CN114107135A - 一种治疗结肠炎的粪肠球菌 - Google Patents

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CN114107135A CN202111582767.6A CN202111582767A CN114107135A CN 114107135 A CN114107135 A CN 114107135A CN 202111582767 A CN202111582767 A CN 202111582767A CN 114107135 A CN114107135 A CN 114107135A
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Abstract

本发明提供一株粪肠球菌，保藏号为CCTCC NO：M 20211156，保藏日期为2021年9月10日，保藏于中国典型培养物保藏中心。本发明提供的粪肠球菌CCTCC NO：M 20211156耐胃肠液耐受性较好，特别对人工肠液pH6.8耐受性较好。在不同浓度1％‑4％牛胆粉培养基中可正常生长，对牛胆盐具备一定的耐受程度，且可正常生长繁殖。并可以降低细胞炎症因子的表达量。

Description

一种治疗结肠炎的粪肠球菌
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种治疗结肠炎的粪肠球菌。
背景技术
炎症性肠病(Inflammatory bowel diseases，IBD)是一种尚不明原因的慢性且反复性发作的胃肠道炎症性疾病，近年来在世界范围内的发病率逐渐上升。IBD的病因和发病机制，目前尚不十分清楚，多数研究认为的发病涉及遗传因素、感染因素和肠道免疫功能异常等机制。由于的发病部位在结肠、直肠、回肠等肠道接触细菌最多的部位，很多学者推测肠道内的细菌可能参与了的发病。有报道，患者肠道菌群失调，肠道菌群中，双歧杆菌、乳酸杆菌等细菌数量明显减少，致病菌、条件致病菌的数量剧增，这些致病菌能损伤肠上皮细胞、破坏肠粘膜屏障、诱发异常的肠粘膜免疫反应。正常人肠道粘膜固有层单个核细胞，对自身肠道内细菌存在耐受，而患者肠道对失调的菌群失去耐受，触发并放大肠粘膜异常免疫反应，加重肠道组织损伤。许多动物实验也证实，肠道菌群参与了实验性结肠炎的发病。
粪肠球菌也属于人体正常肠道菌群，粪肠球菌一般对动物或人的机体无害，是一种共生菌，而关于该菌属在对炎症性肠疾病应用目前及少见有报道。
中国专利202110021092.1中公开了一种屎肠球菌YQH2，还公开了所述的屎肠球菌YQH2或所述的益生菌制剂在制备修复肠道损伤或增强肠道免疫中的应用、在制备抑制鼠伤寒沙门氏菌感染药物中的应用。屎肠球菌YQH2可改善沙门氏菌感染变浅的隐窝深度和炎症因子水平的增加，刺激肠黏膜上皮细胞的增殖，具有维护肠黏膜屏障的潜能。但该菌株为鸡源性，用于改善鼠伤寒沙门氏菌引起的家禽肠炎，对于实际应用于人有一定的限制。
丰富用于人体炎症性肠疾病粪肠球菌种质库十分必要。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种能够有效预防和治疗保护炎症性肠病的益生菌菌株。
一方面，本发明提供了一种粪肠球菌。
所述的粪肠球菌的16S rRNA序列为SEQ ID NO.1或与SEQ ID NO.1具有99.93％以上同一性的序列。
所述的粪肠球菌为肠球菌属，保藏号为CCTCC NO：M 20211156，保藏日期为2021年9月10日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
另一方面，本发明提供了粪肠球菌在制备用于炎症性疾病、免疫失调和/或肠失调的病症的药物中的应用。
所述的粪肠球菌为前述的粪肠球菌。
所述的粪肠球菌制备应用于结肠炎的药物；所述的结肠炎由细菌、真菌、病毒、寄生虫、原虫等生物引起，或由变态反应及理化因子引起。
所述的结肠炎包括特异性炎性病变和非特异性炎性病变。
所述的特异性炎性病变包括感染性结肠炎、缺血性结肠炎和伪膜性结肠炎。
所述的非特异性炎性病变包括溃疡性结肠炎及结肠Crohn病。
所述的粪肠球菌应用时为粪肠球菌的活菌、死菌、细胞破碎物、发酵上清液、发酵沉淀、改造菌、突变菌和/或诱变菌。
所述的粪肠球菌发酵液由前述的粪肠球菌接种于培养基中培养得到。
再一方面，本发明提供了一种用于前述应用的制剂。
所述的制剂由前述的粪肠球菌制备得到；
或者由前述的粪肠球菌发酵液制备得到。
所述的制剂中可以包括前述的粪肠球菌的活菌、死菌、细胞破碎物、发酵上清液、改造菌、突变菌、诱变菌中的一种或多种。
优选地，所述的制剂为液体制剂，所述的制剂中的粪肠球菌的含量为1×108-1×1010CFU/mL。
进一步优选地，所述的制剂中的粪肠球菌的含量为1×109CFU/mL。
优选地，所述的制剂为固体或半固体制剂，所述的制剂中粪肠球菌的含量为1×108-1×1010CFU/g。
进一步优选地，所述的制剂中粪肠球菌的含量为1×109CFU/g。
优选地，所述的制剂为冻干粉。
又一方面，本发明提供了前述的粪肠球菌的培养方法。
所述的培养方法包括以下步骤：
S1、接种粪肠球菌CCTCC NO：M 20211156；
S2、条件培养。
所述的条件培养包括但不限于：厌氧培养、好氧培养、兼性厌氧培养。
又一方面，本发明提供了一种用于前述应用的药物。
所述的药物中包括前述的粪肠球菌和/或其制备物。
优选地，所述的药物为液体药物，所述的药物中包括前述的粪肠球菌的活菌，所述的粪肠球菌的含量为1×108-1×1010CFU/mL。
进一步优选地，所述的药物中粪肠球菌的含量为1×109CFU/mL。
优选地，所述的药物为固体或半固体药物，所述的药物中粪肠球菌的含量为1×108-1×1010CFU/g。
进一步优选地，所述的药物中粪肠球菌的含量为1×109CFU/g。
又一方面，本发明提供了一种用于预防或治疗结肠炎的药物的制备方法。
所述的制备方法包括前述的粪肠球菌的培养方法。
又一方面，本发明提供了前述的粪肠球菌在制备用于维持肠道菌群平衡的饲料、食品产品、膳食补充剂、营养补充剂或食品添加剂中的应用。
又一方面，本发明提供了用于前述应用的饲料、食品产品、膳食补充剂、营养补充剂或食品添加剂。
所述的饲料、食品产品、膳食补充剂、营养补充剂或食品添加剂中包括前述的粪肠球菌。
本发明的有益效果：
本发明提供的粪肠球菌CCTCC NO：M 20211156耐胃肠液耐受性较好，特别对人工肠液pH6.8耐受性较好。在不同浓度1％-4％牛胆粉培养基中可正常生长，对牛胆盐具备一定的耐受程度，且可正常生长繁殖。可以降低细胞炎症因子的表达量。
保藏说明
保藏地址：中国，武汉，武汉大学；
保藏日期：2021年09月25日；
菌种名称：粪肠球菌PRS-05；
拉丁名：Enterococcus faecalis；
菌株编号：PRS-05；
保藏机构：中国典型培养物保藏中心；
保藏机构简称：CCTCC；
保藏中心登记入册编号：CCTCC NO：M 20211156；
附图说明
图1为MRS培养粪肠球菌CCTCC NO：M 20211156 48h菌落形态图。
图2为粪肠球菌CCTCC NO：M 20211156革兰氏染色镜检图。
图3为粪肠球菌CCTCC NO：M 20211156生理生化鉴定测试显色卡的生化图谱。
图4为粪肠球菌CCTCC NO：M 20211156生理生化鉴定软件鉴定结果。
图5为粪肠球菌CCTCC NO：M 20211156相关系统进化树。
图6为体外药效实验中细胞培养后IL-6细胞因子的表达量。
图7为动物实验中小鼠体重变化。
图8为动物实验中空白对照组小鼠结肠长度和重量记录。
图9为动物实验中DSS模型组小鼠结肠长度和重量记录。
图10为动物实验中阳性药(阿达木单抗)组小鼠结肠长度和重量记录。
图11为动物实验中PRS-217-05实验组小鼠结肠长度和重量记录。
图12为动物实验中平均结肠重量数据和平均结肠长度数据。
图13为动物实验中疾病活跃指数DAI评分结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例中部分产品来源信息如下：
MRS：肉汤培养基，购自青岛海博生物科技有限公司，货号：HB0384-1；
哥伦比亚琼脂血平板，购自科玛嘉，货号：20210719-L；
琼脂粉购自北京索莱宝科技有限公司，货号：A8190-500g；
革兰氏染色液购自珠海贝索生物技术有限公司，货号：BA-4012；
生理生化鉴定试剂盒使用API20Strep，货号：1008590710；
2×EasyTaq PCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司，货号：AS111-11；
琼脂糖品牌：北京索莱宝，货号：91622；
Trans2K DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司，货号：BM101-01；
抗菌药物药敏纸片30种购自杭州微生物试剂有限公司，货号：S1100；
MTT试剂购自北京索莱宝，货号：M8180-250；
胃蛋白酶1：3000购自北京索莱宝，货号：T8150-10g；
胰蛋白酶1：250购自北京索莱宝，货号：P8390-25g；
RAW264.7细胞系供货商：FuHeng，货号：FH0328；
DMEM高糖培养基购自FuHeng，货号：FHD01；FBS供货商SEOU，货号C100-900；
LPS供货商：北京索莱宝，货号：SMB00610；
小鼠IL-6ELISA试剂盒供货商：联科生物，货号：70-EK206/3-96；
正置显微镜购自宁波永新光学股份有限公司，型号：N-117M；
PCR仪购自珠海黑马医学仪器有限公司，型号：Hema9600。
实施例中部分简写含义如下：
p.o.：灌胃给药；
IP：腹腔注射；
QD×9Day：每天给药一次，连续给药9天；
RT：室温；
BW：体重；
BWL：体重下降；
SOC：标准化治疗；
N/A：不适用；
SD：标准偏差；
DSS：葡聚糖硫酸钠；
SEM：标准误差。
实施例1粪肠球菌分离及鉴定
(1)菌株分离及测序
在无菌条件下，制备好的YK-20210225供体粪便菌液进行10倍梯度稀释，选取三个浓度梯度，划线接种于NA及MRS培养基上，三个重复平板，置37℃恒温培养箱中厌氧培养72h，随后挑取不同形态的菌落进行革兰氏染色镜检，并于MRS培养基中进行2次划线纯化，再染色镜检，观察细菌形态及是否纯化，再进行16S rRNA测序，使用的为通用引物，其中正向引物为27F，序列如SEQ ID NO.2所示；反向引物为1429R，序列如SEQ ID NO.3所示。
PCR反应体系如下：
Premix Taq 25μL
上下游引物(浓度为100pmol/μL) 各1μL
DD H<sub>2</sub>O 19μL
模板(菌液，浓度OD<sub>600</sub>＝1.0) 1μL
PCR反应条件如下：
Figure BDA0003427510920000061
扩增得到的PCR产物进行16S rRNA测序，在NCBI进行序列比对。
测序结果如SEQ ID NO.1所示。
(2)生理生化鉴定
取一支冻存管，取50μL菌液加入到MRS固体培养基中用无菌接菌环划线，37℃恒温24h，随后挑取单个菌落，接种于哥伦比亚血平板中，37℃培养16h，在无菌条件下挑取单菌落接种于链球菌微量生化鉴定管(API 20Strep，批号1008590710)中，于37℃恒温培养24h，记录结果。
(3)全基因组序列测定及遗传进化树的构建
对全基因组测序结果进行BLAST比对，构建系统进化树。
(4)毒力基因和耐药基因分析
基因组中潜在的抗生素耐药基因使用prokka 1.14.6使用默认参数rgi(版本:v5.1.1)流程分析，其中抗生素耐药基因数据库为CARD，版本：v3.1.3。
对基因组中潜在的毒力基因及相关基因的分析采用的是NCBI BLASTP(版本:v2.10.1)，比对毒力因子VFDB setA数据库(更新于2019.7)。
(5)耐药性检测
采用药敏纸片扩散法进行，将MRS液体培养基培养好的菌液，进行4000rpm离心15min，去掉上清液，用PBS进行悬浮，吹打均匀，将OD值调整为0.6左右，均匀涂布于MRS固体培养皿中，待菌液完全吸收后，放置药敏纸片，一块平板放置一种药敏纸片(3片)和空白对照(1片)，倒置培养于37℃培养箱，24h用直尺测量抑菌环直径，记录数据，参照纸片法抗菌药物试验标准(WS/T125—1999)判读结果。
(6)代谢产物分析
取培养至对数生长晚期的本株粪肠球菌菌液0.5mL，加入到40mL MRS培养基中，分别培养三管，培养24h，将菌液按6000rpm/分钟离心10分钟，各收集30mL上清液。委托苏州百拓生物技术服务有限公司进行上清液中代谢产物分析。
结果：
(1)MRS培养48h菌落形态图如图1所示。
革兰氏染色镜检图如图2所示。
(2)生理生化鉴定结果如图3-4所示，表明该菌为粪肠球菌，部分数据如下表：
Figure BDA0003427510920000071
Figure BDA0003427510920000081
(3)基因组信息：基因组大小2.7M；与粪肠球菌参考基因组的ANI(平均核苷酸同一性)为98.88％；无质粒。
系统进化树如图5所示。
(4)毒力基因及抗性基因图：
毒力基因：组装好的基因组使用prokka进行基因预测，预测的基因使用blastp比对到VFDB数据库，使用E-value<＝0.00001对结果进行过滤，得到毒力因子注释：(详情见下表)
菌株基因 VFDB基因 比对一致性％ 基因名称
orf_00019 VFG042976(gb|NP_814821) 99.728 ebpA
orf_00020 VFG042977(gb|NP_814822) 99.301 ebpB
orf_00021 VFG042978(gb|NP_814823) 99.628 ebpC
orf_00022 VFG042979(gb|NP_814824) 98.935 srtC
orf_00027 VFG002166(gb|NP_814829) 100 ace
orf_00644 VFG002191(gb|NP_815515) 98.48 sprE
orf_00645 VFG002174(gb|NP_815516) 98.758 gelE
orf_00646 VFG002192(gb|NP_815517) 99.554 fsrC
orf_00647 VFG002193(gb|NP_815518) 99.04 fsrB
orf_00648 VFG002194(gb|NP_815519) 99.454 fsrA
orf_00736 VFG002196(gb|NP_816637) 97.436 EF3023
orf_01086 VFG043508(gb|NP_813892) 98.189 fss1
orf_01311 VFG043509(gb|NP_816151) 94.104 fss2
orf_01320 VFG002190(gb|NP_816141) 99.142 cpsA
orf_01321 VFG002189(gb|NP_816140) 99.126 cpsB
orf_01824 VFG002165(gb|NP_815739) 99.784 efaA
orf_01969 VFG002197(gb|NP_814691) 99.308 bopD
抗性基因：组装好的基因组使用prokka进行基因预测，预测的基因使用RGI软件进行抗性基因注释：
Figure BDA0003427510920000091
(5)耐药性检测结果：
Figure BDA0003427510920000092
备注：S＝敏感，I＝中介，R＝耐药，/为无抑菌圈
(6)代谢产物分析结果：
Figure BDA0003427510920000101
实施例2耐人工胃肠液检测及耐胆盐检测
(1)MTT溶液配制：称0.5g，加入100mL PBS溶解(最终浓度为5mg/mL)，过滤除菌，分装于15mL离心管中，-20℃冻存备用，有效期半年。
(2)模拟胃液(SimulatedGastricFluid，SGF)实验
1、取2.0g NaCl和3.2g胃蛋白酶(索莱宝胃蛋白酶，1:3000，标识为每mg中含800-2500个活度单位)，加7.0mL 37％稀盐酸和水使溶解至1000mL，即得，该溶液pH值为1.2；
2、调pH分别至pH1.2(模拟人空腹肠液pH)、pH2.0、pH3.0(模拟人饭后肠液pH及小鼠空腹肠液pH)和pH4.0，过滤除菌；
3、集菌：菌株37℃、静止培养8h，达到对数生长期，将菌液分装于50mL无菌EP管，进行4000rpm，室温、离心15min后，弃上清，用PBS重悬菌体，并调取菌液OD600值，得到细菌数约为2×109CFU/mL，随后取17个15mL无菌EP管，分别加入调好OD值的6mL菌液，进行离心(条件同上)，16个离心管(实验组)去除PBS，收集菌沉淀待用，1个吹打重悬(对照组)；
4、人工胃液培养：将上述不同pH的人工胃液各6mL分别加入至洗涤后收集菌沉淀的16个15mL离心管中，并吹打混匀，分别孵育培养1h、2h和3h；
5、MTT检测：先对照组菌液、孵育不同pH不同时间的菌液分别取3mL于新的离心管中，并分别加入1mL MTT试剂进行孵育过夜(这一步可将菌液通过3500rpm，8min离心，去掉上清液人工胃液，再加入MTT试剂，MTT试剂可降低至500μL，且孵育时间也可缩短)，孵育过后，再进行离心处理(3500rpm，8min)，去掉上清液，加入600μL DMSO，吹打溶解后，分别加入深孔板中，而后用排枪转移至96孔无菌培养板中，每孔加入150μL(并标记清楚每孔加样顺序和名称)，然后用酶标仪进行检测，选取波长570nm或570nm/630nm的OD值，获取吸光值，推算出活细菌的比例，并保存原始数据；
6、进行数据处理，计算对应的存活率，其中细菌存活率＝实验组OD值/对照组OD值×100％，得到菌株模拟人工胃液作用不同时间后的耐受程度。
(3)模拟肠液Simulated Intestinal Fluid(SIF)实验
1、取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶1g(索莱宝胰蛋白酶，1:250)，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释至1000mL，过滤除菌；
2、集菌方法同上模拟胃液(SimulatedGastricFluid，SGF)实验；
3、人工肠液培养：将上述pH6.8的人工肠液分别加入8mL至洗涤后收集的菌沉淀4个15mL离心管中，并吹打混匀，孵育培养0h、1h、2h和3h；
4、MTT检测：同上模拟胃液(SimulatedGastricFluid，SGF)实验；
5、进行数据处理，计算对应的存活率，其中细菌存活率＝实验组OD值/对照组OD值×100％，得到菌株模拟人工肠液作用不同时间后的耐受程度。
(4)模拟人体内胆盐环境实验
1、胆汁配制：在目标菌培养基(MRS或BHI等)溶液中加入牛胆粉(购自合肥巴斯夫生物科技有限公司，货号：N0101-100g)，设置三个终浓度，分别为10g/L(1％牛胆粉)、20g/L(2％牛胆粉)和40g/L(4％牛胆粉)，高压灭菌后备用，同时，以不加胆粉的培养基溶液0h作为对照；
2、菌株收集同上；
3、牛胆粉培养：将配置含有0％、1％、2％和4％牛胆粉的MRS或BHI培养基分别加入10mL至洗涤后收集的菌沉淀20个15mL离心管中进行孵育培养0h、1h、2h、3h和4h，以0％牛胆粉培养基溶液0h作为对照组；
4、倾注培养：同上模拟胃液(SimulatedGastricFluid，SGF)实验；
5、计算细菌耐受胃酸情况：进行平板计数，记录各平板菌落数，进行数据处理，得到菌株对牛胆盐的耐受程度。
耐人工胃肠液检测结果：
Figure BDA0003427510920000111
Figure BDA0003427510920000121
PRS-217-05菌株耐胃肠液耐受性较好，耐pH3.0孵育3h耐受程度一般，对pH4.0耐受性良好，对低pH1.2-2.0存活率基本为0，对人工肠液pH6.8耐受性较好。
耐胆盐检测结果：
Figure BDA0003427510920000122
Figure BDA0003427510920000131
从数据结果可知PRS-217-05菌株在不同浓度1％-4％牛胆粉培养基中可正常生长，且随着孵育培养的时间增加，其活菌数并未降低，有反而出现活菌数稍稍增加的现象，说明该菌株对牛胆盐具备一定的耐受程度，且可正常生长繁殖。
实施例3体外药效实验
LPS母液配置：用DMEM进行溶解，配置得到1mg/mL母液，储存于-20℃冰箱。
实验操作：RAW264.7细胞培养(DMEM高糖培养基+10％FBS，37℃+5％CO2进行培养)，将培养状态较好的细胞，用培养基将贴壁的细胞吹打下来(吹打不下来的丢弃即可)，吹打均匀，并进行细胞计数，稀释得到一定浓度的细胞培养液(DMEM+10％FBS)，接种于24孔细胞培养板中，每孔细胞数量约2×106个/孔，接种量250μL。孵育培养16h后，设置空白对照组、LPS(1μg/mL)、LPS(1μg/mL)+PRS-217-05菌10％培养上清液(即菌株经过MRS液体培养基培养24h，高速离心处理得到菌培养上清液，上清液经过过滤除菌处理得到100％原液，再用DMEM稀释成最终浓度为10％的培养上清液)和LPS(1μg/mL)+PRS-217-05菌30％培养上清液，进行给药处理3h，收集细胞上清液，用ELISA试剂盒进行检测IL-6细胞因子的表达。
实验结果：IL-6细胞因子的表达量如图6所示。
实施例4动物实验
实验动物：ICR雄性小鼠，周龄6-8周，体重30-35g，供应商为常州卡文斯实验动物有限公司。
实验动物均饲养于恒温恒湿的独立通风盒内，并且提前适应环境至少7天，饲养室温度20-26℃，湿度40-70％，10-20次/小时换气，昼夜明暗交替，早上七点到晚上七点光照，晚上七点到次日早上七点黑暗；持续供给钴60放射灭菌鼠全价颗粒饲料，不限量自由摄取，饮用自来水(高压蒸汽灭菌后使用)，饮水瓶不间断供水，自由摄取。饲养鼠盒是聚砜鼠盒，高压灭菌后使用，规格为325mm×210mm×180mm；垫料是高压灭菌玉米芯，每盒5只动物，笼卡上标明IACUC批准号、实验编号、实验开始时间、课题负责人、实验人员、动物来源、组别和动物号等；实验动物打耳号进行标记。
造模剂DSS供货商：YESEN，货号：60316ES60，批号：D4125030。
阿达木单抗供货商：Sigma，货号：MSQC16。
适应性喂养ICR雄性小鼠7天，饲养期间自由饮水饮食。称重后将小鼠随机分组，包括正常对照组、DSS模型组、试验药物组、阳性对照药阿达木单抗组。采用DSS造模。该模型症状表现与人类UC(Ulcerative Colitis，溃疡性结肠炎)极为相似，主要表现为腹泻、黏液样便、粪便潜血、肉眼血便、重量减轻、活动度减少，毛色变差等。造模给药方式如下，造模给药当天记为Day0：
Figure BDA0003427510920000141
注：Day1：称重并标记各组小鼠。待造模小鼠饮用4％DSS水溶液，未处理组小鼠饮用正常水；Day3：给予待造模小鼠更换新鲜4％DSS饮用水；Day5：给予待造模小鼠更换新鲜4％DSS饮用水；Day6：给予待造模小鼠更换新鲜不含DSS的饮用水。
造模完成后24小时开始实验给药，实验给药方式如下：
Figure BDA0003427510920000142
注：n＝动物只数。
疾病活跃指数评分(Disease Activity Index,DAI score)：
从三个方面对实验小鼠进行评估打分，分别为体重、粪便粘稠度、粪便潜血、饮水量并收集造模前、给药前、解剖时粪便等指标，评分细则见下表：
评分 体重下降百分比 粪便粘稠度 粪便潜血
0 0 正常 阴性
1 1-5％ 软便 浅蓝
2 5-10％ 黏液样便 蓝色
3 10-20％ 稀液状便 深蓝
4 ＞20％ 肉眼血便
其中，粪便潜血测试可使用尿粪隐血检测试剂盒(联苯胺法)。结肠炎疾病活动指数(disease activity index，DAI)评分为上述三种情况进行综合评分，将3项结果的总分除以3即得到结肠炎DAI值，即结肠炎DAI＝(体重下降百分率得分+粪便形态得分+粪便潜血情况得分)/3。体重、粪便和隐血评分每天一次。第11天不给药直接处死小鼠，并取结肠测量长度和重量。
药物溶液配制方法：
化合物溶液的配制在生物安全柜或超净工作台中进行，现配现用，配制方式如下表所示：
Figure BDA0003427510920000151
使用前混匀，确保制剂是均一的。
实验结果：
(1)图7表示对照组、DSS模型组、阳性对照组(阿达木单抗)和实验组PRS-217-05(即粪肠球菌CCTCC NO：M 20211156组)对小鼠体重影响结果图，从图中可见DSS模型组小鼠体重与对照组体重具有显著性差异，阳性对照组对小鼠的体重基本没有影响，实验组PRS-217-05与阳性对照组(阿达木单抗)比较，在给药第11天小鼠体重有一定的差异性，对小鼠体重有一定的影响，但是在给药第14天小鼠体重又有较大恢复，说明该菌干预DSS诱导对小鼠体重没有显著的影响。
(2)图8-11给出了对照组、DSS模型组、阳性对照组(阿达木单抗)和实验组PRS-217-05对结肠长度影响的标本图，图8为对照组(结肠长度平均值为12cm)；图9为DSS模型组(结肠长度平均值为10.4cm)；图10阳性对照组(结肠长度平均值为12cm)；图11为实验组PRS-217-05(即粪肠球菌CCTCCNO：M 20211156组，结肠长度平均值为10.8cm)。
(3)小鼠结肠重量和长度如图12所示，其中A图表示DSS诱导的小鼠结肠炎模型小鼠结肠重量结果图，B图表示DSS诱导的小鼠结肠炎模型小鼠结肠长度统计柱形图。从图8-12可得到阳性对照组(阿达木单抗)给药后，其小鼠模型的结肠长度明显长于DSS模型组(长于1.6cm)，而实验组PRS-217-05与阳性对照组相比，药效较差，但与DSS模型组比较，其小鼠结肠长度长于0.4cm，具有一定的药效，即对结肠炎有一定的抑制作用。
(4)图13为疾病活跃指数DAI评分结果图，实验组与阳性对照组比较，阳性对照组小鼠DAI指数明显更低，实验组DAI指数更高，但与DSS模型组比较，实验组小鼠DAI指数更低，也具有显著性差异。
序列表
<110> 苏州普瑞森生物科技有限公司
<120> 一种治疗结肠炎的粪肠球菌
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
nnncnnngnc gggngctata catgcagtcg aacgcttctt tcctcccgag tgcttgcact 60
caattggaaa gaggagtggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctac ccatcagagg 120
gggataacac ttggaaacag gtgctaatac cgcataacag tttatgccgc atggcataag 180
agtgaaaggc gctttcgggt gtcgctgatg gatggacccg cggtgcatta gctagttggt 240
gaggtaacgg ctcaccaagg ccacgatgca tagccgacct gagagggtga tcggccacac 300
tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttcggcaatg 360
gacgaaagtc tgaccgagca acgccgcgtg agtgaagaag gttttcggat cgtaaaactc 420
tgttgttaga gaagaacaag gacgttagta actgaacgtc ccctgacggt atctaaccag 480
aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc 540
ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcaggc ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccccg 600
gctcaaccgg ggagggtcat tggaaactgg gagacttgag tgcagaagag gagagtggaa 660
ttccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagata tatggaggaa caccagtggc gaaggcggct 720
ctctggtctg taactgacgc tgaggctcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc 780
ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttgg agggtttccg cccttcagtg 840
ctgcagcaaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacga ccgcaaggtt gaaactcaaa 900
ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa 960
gaaccttacc aggtcttgac atcctttgac cactctagag atagagcttt cccttcgggg 1020
acaaagtgac agggggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 1080
cccgcaacga gcgcaaccct tattgttagt tgccatcatt tagttgggca ctctagcgag 1140
actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga 1200
cctgggctac acacgtgcta caatgggaag tacaacgagt cgctagaccg cgaggtcatg 1260
caaatctctt aaagcttctc tcagttcgga ttgcaggctg caactcgcct gcatgaagcc 1320
ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcacgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca 1380
caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt cggtgaggta acctttttgg 1440
agccagccgc ataanntgan nnagnng 1467
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (10)

1.一种粪肠球菌，其特征在于，其16S rRNA序列为SEQ ID NO.1或与SEQ ID NO.1具有99.93％以上同一性的序列。
2.根据权利要求1所述的粪肠球菌，其特征在于，保藏号为CCTCC NO：M 20211156，保藏日期为2021年9月10日，保藏于中国典型培养物保藏中心。
3.粪肠球菌在制备用于炎症性疾病、免疫失调和/或肠失调的病症的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的粪肠球菌为权利要求1或2所述的粪肠球菌；优选地，所述的粪肠球菌应用于制备治疗结肠炎的药物；优选地，所述的结肠炎由细菌、真菌、病毒、寄生虫、原虫等生物引起，或由变态反应及理化因子引起；更优选地，所述的结肠炎包括特异性炎性病变和非特异性炎性病变，所述的特异性炎性病变包括感染性结肠炎、缺血性结肠炎和伪膜性结肠炎；更优选地，所述的非特异性炎性病变包括溃疡性结肠炎及结肠Crohn病。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述的粪肠球菌应用时为粪肠球菌的活菌、死菌、细胞破碎物、发酵液、发酵上清液、发酵沉淀、改造菌、突变菌和/或诱变菌。
6.一种用于权利要求3-5任一项应用的制剂，其特征在于，所述的制剂由权利要求1或权利要求2所述的粪肠球菌制备得到；优选地，所述的制剂为液体制剂，所述的制剂中的粪肠球菌的含量为1×108-1×1010CFU/mL；优选地，所述的制剂为固体或半固体制剂，所述的制剂中粪肠球菌的含量为1×108-1×1010CFU/g；更优选地，所述的制剂为冻干粉。
7.权利要求1或2所述的粪肠球菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、接种粪肠球菌CCTCC NO：M 20211156；
S2、条件培养。
8.一种用于权利要求3-5任一项所述的应用的药物，其特征在于，包括权利要求1或2所述的粪肠球菌或其制备物。
9.权利要求1或权利要求2所述的粪肠球菌在制备用于维持肠道菌群平衡的饲料、食品产品、膳食补充剂、营养补充剂或食品添加剂中的应用。
10.一种用于权利要求9所述的应用的饲料、食品产品、膳食补充剂、营养补充剂或食品添加剂，其特征在于，包括权利要求1或权利要求2所述的粪肠球菌或其制备物。
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