌ATCC25923、蜡样芽孢杆菌CMCC63301、沙门氏菌cdc87、绿脓杆菌PA01、铜绿假单胞菌ATCC27853、阴沟肠杆菌ATCC700323。指示菌涂布营养琼脂平板，将牛津杯至入琼脂中，分别添加100μL、200μL的无细胞提取物，以无菌PBS作为空白对照，37℃培养24h后测定抑菌圈直径。

实验结果：

测试菌株的抑菌圈见表3，A8-1发酵液上清对革兰氏阴性细菌的抑菌能力显著低于革兰氏阳性细菌，且富硒培养后A8-1发酵液上清抑菌能力显著提高。

表3坚强肠球菌A8-1发酵液上清的抑菌效果

*革兰氏阳性细菌使用四环素，革兰氏阴性细菌使用卡那霉素

综上所述，本发明的坚强肠球菌A8-1分离株生长条件不严苛，抗逆性优良，无毒、无害、安全性较好；同时该菌株可黏附于宿主消化道黏膜，具有维持肠道物理屏障、促进肠道上皮细胞的损伤修复作用，可调节肠道微生物区系平衡，促进肠道固有菌定植，有效抑制病原菌的繁殖，促进宿主健康，增强宿主对不良环境的抵抗力是一株具有开发价值的益生菌菌株。相对于严格厌氧的双歧杆菌和乳杆菌，肠球菌的生长特性决定其便于工业化发酵、生产、储藏、运输和使用，可作为动物用微生态制剂单独或者复配使用，也可用作饲料添加剂用于畜禽养殖、宠物功能食品。

同时，A8-1具有显著的生物富集硒的功能，其可将胞外无机硒转化为有机硒和零价态的纳米硒，不但能够有效降低无机硒毒性，而且易于被人体吸收，并发挥有机硒特有的活性，包括抑菌、抗肿瘤、抗氧化、增强机体免疫力等，在富硒功能食品及相关富硒微生态制剂、添加剂等的开发和应用中具有广阔的前景，也可针对性进行菌株改造，用于多种微量元素的生物富集，开发功能性益生菌及其发酵食品、膳食补充剂、抗菌药物替代品等。

坚强肠球菌A8-1对多种常用抗生素敏感、生物安全性高，还可用于生物富集其他重金属，可开发为生物制剂，作为污水处理的复配生物填料等在环境污染治理等方面发挥作用。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (9)

1.一株富硒坚强肠球菌A8-1，其特征在于，该富硒坚强肠球菌命名为Enterococcusdurans A8-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC No：M2018497，保藏日期为2018年7月25日。

2.权利要求1所述的富硒坚强肠球菌A8-1在制备富硒微生态制剂或富硒功能食品中的应用。

3.权利要求1所述的富硒坚强肠球菌A8-1在制备致病菌抑菌剂中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，富硒坚强肠球菌A8-1经富硒培养后抑菌能力增强。

5.权利要求1所述的富硒坚强肠球菌A8-1在制备饲料添加剂、食品添加剂、保健食品、宠物功能食品或兽药中的应用。

6.权利要求1所述的富硒坚强肠球菌A8-1在制备抗辐射化妆品或免疫佐剂的应用。

7.权利要求1所述的富硒坚强肠球菌A8-1作为基因改造的优良肠球菌出发菌株、生产外源蛋白的工程菌株的应用。

8.一种微生态制剂，其特征在于，所述微生态制剂中含有权利要求1所述的富硒坚强肠球菌A8-1。

9.如权利要求8所述的微生态制剂，其特征在于，所述微生态制剂中还包括与富硒坚强肠球菌A8-1复配的益生菌、多糖类活性物质或多酚类活性物质。