CN106167785A - 一种粪肠球菌菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种粪肠球菌菌株及其应用。本发明提供一种粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CTB，其保藏编号为CGMCC 12734。本发明还保护粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CTB在生产乙醇和L‑乳酸中的应用。本发明还保护一种生产乙醇的方法和一种生产L‑乳酸的方法。本发明提供的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CTB可以利用廉价原料玉米秸秆、沙柳和生物柴油行业副产物甘油等直接生产L‑乳酸和乙醇，降低了原料成本，减少原料预处理成本。本发明为大宗化学品L‑乳酸和乙醇的廉价生产、青贮饲料和微生物饲料的开发和生产提供了优良菌种。

Description

一种粪肠球菌菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一种粪肠球菌菌株及其应用。
背景技术
粪肠球菌(Enterococcus faecalis)是革兰氏阳性，过氧化氢阴性球菌，是人和动物肠道内主要菌群之一，其能产生天然抗生素，有利于机体健康；同时还能产生细菌素等抑菌物质，抑制大肠杆菌和沙门氏菌等病原菌的生长，改善肠道微环境；还能抑制肠道内产尿素酶细菌和腐败菌的繁殖，减少肠道尿素酶和内毒素的含量，使血液中氨和内毒素的含量下降。粪肠球菌作为一种益生菌，在医学和食品工程领域得到广泛应用。另外，肠球菌为消化道内正常存在的一类微生物，在肠黏膜具有较强的耐受和定植能力，并且是一种兼性厌氧的乳酸菌，与厌氧、培养保存条件苛刻的双歧杆菌相比，更适合于生产和应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种粪肠球菌菌株及其应用。
本发明提供的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CTB，已于2016年07月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC No.12734。粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CTB简称为粪肠球菌CTB。
本发明还保护粪肠球菌CTB的应用，为如下(a1)-(a5)中的任意一种：
(a1)生产乙醇；
(a2)生产L-乳酸；
(a3)制备内切-β-葡聚糖酶；
(a4)制备外切-β-葡聚糖酶；
(a5)制备β-葡萄糖苷酶。
本发明还保护一种生产乙醇的方法，包括如下步骤：以甘油为底物，在粪肠球菌CTB的作用下，得到乙醇。
所述方法具体可为：将粪肠球菌CTB接种于MRS培养基乙中进行培养，得到乙醇。
所述“将粪肠球菌CTB接种于MRS培养基乙”得到的初始体系的OD600nm值具体可为1.0。
所述培养的条件具体可为：37℃、150rpm厌氧条件下震荡培养30h。
所述方法还包括如下步骤：完成所述培养后，离心收集上清液(上清液中含有乙醇)。
所述方法中，所述粪肠球菌CTB具体以种子液的形式接种至MRS培养基乙。
所述种子液与MRS培养基乙的体积比具体可为1∶20。
所述种子液的制备方法具体为：将粪肠球菌CTB接种于MRS培养基甲，37℃、150rpm震荡培养8-10h，得到种子液。
所述MRS培养基乙由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度如下：蛋白陈10.0g/L，牛肉粉5.0g/L，酵母粉4.0g/L，甘油20.0g/L，吐温801.0mL/L，磷酸氢二钾2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L；所述溶剂为水。
本发明还保护一种生产L-乳酸的方法，包括如下步骤：以葡萄糖为底物，在所述粪肠球菌CTB的作用下，得到L-乳酸。
所述方法具体可为：将粪肠球菌CTB接种于培养基C中进行培养，得到L-乳酸。
所述“将粪肠球菌CTB接种于培养基C”得到的初始体系的OD600nm值具体可为1.0。
所述培养的条件具体可为：37℃、150rpm厌氧条件下震荡培养30h。
所述方法还包括如下步骤：完成所述培养后，离心收集上清液(上清液中含有L-乳酸)。
所述方法中，所述粪肠球菌CTB具体以种子液的形式接种至培养基C。
所述种子液与培养基C的体积比具体可为1∶20。
所述种子液的制备方法具体为：将粪肠球菌CTB接种于MRS培养基甲，37℃、150rpm震荡培养8-10h，得到种子液。
所述培养基C由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度如下：葡萄糖50g/L，碳酸钙30g/L，酵母粉10g/L；所述溶剂为水。
本发明还保护一种生产L-乳酸的方法，包括如下步骤：以纤维素为底物，在所述粪肠球菌CTB的作用下，得到L-乳酸。
所述方法具体可为：将粪肠球菌CTB接种于MRS培养基丙中进行培养，得到L-乳酸。
所述“将粪肠球菌CTB接种于MRS培养基丙”得到的初始体系的OD600nm值具体可为1.0。
所述培养的条件具体可为：37℃、150rpm厌氧条件下震荡培养120h。
所述方法还包括如下步骤：完成所述培养后，离心收集上清液(上清液中含有L-乳酸)。
所述方法中，所述粪肠球菌CTB具体以种子液的形式接种至MRS培养基丙。
所述种子液与MRS培养基丙的体积比具体可为1∶20。
所述种子液的制备方法具体为：将粪肠球菌CTB接种于MRS培养基甲，37℃、150rpm震荡培养8-10h，得到种子液。
所述MRS培养基丙由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度如下：蛋白陈10.0g/L，牛肉粉5.0g/L，酵母粉4.0g/L，纤维素20.0g/L，吐温80 1.0mL/L，磷酸氢二钾2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L；所述溶剂为水。
本发明还保护一种生产L-乳酸的方法，包括如下步骤：以未处理的玉米秸秆为底物，在所述粪肠球菌CTB的作用下，得到L-乳酸。
所述方法具体可为：将粪肠球菌CTB接种于MRS培养基丁中进行培养，得到L-乳酸。
所述“将粪肠球菌CTB接种于MRS培养基丁”得到的初始体系的OD600nm值具体可为1.0。
所述培养的条件具体可为：37℃、150rpm厌氧条件下震荡培养120h。
所述方法还包括如下步骤：完成所述培养后，离心收集上清液(上清液中含有L-乳酸)。
所述方法中，所述粪肠球菌CTB具体以种子液的形式接种至MRS培养基丁。
所述种子液与MRS培养基丁的体积比具体可为1∶20。
所述种子液的制备方法具体为：将粪肠球菌CTB接种于MRS培养基甲，37℃、150rpm震荡培养8-10h，得到种子液。
所述MRS培养基丁由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度如下：蛋白陈10.0g/L，牛肉粉5.0g/L，酵母粉4.0g/L，未处理的玉米秸秆20.0g/L，吐温801.0mL/L，磷酸氢二钾2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L；所述溶剂为水。
本发明还保护一种产品，活性成分为粪肠球菌CTB，所述产品的用途为如下(a1)-(a5)中的任意一种：
(a1)生产乙醇；
(a2)生产L-乳酸；
(a3)制备内切-β-葡聚糖酶；
(a4)制备外切-β-葡聚糖酶；
(a5)制备β-葡萄糖苷酶。
本发明还保护粪肠球菌CTB的发酵产物。
所述发酵产物的制备方法如下：培养权利粪肠球菌CTB，得到发酵产物。
所述方法具体可为：将粪肠球菌CTB接种于MRS培养基甲中进行培养，得到发酵产物。
所述“将粪肠球菌CTB接种于MRS培养基甲”得到的初始体系的OD600nm值具体可为1.0。
所述培养的条件具体可为：37℃、150rp震荡培养24h。
所述方法还包括如下步骤：完成所述培养后，离心收集上清液(上清液中含有发酵产物)。
所述方法中，所述粪肠球菌CTB具体以种子液的形式接种至MRS培养基甲。
所述种子液与MRS培养基丁的体积比具体可为1∶20。
所述种子液的制备方法具体为：将粪肠球菌CTB接种于MRS培养基甲，37℃、150rpm震荡培养8-10h，得到种子液。
本发明还保护所述发酵产物的应用，为如下(c1)或(c2)或(c3)：
(c1)内切-β-葡聚糖酶；
(c2)外切-β-葡聚糖酶；
(c3)β-葡萄糖苷酶。
本发明还保护一种产品，活性成分为粪肠球菌CTB的发酵产物，所述产品的用途为如下(c1)或(c2)或(c3)：
(c1)内切-β-葡聚糖酶；
(c2)外切-β-葡聚糖酶；
(c3)β-葡萄糖苷酶。
以上任一所述所述MRS培养基甲由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度如下：蛋白陈10.0g/L，牛肉粉5.0g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐温80 1.0mL/L，磷酸氢二钾2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L；所述溶剂为水。
本发明提供了一种粪肠球菌CTB。粪肠球菌CTB具备如下优点：(1)可以直接利用甘油合成乙醇，在未进行任何条件优化的前提下，20g/L底物浓度下，乙醇产量为2g/L。(2)以葡萄糖为底物产L-乳酸，且光学纯度达到100％，在50g/L底物浓度下，L-乳酸产量超过49.8g/L，转化率超过99％。(3)能直接利用纤维素或玉米秸秆产L-乳酸，且光学纯度达到100％，在未进行任何条件优化的前提下，20g/L底物浓度下，L-乳酸产量达10-12g/L。(4)生长和产纤维素酶的pH值范围广，在pH3.8到10.8内有较好的生长且纤维素酶活力谱宽，因此，所产纤维素酶可应用于酸性、中性和碱性等不同pH值环境的行业。(5)具有一定的耐盐性，扩展了其应用范围。粪肠球菌CTB可以利用廉价原料玉米秸秆、沙柳和生物柴油行业副产物甘油等直接生产L-乳酸和乙醇，降低了原料成本，减少原料预处理成本，本发明为大宗化学品L-乳酸和乙醇的廉价生产、青贮饲料和微生物饲料的开发和生产提供了优良菌种。
附图说明
图1为初筛菌种平板。
图2为复筛滤纸降解观察图。
图3为菌体透射电镜观察图。
图4为不同pH值条件下纤维素酶活力检测结果。
图5为耐盐性检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下实施例中的好氧条件是正常的有氧培养，厌氧条件是通过将培养瓶中原有空气置换出来，充入氮气，然后利用封闭的培养瓶进行培养来实现的。
矿物质溶液I：2.25％(质量百分数)KH2PO4水溶液，充CO2，121℃灭菌15min。
矿物质溶液II：NaCl 5.63g，(NH4)2SO4 5.63g，MgCl2·6H2O 0.53g，CaCl2·2H2O0.41g，MnCl2·4H2O 0.172g，FeSO4·7H2O 0.125g，ZnCl2 0.059g，CoCl2·6H2O 0.013g，加蒸馏水至500mL。
8％(质量百分数)Na2CO3水溶液经过充CO2，121℃灭菌15min。
挥发性脂肪混合液(5×VFA混合液)：于30mL蒸馏水中分别加入异丁酸、异戊酸、戊酸和2-甲基丁酸各1mL，充CO2，用10mol/L的NaOH调pH值至7.0，然后用蒸馏水稀释至100mL，4℃冷藏保存。
VFA混合液(临用时配制)：取5×VFA混合液，用蒸馏水稀释至5倍体积，充CO2，121℃灭菌15min。
维生素混合液：硫胺素20mg，泛酸钙20mg，烟酸20mg，核黄素20mg，吡哆醇20mg，对氨基苯甲酸1mg，生物素0.5mg，维生素B12 0.2mg，叶酸0.125mg，四氢叶酸0.125mg，加蒸馏水至1L，用0.22μm滤膜过滤除菌，然后贮存于已灭菌且充有CO2的玻璃瓶中低温避光保存。
基础培养基A：矿物质溶液II 80mL，0.2％刃天青1mL，蒸馏水795mL，半胱氨酸盐酸盐1.5g，羧甲基纤维素钠10g，琼脂粉15g，充CO2至培养液无色。
基础培养基：NaHCO3 5.0g，蛋白胨1.0g，酵母粉1.0g，加蒸馏水至500mL。
矿物质溶液A：KH2PO4 0.3g，(NH4)2SO4 0.3g，NaCl 0.6g，CaCl2·2H2O 0.04g，MgSO4·7H2O 0.058g，加蒸馏水至100mL。
矿物质溶液B：K2HPO4·3H2O 0.396g，加蒸馏水至100mL。
培养基B：基础培养基500mL，无细胞瘤胃液170mL，矿物质溶液A 165mL，矿物 质溶液B 165mL，半胱胺酸盐酸盐1.5g，0.1％刃天青1.0mL，纤维二糖10g，通CO2至培养基颜色由红色变为淡黄色，121℃灭菌15min。
基础培养液B：矿物质溶液II 80mL，0.2％刃天青1mL，蒸馏水795mL，半胱氨酸盐酸盐1.5g，充CO2至培养液无色。
MRS培养基甲：蛋白陈10.0g，牛肉粉5.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0mL，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，加蒸馏水至1000mL。
MRS培养基乙：将MRS培养基甲中的葡萄糖替换为等质量的甘油。
MRS培养基丙：将MRS培养基甲中的葡萄糖替换为等质量的纤维素。
MRS培养基丁：将MRS培养基甲中的葡萄糖替换为等质量的未处理的玉米秸秆。
培养基C：葡萄糖50g，碳酸钙30g，酵母粉10g，加蒸馏水至1000mL。
菌株CTB374-1：参考文献：刘占英，侯先志，刘玉承，等.一株分解纤维素的肠球菌的分离鉴定[J].内蒙古大学学报(自然科学版)，2008，39(02)：166-171.；公众可以从内蒙古工业大学获得。
L-(+)-乳酸：sigma公司，货号：71718。
D-乳酸钠：sigma公司，货号：71716。
微晶纤维素：sigma公司，货号：11365。
羧甲基纤维素钠：sigma公司，货号：21902。
水杨苷：sigma公司，货号：S0625。
实施例1、样本采集及菌种筛选
一、样本采集
样品采自装有永久瘤胃瘘管的内蒙古地区绵羊。绵羊日粮精粗比为3∶7，饲料配方为(质量百分比)：混合牧草70％，玉米11.20％，麸皮6.10％，豆粕10.20％，石粉1.25％，磷酸氢钙0.25％，食盐0.50％，复合添加剂0.50％，合计，100％。
1、从绵羊瘤胃中取得瘤胃液，四层纱布过滤去掉残渣，得到滤液。
2、将步骤1得到的滤液厌氧条件下经梯度稀释(梯度设置为：10-5、10-6、10-7、10-8)后得到各稀释液，作为菌种来源。
3、将步骤1得到的滤液进行两次冷冻离心，第一次离心时离心机转速为5000r/min，离心时间为15min；第二次离心时离心机转速为15000r/min，离心时间为30min。取两次离心后上清液(无细胞瘤胃液)置于-20℃冰箱保存备用，用作培养基中的成分。
二、菌种初筛
1、将基础培养基A分装于Hungate滚管中(每管8mL)，121℃灭菌15min。待装 有基础培养基A的Hungate滚管冷却至50℃左右，向Hungate滚管中注入0.4mL矿物质溶液I、0.4mL 8％(质量百分数)Na2CO3水溶液、0.3mL VFA混合液、0.1mL维生素混合液和0.1mL无细胞瘤胃液。
2、用1mL注射器吸取步骤一的2中各稀释液各0.1mL，分别接种到步骤1的Hungate滚管中培养，39℃培养约24h-36h至滚管中菌落长全。
挑选菌落密度适中的Hungate滚管用作菌种分离纯化，从分离滚管中选择具有透明圈且透明圈直径/菌落直径值大的菌落(以透明圈直径/菌落直径值的大小来衡量其羧甲基纤维素降解能力，透明圈直径/菌落直径数值越大说明该菌种对羧甲基纤维素降解能力越强)，挑取一半菌落进行革兰氏染色并镜检，另一半接种到培养基B中进行培养，将培养基B中培养的菌液保存。部分初筛结果如图1所示。图1中，培养平板上可观察到具有透明圈的单菌落，将单菌落作为初筛得到的菌种。
三、菌种复筛
1、向150mL容量的西林瓶中装入5片1cm×5em大小的Whatman No.1滤纸后，将50mL基础培养液B加入西林瓶中，121℃灭菌15min。待基础培养液B冷却至室温后，向西林瓶中注入2.4mL矿物质溶液I、2.4mL 8％(质量百分数)Na2CO3水溶液、1.8mLVFA混合液、0.6mL维生素混合液和0.6mL无细胞瘤胃液。
2、将步骤二初筛得到的单一菌种接种到步骤1的西林瓶中，并做不接菌的空白对照，每组3个平行样。将对照瓶和样品瓶同时在39℃培养，培养1-2周后观察其对滤纸的降解能力，选取降解能力强的菌种。部分复筛结果如图2所示，图2A为空白对照的西林瓶，图2B为接种了菌种的西林瓶，接种了菌种后的滤纸条出现明显孔洞、分层、边缘溶解等现象，表明该菌种能降解滤纸。选取对滤纸降解速度最快，且将滤纸降解的程度最大的菌种，将其命名为CTB，作为复筛得到的菌种。
将上述过程中得到的另一株菌(即菌株CTB374-1)，作为对照菌。
四、菌株CTB的形态鉴定及分子鉴定
1、菌株CTB在培养基A上呈圆形菌落，白色，表面光滑，有光泽，边缘整齐，革兰氏染色阳性。用透射电镜观察菌体形态，结果如图3所示(透射电镜放大倍数为3000倍)。
2、将菌株CTB的16S rDNA序列进行扩增并测序，测序结果如序列表的序列1所示。
经过鉴定，可以确定菌株CTB属于粪肠球菌，因此重新将其命名为粪肠球菌CTB。
五、粪肠球菌CTB的保藏
本发明提供的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CTB，已于2016年07月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC No.12734。粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CTB简称为粪肠球菌CTB。
实施例2、粪肠球菌CTB的性质及应用
一、以葡萄糖为底物生产L-乳酸
待测菌株为：粪肠球菌CTB、菌株CTB374-1。
1、将待测菌株接种于MRS培养基甲，37℃、150rpm震荡培养8-10h，得到种子液。
2、将步骤1得到的1.5mL种子液接种于30mL的培养基C(培养体系的初始OD600nm为1.0)，37℃，150rpm厌氧条件下震荡培养30h，将发酵液离心取上清液。
3、取步骤2得到的上清液，测定L-乳酸浓度及其光学纯度。
光学纯L-乳酸浓度测定方法：采用装有手性柱(MCI GEL CRS10W)的高效液相色谱(Waters e2695/2414)测定。具体检测条件为：紫外检测器254nm，流动相为2mM硫酸铜水溶液，进样体积为20μL，流速为0.5mL/min，柱温为25℃。
检测L-乳酸的标准品采用L-(+)-乳酸，
检测D-乳酸的标准品采用D-乳酸钠。
L-乳酸标准品的出峰时间为15.137min，D-乳酸标准品的出峰时间为12.050min。在相同条件下出峰位置为±0.05min以内，可以认定为同一物质。
L-乳酸光学纯度定义如下：L-乳酸浓度/(L-乳酸浓度+D-乳酸浓度)×100％。
结果表明，以50g/L葡萄糖为底物时，培养条件和培养基未优化情况下，粪肠球菌CTB发酵液离心得到的上清液中的L-乳酸浓度为49.8g/L，且光学纯度达到100％，菌株CTB374-1发酵液离心得到的上清液中的L-乳酸浓度仅为20g/L。
二、以纤维素为底物生产L-乳酸
待测菌株为：粪肠球菌CTB、菌株CTB374-1。
1、将待测菌株接种于MRS培养基甲，37℃、150rpm震荡培养8-10h，得到种子液。
2、将步骤1得到的1.5mL种子液接种于30mL的MRS培养基丙(培养体系的初始OD600nm为1.0)，37℃，150rpm厌氧条件下震荡培养120h，将发酵液离心取上清液。
3、取步骤2得到的上清液，测定L-乳酸浓度及其光学纯度。
光学纯L-乳酸浓度测定方法：采用装有手性柱(MCI GEL CRS10W)的高效液相色谱(Waters e2695/2414)测定。具体检测条件为：紫外检测器254nm，流动相为2mM硫酸铜水溶液，进样体积为20μL，流速为0.5mL/min，柱温为25℃。
检测L-乳酸的标准品采用L-(+)-乳酸，
检测D-乳酸的标准品采用D-乳酸钠。
L-乳酸标准品的出峰时间为15.137min，D-乳酸标准品的出峰时间为12.050min。在相同条件下出峰位置为±0.05min以内，可以认定为同一物质。
L-乳酸光学纯度定义如下：L-乳酸浓度/(L-乳酸浓度+D-乳酸浓度)×100％。
结果表明，以20g/L纤维素为底物时，培养条件和培养基未优化及未调酸情况下，粪肠球菌CTB发酵液离心得到的上清液中的L-乳酸浓度为12g/L，且光学纯度达到100％，菌株CTB374-1发酵液离心得到的上清液中的L-乳酸浓度仅为1.13g/L。
三、以未预处理的玉米秸秆为底物生产L-乳酸
待测菌株为：粪肠球菌CTB、菌株CTB374-1。
使用MRS培养基丁替代步骤二的MRS培养基丙，进行步骤二的实验。
结果表明，以20g/L未预处理玉米秸秆为底物时，培养条件和培养基未优化及未调酸情况下，粪肠球菌CTB发酵液离心得到的上清液中的L-乳酸浓度为10g/L，且光学纯度达到100％，菌株CTB374-1发酵液离心得到的上清液中的L-乳酸浓度仅为1.17g/L。
四、生产乙醇
1、将粪肠球菌CTB接种于MRS培养基甲，37℃，150rpm震荡培养8-10h，得到种子液。
2、将步骤1得到的1.5mL种子液接种于30mL MRS培养基乙(培养体系的初始OD600nm为1.0)，37℃、150rpm厌氧条件下震荡培养30h，将发酵液离心取上清液。
3、取步骤2得到的上清液，测定上清中乙醇浓度。
采用Waters e2695/2414型高效液相色谱测定乙醇含量。色谱分离柱为AminexHPX-87H(300mm x 7.8mm id，9μm)柱；RI示差检测器；流动相为5mmoL的硫酸水溶液；进样体积为20μL；流动相流速为0.5mL/min；柱温为50℃。
采用无水乙醇作为标准品。
乙醇标准品的出峰时间为30.629min。在相同条件下出峰位置为±0.05min以内，可以认定为同一物质。
统计结果表明，粪肠球菌CTB可以直接利用甘油合成乙醇，在未进行任何条件优化的前提下，20g/L底物浓度下，粪肠球菌CTB发酵液离心得到的上清液中乙醇的浓度为2g/L。
五、不同pH条件下的纤维素酶活力
1、将粪肠球菌CTB接种于MRS培养基甲，37℃、150rpm震荡培养8-10h，得到种子液。
2、将步骤1得到的1.5mL种子液接种于30mL MRS培养基甲(培养体系的初始OD600nm为1.0)，37℃、150rpm好氧条件下震荡培养24h，将发酵液1200r/min在-4℃离心，取上清液(粗酶液)。
3、外切-β-葡聚糖酶活力测定：底物溶液为0.5％(质量分数)微晶纤维素水溶液。在试管中加入1.5mL的不同pH值(pH3.8、pH5.8、pH6.8、pH7.0、pH8.8、pH10.8)的0.1mol/L磷酸钠缓冲溶液，然后加入底物溶液2.0mL，再加入1mL步骤2得到的粗酶液，将试管放入50℃水浴中水浴60min，然后立即加入1.0mLDNS溶液，然后沸水浴中煮沸5min，取出后用循环水冷却至室温，加蒸馏水16mL，上下摇匀。测定530nm吸光度值。设置用等体积的水代替粗酶液的空白样品。
4、内切-β-葡聚糖酶活力测定：底物溶液为0.5％(质量分数)羧甲基纤维素钠水溶液。在试管中加入1.5mL不同pH值(pH3.8、pH5.8、pH6.8、pH7.0、pH8.8、pH10.8)的0.1mol/L磷酸钠缓冲溶液，然后加入底物溶液2.0mL，再加入1mL步骤2得到的粗酶液，将试管放入50℃水浴中水浴30min，然后立即加入1.0mLDNS溶液，沸水浴中煮沸5min，取出后用循环水冷却至室温，加蒸馏水16mL，上下摇匀。测定530nm吸光度值。设置用等体积的水代替粗酶液的空白样品。
5、β-葡萄糖苷酶活力测定：底物溶液为0.5％(质量分数)水杨苷水溶液。在试管中加入1.5mL的不同pH值(pH3.8、pH5.8、pH6.8、pH7.0、pH8.8、pH10.8)的0.1mol/L磷酸钠缓冲溶液，然后加入底物溶液2.0mL，再加入1mL步骤2得到的粗酶液，将试管放入50℃水浴中水浴10min，然后立即加入1.0mLDNS溶液，然后沸水浴中煮沸5min，取出后用循环水冷却至室温，加蒸馏水16mL，上下摇匀。测定530nm吸光度值。设置用等体积的水代替粗酶液的空白样品。
6、将步骤1-5中的好氧条件改为厌氧条件，重复步骤1-5进行实验。
7、根据步骤3-6的结果计算酶活力，计算方法如下：
采用不同浓度的葡萄糖制作标准曲线，由测得样品的吸光度值对应出葡萄糖浓度，再减去空白样品中葡萄糖浓度。然后计算单位时间、单位体积发酵液产生的葡萄糖质量。一个酶活力定义为每分钟每毫升粗酶液催化生成的葡萄糖微克数。
结果如图4所示。图4A为外切-β-葡聚糖酶活力测定结果，图4B为内切-β-葡聚糖酶活力测定结果，图4c为β-葡萄糖苷酶活力测定结果。结果显示，三种纤维素酶活力分别达到28μg/mL·min、25μg/mL·min、73μg/mL·min。粪肠球菌CTB生长和产纤维素酶的pH值范围广，在pH3.8到10.8内有较好的生长且纤维素酶活力宽。
六、耐盐性
1、将粪肠球菌CTB接种于MRS培养基甲，37℃培养8-10h，得到种子液。
2、将步骤1得到的1.5mL种子液接种于30mL培养基C，分别在培养基中添加1％、2％、3％、4％和5％(质量分数)的氯化钠，37℃、150rpm震荡培养。测定0小时时培养液的OD600nm值，并每隔6h测定一次，根据吸光度绘制不同盐浓度下的生长曲线。
结果如图5所示。图5中，横坐标为时间(单位为小时)。纵坐标为OD600nm的吸光度值。结果显示，在1％-4％盐浓度范围内，生长曲线基本没有变化，说明粪肠球菌CTB具有一定的耐盐性。

Claims (9)

1.粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CTB，其保藏编号为CGMCC No.12734。
2.权利要求1所述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CTB的应用，为如下(a1)-(a5)中的任意一种：
(a1)生产乙醇；
(a2)生产L-乳酸；
(a3)制备内切-β-葡聚糖酶；
(a4)制备外切-β-葡聚糖酶；
(a5)制备β-葡萄糖苷酶。
3.一种生产乙醇的方法，包括如下步骤：以甘油为底物，在权利要求1所述粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CTB的作用下，得到乙醇。
4.一种生产L-乳酸的方法，包括如下步骤(b1)或(b2)或(b3)：
(b1)以葡萄糖为底物，在权利要求1所述粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CTB的作用下，得到L-乳酸；
(b2)以纤维素为底物，在权利要求1所述粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CTB的作用下，得到L-乳酸；
(b3)以玉米秸秆为底物，在权利要求1所述粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CTB的作用下，得到L-乳酸。
5.一种产品，活性成分为权利要求1所述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CTB，所述产品的用途为如下(a1)-(a5)中的任意一种：
(a1)生产乙醇；
(a2)生产L-乳酸；
(a3)制备内切-β-葡聚糖酶；
(a4)制备外切-β-葡聚糖酶；
(a5)制备β-葡萄糖苷酶。
6.权利要求1所述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CTB的发酵产物。
7.如权利要求6所述的发酵产物，其特征在于：所述发酵产物的制备方法如下：培养权利要求1所述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CTB，得到发酵产物。
8.权利要求6或7所述的发酵产物的应用，为如下(c1)或(c2)或(c3)：
(c1)内切-β-葡聚糖酶；
(c2)外切-β-葡聚糖酶；
(c3)β-葡萄糖苷酶。
9.一种产品，活性成分为权利要求1所述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CTB的发酵产物，所述产品的用途为如下(c1)或(c2)或(c3)：
(c1)内切-β-葡聚糖酶；
(c2)外切-β-葡聚糖酶；
(c3)β-葡萄糖苷酶。
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