CN110004072A - 一株益生性粪肠球菌分离株a3-1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株益生性粪肠球菌分离株A3‑1及其应用，从健康婴幼儿粪便标本中获得一株粪肠球菌Enterococcus faecalis A3‑1，保藏编号为CCTCC No：M2018498，上述粪肠球菌A3‑1分离株生长条件不严苛，抗逆性优良，无毒、无害、安全性较好；同时该菌株可黏附于宿主消化道黏膜，具有维持肠道物理屏障、促进肠道上皮细胞的损伤修复作用，可调节肠道微生物区系平衡，促进肠道固有菌定植，有效抑制病原菌的繁殖，促进宿主健康，增强宿主对不良环境的抵抗力是一株具有开发价值的益生菌菌株。可作为动物饲料添加剂用于畜禽养殖、宠物功能食品。

Description

一株益生性粪肠球菌分离株A3-1及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一株益生性粪肠球菌分离株A3-1及其应用。

背景技术

乳酸菌是人及动物肠道内的重要的优势益生菌，无毒副作用的乳酸菌微生态制剂近年来受到了广泛关注。肠球菌属，又叫粪链球菌，原属于链球菌属，在1984 年被列为独立的新菌属粪肠球菌(Enterococcus faecalis)是肠球菌属的代表种，革兰阳性、触媒阴性的兼性厌氧球菌，是人类及动物肠道菌群的重要组成之一。一般认为粪肠球菌可以产L-乳酸、形成生物膜附着于肠粘膜、分解部分蛋白质、产抑菌活性的细菌素等，具有改善肠道微环境、促进宿主对营养物质等益生功能。

我国2008年(农业部1126号公告)已经将粪肠球菌列为可饲用的微生物菌种，目前为止，允许添加的饲用微生物已增至34种。动物微生态制剂的作用机制包括调节胃肠道菌群平衡、竞争排斥有害菌在宿主肠道的黏附、产生抑菌物质抑制有害菌、抗病毒、保护肠道上皮屏障完整性、刺激机体的非特异性及特异性免疫系统来增加宿主免疫力、促进宿主生长发育、降解环境中的有害物质等。优良的菌种对益生菌发挥功效至关重要。

一般认为无毒副作用、耐胃酸和胆汁、可黏附于肠道上皮和肠粘膜、群体遗传稳定等是筛选优良益生菌菌种的重要因素。可开发为益生菌的菌株首先应该不能对宿主有毒性，然后应对宿主的消化道环境有一定的耐受性，并可以较好的黏附于宿主消化道黏膜表层，同时具有较高的生物活性。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一株益生性粪肠球菌分离株A3-1及其应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一株益生性粪肠球菌分离株A3-1，该益生性粪肠球菌分离株 A3-1命名为Enterococcus faecalis A3-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC No：M2018498，保藏日期为2018年7月25日。

本发明还公开了上述的益生性粪肠球菌分离株A3-1在制备致病菌抑菌剂中的应用。

优选地，所述致病菌为革兰氏阴性致病菌。

优选地，所述革兰氏阴性致病菌包括大肠杆菌ATCC19433、沙门氏菌cdc87、绿脓杆菌PA01、铜绿假单胞菌ATCC27853和阴沟肠杆菌ATCC700323。

本发明还公开了上述益生性粪肠球菌分离株A3-1在制备饲料添加剂、食品添加剂、保健食品、宠物功能食品或兽药中的应用。

本发明还公开了上述益生性粪肠球菌分离株A3-1在制备抗辐射化妆品或免疫佐剂的应用。

本发明还公开了上述益生性粪肠球菌分离株A3-1在制备微生态制剂中的应用。

一种微生态制剂，所述微生态制剂中含有上述的益生性粪肠球菌分离株A3-1。

优选地，所述微生态制剂中还包括多糖类活性物质或多酚类活性物质。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明从健康婴幼儿粪便标本中获得一株粪肠球菌Enterococcus faecalis A3-1，保藏编号为CCTCC No：M2018498，其在好氧条件下生长性能优异，对多种抗生素敏感，不溶血，无毒性，耐受NaCl、胆盐、酸，特别的高浓度的胆盐和NaCl对菌株的生长具有显著的促进作用；同时该菌的细胞可高效的结合肠道黏蛋白、胶原、BSA，产生物膜定植于消化道。

进一步地，粪肠球菌分离株A3-1对常见致病菌具有明显的抑菌作用，特别是革兰氏阴性致病菌，抑菌谱广。

本发明经过实验验证，上述粪肠球菌A3-1分离株生长条件不严苛，抗逆性优良，无毒、无害、安全性较好；同时该菌株可黏附于宿主消化道黏膜，具有维持肠道物理屏障、促进肠道上皮细胞的损伤修复作用，可调节肠道微生物区系平衡，促进肠道固有菌定植，有效抑制病原菌的繁殖，促进宿主健康，增强宿主对不良环境的抵抗力是一株具有开发价值的益生菌菌株。可作为动物饲料添加剂用于畜禽养殖、宠物功能食品。

附图说明

图1为粪肠球菌A3-1培养物在显微镜下的镜检结果；其中，(a)奥林巴斯 CX31显微镜，放大倍数100×100；(b)为A3-1在MRS固体培养基上的生长状态；

图2为粪肠球菌A3-1与其他细菌的16s rRNA序列比对进化树分析；

图3为粪肠球菌A3-1在MRS培养基中的生长曲线分析；其中，(a)厌氧环境和好氧环境的生长能力比较；(b)不同pH条件下的生长能力比较；(c)不同胆盐浓度下的生长能力比较；(d)不同NaCl浓度下的生长能力比较；

图4粪肠球菌A3-1对Mucin-黏蛋白、Collagen-胶原蛋白、BSA-血清白蛋白的体外相对黏附力；

图5为细菌产生物膜能力检测结果；从左至右依次为粪肠球菌A3-1、鼠李糖杆菌Lactobacillus rhamnosus GG BL379参考菌株、阴性对照(每个样品均为3 个复孔)

图6为粪肠球菌A3-1在血平板上的生长情况；

图7为粪肠球菌产明胶酶实验；其中，(a)为菌株A3-1(明胶水解阴性)； (b)为空白对照(明胶未水解，下方试管)；粪肠球菌致病株C66(明胶水解阳性，上方试管)；

图8为大蜡螟的72h存活实验。

菌株保藏

益生性粪肠球菌分离株A3-1命名为Enterococcus faecalis A3-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址是中国武汉武昌珞珈山，保藏名称为Enterococcus faecalis A3-1，分类命名为Enterococcus faecalis,保藏号是CCTCC No：M2018498，保藏日期为为2018年7月25日。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

从健康婴幼儿粪便标本中分离出一株生长性能优良的兼性厌氧菌株A3-1， A3-1在MRS固体平板上单菌落呈圆形，白色不透明，边缘整齐光滑，直径约 0.6-0.9mm，如图1中(a)。革兰氏染色阳性，无荚膜、无芽孢，该菌的显微镜观察图片见图1中(b)。其16s rRNA序列进行PCR扩增，扩增片段测序后进行 NCBI数据库的细菌16s rRNA序列比对(序列号MH385351)，证实该分离株属于粪肠球菌，命名为粪肠球菌Enterococcus faecalis。菌株现保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No：M2018498。

1、分离株鉴定

提取A3-1总DNA，并以之为模板，扩增1.5kb 16S rRNA序列，16S rRNAPCR 引物为16S-F:5'AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG3'，16S-R:5‘GGT ACC T TG TTA CGA CTT3'。扩增程序为：94℃,4min,1个循环预变性；94℃变性，30sec， 58℃退火，30sec，72℃延伸，1min，30个循环；72℃7min。PCR扩增体系为 20μl PCR体系中分别加入10mM dNTP 1.6μl，10×Taq酶buffer 2μl，1nM PCR引物各1μl，G-14总DNA模板2-3ng，Taq DNA聚合酶0.2μl，以MiniQ水补足20μl。 PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证后，用PCR产物回收试剂盒回收，并送测序公司测序。测序结果与NCBI上公布的细菌16S rRNA序列比对。结果参见图 2所示。

2、抗逆性实验(耐酸、耐胆盐、耐NaCl实验)

将经MRS培养基37℃过夜培养的A3-1液体培养物离心收集细胞，无菌PBS 洗涤2次，测定OD₆₀₀。96孔板中加入200μLMRS培养基(分别调节pH至2.0、 3.0、4.0、5.0；0.5％、1％、2％、3％的胆盐；1.75％、3.5％、7％的NaCl)，每种培养基设3个重复，将A3-1以终浓度为OD₆₀₀＝0.1的浓度加入培养基，以 200μLMRS空白培养基含有OD₆₀₀＝0.1的A3-1为阴性对照。全自动酶标仪37°下连续20h测定细菌生长OD₆₀₀，每30min测定一次。

好氧培养：A3-1单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃摇床过夜培养。

厌氧培养：A3-1单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养箱静置过夜培养；在酶标板上培养时，每个孔加入培养基和菌体后，再覆盖无菌凡士林50μL。

实验结果：

1)耐受氧气

菌株A3-1在有无氧气的情况下均可生长，且在有氧培养时生长状态显著优于厌氧培养。在有氧时，该菌的最大OD₆₀₀可达到2.243，厌氧培养时仅为1.218。且在有氧培养时，该菌株生长速率高、稳定期长，如图3中(a)所示。

2)耐酸特性

在不同pH的MRS培养基中，菌株A3-1均可存活。

在有氧条件下，当pH＝5.0时，该菌的最大OD600可达到最适生长条件的70％(1.542vs 2.243)；在厌氧条件下，当pH＝5.0时，该菌的最大OD600可达到最适生长条件的87％(1.057vs 1.218)。参见图3中(b)，表明菌株A3-1对低pH 具有很好的耐受能力。

3)耐胆盐特性

在4种胆盐浓度的MRS培养基中，菌株A3-1的生长状态均非常好。

有氧条件下，在含有0.5％、1％、2％、3％胆盐的MRS培养基中，该菌的最大OD₆₀₀分别为2.21、2.414、2.2、2.166，相比与MRS培养基(2.243)，0.5％、2％、3％胆盐对A3-1的生长无影响，同时1％的胆盐对该菌的生长有特异的促进作用。

厌氧条件下，在含有1％、2％、3％胆盐的MRS培养基中，该菌的最大OD₆₀₀分别为1.542、0.7753、2.147，相比与MRS培养基(1.218)，1％、2％的胆盐对该菌的生长有特异的促进作用。

结果如图3中(c)所示，说明A3-1在胆碱耐受力上有非常突出的优势。

4)耐NaCl特性

在3种NaCl浓度的MRS培养基中，菌株A3-1的生长状态均非常好。

有氧条件下，1.75％、3.5％的NaCl可以促进A3-1的生长，其最大OD₆₀₀分别为2.635和2.508。当NaCl浓度达到7％时，其最大OD₆₀₀为1.997，和MRS 培养基(2.243)中的最大OD₆₀₀没有显著差异。

厌氧条件下，1.75％的NaCl可以促进A3-1的生长，其最大OD₆₀₀为1.370，相比与MRS培养基(1.218)，3.5％和7％的NaCl对其生长无影响，其最大OD₆₀₀分别为1.181和1.178。

结果如图3中(d)所示，说明A3-1在NaCl的耐受能力上也有非常突出的优势。

3、体外结合BSA、胶原蛋白、粘蛋白实验

黏附是益生菌与宿主肠道互相作用的第一步，也是发挥作用的重要前提。益生菌需要黏附于宿主肠道，才可以与肠道内的正常菌群一起构成生物屏障，影响外来致病菌的侵袭和定植。宿主肠道内，肠上皮细胞表面覆盖一层由糖蛋白类物质组成的粘液层，有胶原蛋白、黏蛋白等，可作为受体模型研究益生菌的黏附。

鼠李糖杆菌BL379是上世纪80年代，由两位美国科学家Gorbach和Goldin 从健康人的肠道中分离而得,并命名为鼠李糖乳杆菌LGG(Lactobacillus rhamnosus GG)。近年来，国外的科学家通过大量的动物实验和人体临床实验证明LGG能够耐受动物消化道环境，并能够在人和动物肠道内定植，起到调节肠道菌群、预防和治疗腹泻、排除毒素、预防龋齿和提高机体免疫力等作用。

实验方法：

96孔板(黑色)分别加入100μL/孔的黏蛋白溶液(500μg/ml)、胶原溶液 (50μg/ml)、BSA溶液(500μg/ml)，4℃过夜孵育，结束后用无菌PBS洗板2 次，室温晾干。

用DMSO配置5-(6-)-羧基荧光素二乙酸酯(cFDA)溶液母液，浓度为 3.5mg/ml。收集MRS液体培养基过夜培养的A3-1细胞，使用无菌PBS溶液调节 OD₆₀₀到0.25。每2ml细菌悬液加入20μL cFDA溶液，混匀后室温避光孵育1h，然后10000rpm离心5min，弃上清，无菌PBS洗涤荧光标记的菌体一次，再重悬于2mlPBS中。

将100μL cFDA标记的菌悬液/孔加入已经固定好底物的黑色96孔板，4℃避光过夜孵育，然后PBS洗涤反应孔3次，最后再加入100μLPBS/孔。将100μL cFDA 标记的菌悬液加入未固定底物的孔中做对照。使用酶标仪检测孔板的荧光强度，并按照公式分别计算A3-1对黏蛋白、胶原、BSA的黏附率：

黏附率％＝(黏附实验后的荧光强度)/(细菌原始的荧光强度)×100％

以鼠李糖杆菌Lactobacillus rhamnosus GG BL379为阳性对照，将其黏附率定位100％，计算A3-1相对于L.rhamnosus GG BL379的相对黏附力。

实验结果：

由图4可以看出，A3-1在好氧培养时对胶原蛋白、黏蛋白和白蛋白具有非常好的黏附力，其中对胶原蛋白的相对黏附力约为LGG的18倍。

4、生物膜形成实验

将经MRS培养基37°过夜培养的A3-1液体培养物离心收集细胞，无菌PBS 洗涤2次，调节细胞数至10⁸CFU/ml，将细菌悬液用MRS培养基稀释40倍，96 孔板中每孔加稀释后的菌悬液200μL，37℃孵育24h，小心移去游离的细菌，将 96孔板的孔用PBS洗涤3次，倒置沥干水分，每孔加入100μL 0.1％的结晶紫染液孵育45min。PBS洗孔2次，每孔加入200μL乙醇溶解结合的结晶紫，测定 OD₅₇₀吸光值。以不加A3-1菌悬液的空白样品作为阴性对照，OD_570样品>4倍的 OD_570对照为+++；4倍的OD_570对照>OD_570样品>2倍的OD_570对照为++；2倍的OD_570对照>OD_570样品。

实验结果：

黏附力的另一个表现是细菌代谢并生产生物膜的能力。参见图5，从左至右依次为粪肠球菌A3-1、鼠李糖杆菌Lactobacillus rhamnosus GG BL379参考菌株、阴性对照(每个样品均为3个复孔)。菌株A3-1生物膜检测OD₅₇₀＝2.255±0.029，阴性对照OD₅₇₀＝0.348±0.018，大于4倍的阴性对照值，体外产生物膜能力评价为+++。参考菌株LGG生物膜检测OD₅₇₀＝0.867±0.031，介于2倍和4倍的阴性对照值，体外产生物膜能力评价为++。肠球菌A3-1的黏附力高于鼠李糖乳杆菌 LGG。

5、抑菌实验

A3-1在MRS液体培养基中37℃通气培养16h，离心收集菌体，无菌PBS调节细胞OD₆₀₀至1.0/ml，冰上超声破碎细胞，4℃离心去掉沉淀，0.22μm滤膜过滤除菌，以之为A3-1的无细胞提取物进行体外抑菌实验，同时以A3-1的MRS 培养物的无菌发酵液上清作为对照。

采用牛津杯法测定A3-1菌株的抑菌活性，指示菌为大肠杆菌ATCC19433、金黄色葡萄球菌ATCC25923、蜡样芽孢杆菌CMCC63301、沙门氏菌cdc87、绿脓杆菌PA01、铜绿假单胞菌ATCC27853、阴沟肠杆菌ATCC700323。指示菌涂布营养琼脂平板，将牛津杯至入琼脂中，分别添加100μL、200μL的无细胞提取物和无菌发酵液上清，以无菌PBS作为空白对照，37℃培养24h后测定抑菌圈直径。

实验结果：

测试菌株的抑菌圈见表1，A3-1发酵液上清对革兰氏阴性细菌的抑菌能力显著低于革兰氏阳性细菌。

表1粪肠球菌A3-1发酵液上清的抑菌效果

*革兰氏阳性细菌使用四环素，革兰氏阴性细菌使用卡那霉素

6、安全性评价-药敏实验

采用Vitek32微生物分析仪及配套的药敏条对(GP67)所分离的粪肠球菌进行抗生素的耐药表型检测，包括苄青霉素、氨苄西林、高水平庆大霉素(协同作用)、高水平链霉素(协同作用)、环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、红霉素、氯林霉素(克林霉素)、喹奴普丁/达福普汀、利奈唑胺、万古霉素、四环素、替加环素和呋喃妥因15种临床常见抗生素。根据分析仪所获得的最低抑菌浓度 (MIC)与CLSI 2017数据库中判断文件比较，判别细菌对某种药物的敏感程度。

粪肠球菌A3-1的抗生素敏感性检测结果见表2，结果显示在15种检测的抗生素中，A3-1对9种抗生素敏感，分别是氨苄西林、苄青霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、利奈唑胺、万古霉素、替加环素和呋喃妥因；对6种抗生素呈耐药，分别为高水平庆大霉素(协同作用)、高水平链霉素(协同作用)、红霉素、克林霉素、奎奴普汀和四环素。以上结果说明该菌株的抗生素敏感性较好，安全性相对较高。

表2粪肠球菌A3-1的抗生素药敏检测结果(肉汤稀释法)

7、安全性评价-溶血定性和定量实验

粪肠球菌致病株可产生溶血素，也叫细胞溶素(cytolysin)，在宿主病损部位高表达时可破坏宿主细胞，引起相关疾病。

划线接种于血平板上，37℃培养24h，观察溶血环。

无菌脱纤维羊血4℃800g离心10min收集红细胞，预冷的无菌PBS轻柔洗涤，再离心再洗涤，重复3次。将经MRS培养基过夜培养的对数期A3-1调节 OD₆₀₀至1.0-1.5，并准备菌体悬液为3个稀释度1、1/2、1/4。每个反应依次加入 25μL红血球悬液、100μL不同稀释度的菌体悬液、850μL无菌PBS，轻柔混匀， 37℃孵育30min。每个稀释度做3个重复。反应结束后4℃5500rpm离心1min，取上清测定OD543。阳性对照：100μL 1％tritonX100+25μL红细胞悬液+850μL PBS，阴性对照：975μL PBS+25μL红细胞悬液。该菌的溶血定量(％)＝(样品 OD₅₄₃-阴性对照OD₅₄₃)/(阳性对照OD₅₄₃-阴性对照OD₅₄₃)。

实验结果：

参见图6，A3-1菌株在血平板上生长无明显的溶血，溶血活性定量结果显示，其相对溶血活性为4.57％，和婴儿双歧杆菌CICC6069的相对溶血活性(2.18％)无显著差异(P>0.05)。

8、安全性评价-产明胶酶实验(明胶水解实验)

有些细菌具有明胶酶(亦称类蛋白水解酶)，能将明胶先水解为多肽，又进一步将多肽水解为氨基酸，明胶失去凝胶性质，使培养基由固态变为液态。明胶酶是粪肠球菌致病株的一类重要的毒力因子。

将经MRS培养基过夜培养的待测A3-1，按1％接种量接种于明胶液体培养基中，于37℃培48h，静置于4℃冰箱1h，立即取出观察是否有液化现象，有明胶液化现象的为水解明胶阳性。

实验结果：

参见图7，菌株A3-1的明胶酶实验结果显示其明胶水解实验阴性，不产生明胶酶。

9、安全性评价-毒力实验

使用大蜡螟作为毒力测试对象。将经MRS培养基培养的进入稳定期的A3-1 液体培养物离心，无菌PBS洗涤2次去除菌体的培养基残留，将细菌重悬于无菌 PBS中。每个虫子腹腔注射10⁶、10⁷、10⁸CFU的细菌(不超过20μL)，每组20 只，对照组注射等体积的无菌PBS。将注射后的大蜡螟置于37度培养箱中，连续观察72h，记录每组虫子其黑化与死亡情况。以婴儿双歧杆菌ATCC15697和屎肠球菌ATCC29212为对照菌株。

实验结果：

经过连续3天的观察，注射MRS空白培养基和生理盐水的对照组虫子100％存活，粪肠球菌ATCC29212的10⁶CFU、10⁷CFU、10⁸CFU注射组存活率分别是 100％、90％、0％；双歧杆菌ATCC15697的10⁶CFU、10⁷CFU、10⁸CFU注射组存活率分别是100％、80％、80％；粪肠球菌分离株A3-1的10⁶CFU、10⁷CFU、 10⁸CFU注射组存活率分别是100％、100％、80％。72h存活力曲线见图8。结果表明A3-1对大蜡螟的毒性和婴儿双歧杆菌CICC6069相当，另外在10⁸CFU注射时其毒性低于婴儿双歧杆菌CICC6069。

10、安全性评价-毒力因子相关基因的PCR检测

采用PCR方法对粪肠球菌常见的9种毒力因子相关基因进行检测，PCR引物见下表3。扩增程序为：94℃,4min,1个循环预变性；94℃变性，30sec，58℃-48℃退火，30sec，72℃延伸，30sec，35个循环；72℃7min。PCR扩增体系为20μl PCR 体系中分别加入10mM dNTP1.6μl，10×Taq酶buffer 2μl，1nM PCR引物各1μl， G-14总DNA模板2-3ng，Taq DNA聚合酶0.2μl，以MiniQ水补足20μl。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

表3毒力因子的引物序列表

实验结果：

毒力因子包括聚集物质asa1、表面蛋白esp、溶细胞素cylA、透明质酸酶hylfm、心内膜炎抗原efaAfm和明胶酶gelE检测均为阴性。证明粪肠球菌A3-1分离株生长条件不严苛，抗逆性优良，无毒、无害、安全性较好；同时该菌株可黏附于宿主消化道黏膜，具有维持肠道物理屏障、促进肠道上皮细胞的损伤修复作用，可调节肠道微生物区系平衡，促进肠道固有菌定植，有效抑制病原菌的繁殖，促进宿主健康，增强宿主对不良环境的抵抗力是一株具有开发价值的益生菌菌株。可作为动物饲料添加剂用于畜禽养殖、宠物功能食品。

本发明的粪肠球菌A3-1全发酵物具有明显的抗逆性、抗辐射、增强免疫力、抗肿瘤活性，可用于保健食品、食品添加剂、化妆品、饲料添加剂、兽药等。

可对粪肠球菌A3-1菌株进行分子生物学改造，在原有基础上进一步提高代谢能力，经规模发酵，用于保健食品原料、食品添加剂、饲料添加剂、防辐射化妆品、兽药注射剂、免疫佐剂等。

开发新型微生态制剂产品，也可与其他活性物质(多糖类、多酚类等)协同作用，获得复合活性添加物。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (9)

1.一株益生性粪肠球菌分离株A3-1，其特征在于，该益生性粪肠球菌分离株A3-1命名为Enterococcus faecalis A3-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCCNo：M2018498，保藏日期为2018年7月25日。

2.权利要求1所述的益生性粪肠球菌分离株A3-1在制备致病菌抑菌剂中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述致病菌为革兰氏阴性致病菌。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阴性致病菌包括大肠杆菌ATCC19433、沙门氏菌cdc87、绿脓杆菌PA01、铜绿假单胞菌ATCC27853和阴沟肠杆菌ATCC700323。

5.权利要求1所述的益生性粪肠球菌分离株A3-1在制备饲料添加剂、食品添加剂、保健食品、宠物功能食品或兽药中的应用。

6.权利要求1所述的益生性粪肠球菌分离株A3-1在制备抗辐射化妆品或免疫佐剂的应用。

7.权利要求1所述的益生性粪肠球菌分离株A3-1在制备微生态制剂中的应用。

8.一种微生态制剂，其特征在于，所述微生态制剂中含有权利要求1所述的益生性粪肠球菌分离株A3-1。

9.如权利要求8所述的微生态制剂，其特征在于，所述微生态制剂中还包括多糖类活性物质或多酚类活性物质。